CN104141007B - miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：选取待测水稻和对照水稻，选取的所述对照水稻为未感染白叶枯病但与待测水稻在相同条件下栽培的水稻；分别分离所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因；分别检测所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因中的miRNA393a基因的表达量，所述miRNA393a基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；根据所述待测水稻和所述对照水稻中的miRNA393a基因的表达量，判断实验是否成功，若成功，进一步判定所述待测植株是否感染白叶枯病。本发明提供的预测方法获得了成功，可以在水稻白叶枯病症出现前数天实现准确预报，为早防早治赢得了时间，减少了白叶枯病对水稻造成的损失。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法。
背景技术
水稻是我国主要粮食作物，白叶枯病是水稻两大主要病害之一，属世界性病害，亚洲稻区发生尤重。白叶枯病发病率高、传染快，发病稻田减产20-30％，甚至50％。与大部分病害一样，白叶枯病发病早期防治效果较佳。发病中后期，病菌已大量繁殖，已对水稻造成了伤害，防治效果较差。由此可见，早期预报是水稻白叶枯病预防的关键所在。
传统水稻白叶枯病预报主要依据气候、天气、品种抗性、氮肥施用情况、以及病害历史等进行推测，也可依据田间水稻白叶枯病症状表现，对后期病情发展进行预报。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
根据天气、气候、品种抗性、栽培现状和历史等进行的预报结果是很模糊的，可说明在一定区域与时间范围内病害发生的概率，但不能预报病害发生的具体时间与地点，预报结果的可应用性较差。例如，高温高湿常作为水稻白叶枯病的流行预报的气候条件，但不能确定高温高湿下病害是否一定出现、在那块田出现、在那天出现。由于以上的不确定性，农民不能决定是否开始防治白叶枯、对哪块田进行防治、以及何时防治。同时，病症出现表明白叶枯病已进入中后期，病菌已大量繁殖，白叶枯病流行已难以避免，使得利用病症调查进行预报的工作也无太大实际意义。
发明内容
为了解决现有技术中水稻白叶枯病预报不及时、不准确的缺点，本发明实施例提供了一种miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法。所述技术方案如下：
选取9311水稻品种作为待测水稻和对照水稻；
栽培所述待测水稻和所述对照水稻，对照水稻是指通过保护性技术措施和白叶枯病防治措施，除保护性栽培措施和防治白叶枯病外，对照水稻与待测水稻的栽培条件保持一致；
分别分离所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因；
分别检测所述待测水稻和所述对照水稻中的所述总miRNA基因中的miRNA393a基因的表达量，所述miRNA393a基因的序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；
根据所述待测水稻和所述对照水稻中的miRNA393a基因的表达量，判定实验是否成功，若成功，则进一步判定所述待测植株是否感染白叶枯病，其中，所述判定实验是否成功的方法为：若所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量最大值与表达量最小值的比值小于1.5，则实验成功；若所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量最大值与表达量最小值的比值大于等于1.5，则实验不成功；
判定所述待测植株是否感染白叶枯病的方法为：若所述待测水稻的miRNA393a基因的表达量小于2倍所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量，则所述待测水稻未感病；若所述待测水稻的miRNA393a基因的表达量大于或等于2倍的所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量，则所述待测水稻感病。
具体地，所述栽培所述待测水稻和所述对照水稻时，所述对照水稻在栽培时采用保护性栽培措施并防治白叶枯病，除所述保护性栽培措施和防治白叶枯病外，所述对照水稻与所述待测水稻的栽培条件保持一致。
进一步地，所述保护性栽培措施包括对土壤隔离、水源隔离和空间隔离。
具体地，在上午8：55～9：05利用所述待测水稻和所述对照水稻的相同叶片的相同部位进行所述总miRNA基因的分离。
具体地，采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量。
进一步地，所述实时定量PCR方法的前处理步骤包括：
利用分光光度计测定并获得分离的所述总miRNA基因的浓度；
向所述总miRNA基因中加入外源参考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源参考miRNA基因的加入量为所述总miRNA基因质量的0.05％，所述外源参考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
将所述总miRNA基因和所述外源参考miRNA基因的5’端与3’端连接，得到环化的所述总miRNA基因和环化的所述外源参考miRNA基因的混合液；
将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录，得到的逆转录产物用于进行所述实时定量PCR检测。
进一步地，所述采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量，包括：
将2μl所述逆转录产物、3μl浓度为1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl 50倍的ROX荧光校正染料混合均匀，得到第二混合液，将所述第二混合液在实时定量PCR仪中进行反应，所述反应共45个循环，第一个循环的程序为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，其中，66℃30秒和67℃30秒这两步在每循环一次后分别增加0.1℃和0.2℃，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，所述荧光信号的强弱用于衡量所述表达量的多少；
所述引物包括：序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA393a基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA393a基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:5所示的外源参考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID NO:6所示的外源参考miRNA基因反向引物。
进一步地，将所述总miRNA基因的5’端与3’端连接的步骤包括：
取5ng所述第一混合液、2μl 10×反应缓冲液、1μl 50mM的MnCl2、4μl 5M的甜菜碱和1μl 5u/μl的环化酶，用水补足20μl后混匀，得到第三混合液，将所述第三混合液于60℃保温15分钟后，80℃保温10分钟，使酶失活，得到所述环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液。
进一步地，将所述环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液体进行逆转录的步骤包括：
取所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液2μl、5μl浓度为1μM的逆转录引物、2μl浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DTT和20U的逆转录酶，用水补足50μl混匀后，得到第四混合液，将所述第四混合液于42℃保温2小时，75℃保温15分钟，使酶失活，得到所述逆转录产物；所述逆转录引物包括miRNA393a基因的逆转录引物和外源参考miRNA基因的逆转录引物，所述miRNA393a基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述外源参考miRNA基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法，可将miRNA393a基因的表达变化可作为水稻感染白叶病菌的标志物，用以明确待测水稻是否染病，以及明确发病的时间与田块，避免了传统病害预报的模糊性。同时，本发明的预测时间早，可在水稻感染白叶枯病24小时内作出预报。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明中未标注说明的试剂均为常用市售试剂，在大多数生物技术公司均可购买到且效果几乎无差别。
实施例
本发明实施例将9311水稻品种作为待测水稻和对照水稻，其中，待测水稻是指种植于大田正常栽培条件下，需要监控是否感染白叶枯病的水稻；对照水稻是指通过保护性技术措施和白叶枯病防治措施，确保其为没有感染白叶枯病的健康水稻，除保护性栽培措施和防治白叶枯病外，对照水稻与待测水稻的栽培条件保持一致，其中，保护性栽培措施包括土壤隔离、水源隔离和空间隔离。
种子的选取：待测水稻的种子和对照水稻的种子均收获于健康的9311水稻植株，并且种子表面无明显病虫害危害症状。
种子的前处理、播种与栽培条件：对照种子与待测种子均用浓度为70％的酒精浸泡2分钟，再用去离子水洗2次，在30℃的水中浸泡过夜，在30℃的温度下对种子进行催芽，种子出芽后播种。
从待测水稻生长的田块中取土壤，利用灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产，型号为YSQ-LS-50S11)对土壤进行高温高压消毒灭菌，消毒灭菌条件为：120℃，30分钟。消毒后的土壤作为对照水稻的种植土壤。将对照水稻在隔离条件下播种、移栽、生长于填有消毒土壤的塑料盆中，待测水稻则种植于大田环境中，栽培待测水稻和对照水稻时，除保护性栽培措施与白叶枯病防治措施外，待测水稻与待测水稻的栽培条件保持一致。
保护性栽培措施包括：(1)土壤隔离：利用盆栽，使对照水稻生长的土壤与大田土壤隔离，避免通过土壤传病感染白叶枯病；(2)水源隔离：采用自来水灌溉对照水稻，确保大田水源不进入对照水稻，避免通过水源感染白叶枯病；(3)空间隔离：对照水稻周围10米不种植其它水稻，避免与带白叶枯菌的水稻叶片摩擦感染白叶枯病。待测水稻不防治白叶枯病，除保护性栽培措施与白叶枯病防治措施外对照水稻与待测水稻的栽培条件尽可能保持一致，包括播种、移栽、施肥、防虫、防病(除白叶枯病外其它病害)等生产管理措施同时、同步进行。
具体地，在对照水稻周围10米范围内，不播种或种植其它水稻；对照水稻灌溉水采用干净的自来水；除以上条件外，对照水稻与待测水稻的其它栽培条件与普通大田常规栽培条件相同，但所有栽培措施在对照水稻与待测水稻间保持一致，如播种、移栽、施肥、防虫、防病(除白叶病外其它病害)等生产管理措施同时、同步进行。本次试验中，播种期为2010年11月27日，地点为海南琼海。
将对照水稻和待测水稻采用相同的栽培条件种植，使对照水稻和待测水稻能够在相同的条件下生长，保证对照水稻和待测水稻的表达量不受栽培条件的影响。
在需要预报白叶枯病是否发生的时期，如苗期和破口期至抽穗扬花期，在上午8：55～9：05分别取倒数第二片中部2/3的部位的叶片。每次对照水稻与待测水稻各取至少3片叶片混合，用于代表对照水稻与待测水稻的样本。所取叶片立即置于液氮中保存至总miRNA基因的提取。在本实施例中，取样时间段为2011年2月28号至当年3月3号，连续取样5天，共获得对照水稻与待测水稻各5个样本，分别编号为C1～C5和T1～T5，其中C表示Control，T表示Treatment，其中，对照水稻与待测水稻取样的时间点是一致的，对照水稻和待测水稻所选取的叶片位置也是相同的，这能够使对照水稻和待测水稻之间的生物时钟与发育状态是相同的，只有选取生物时钟与发育状态均相同的叶片才能进一步保证对照水稻和待测水稻间的miRNA表达量比较不受生物时钟与发育的影响。
分离总miRNA基因：利用miRNA基因分离试剂盒(miRNA基因分离试剂盒为市售，货号：R6727，生产公司：Omega，该试剂盒具体包括：RNA离心柱、基因组DNA去除离心柱、离心管、MCL裂解缓冲液、XD结合缓冲液、RNA洗脱液II和DEPC水)分离上述C1～C5和T1～T5水稻叶片中的总miRNA基因。
具体操作方法如下：从液氮中分别取出C1～C5和T1～T5水稻叶片样本，分别置于10个研钵中，并立即向研钵中倒入液氮，充分研磨，分别研磨可以避免交叉污染。向每个研钵中取大约100mg研磨好的粉末置于1.5ml的离心管中，加700μL的裂解液，涡旋30秒以混匀样品，55℃保温30分钟，在离心力为12000×g的室温条件下离心5分钟，得到上清液，并将上清液转移至离心柱中离心，用于去除基因组中的DNA，经12000×g室温离心2分钟，并将流出的液体转移至一个新的1.5mL的离心管中，向该流出的液体中加入该液体体积1.1倍的无水乙醇并涡旋20秒混匀，将该涡旋后的液体转移至RNA离心柱中经12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入500μL浓度为96-100％的乙醇到RNA离心柱中，再经12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入500μL XD结合缓冲液到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液，加入750μL RNA洗脱液II到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液，再加入750μLRNA洗脱液II到RNA离心柱中，12000×g室温离心1分钟，弃离心液，将RNA离心柱在大于12000×g的最大速度下，室温离心2分钟，向RNA离心柱中加入30-50μL DEPC水，室温下放置5分钟后，在大于12000×g的最大速度下，室温离心1分钟，离心获得的液体即为含有总miRNA基因的溶液，将该溶液保存于-70℃备用。
实时定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)方法的前处理步骤包括：
总miRNA基因的定量：利用分光光度计(分光光度计由美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中RNA定量程序，测定并获得分离的总miRNA基因的浓度，根据浓度与体积计算总miRNA基因的质量。
向分离的总miRNA基因中加入外源参考miRNA基因，得到第一混合液：外源参考miRNA基因的加入量为分离的总miRNA基因质量的0.05％，外源参考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其由上海吉玛制药技术有限公司合成。
miRNA基因环化：取含有约5ng总miRNA基因的第一混合液、2μl 10×反应缓冲液、1μl 50mM的MnCl2、4μl 5M的甜菜碱和1μl 5u/μl的环化酶，用水补足20μl后混匀，得到第三混合液；将第三混合液于60℃保温15分钟后，80℃保温10分钟，使酶失活。将总miRNA基因和外源参考miRNA基因的5’端与3’端连接，获得环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液，该混合液用于滚环逆转录。其中，环化酶由美国Epicentre公司生产，货号为CL9021K。随该酶一起提供的还有：10×反应缓冲液、50mM的MnCl2、5M的甜菜碱和无酶水。
环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液的逆转录：取环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液2μl、5μl浓度为1μM的逆转录引物、2μl浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DTT、20U的逆转录酶(美国Invitrigen公司生产，货号为18064-014)和5μl 10×的逆转录缓冲液(随逆转录酶一起提供)，用水补足50μl混匀后，42℃保温2小时，75℃保温15分钟，使酶失活。该逆转录引物包括miRNA393a基因的逆转录引物和外源参考miRNA基因的逆转录引物，miRNA393a基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；据此设计的miRNA393a基因的逆转录引物如序列表中SEQ ID NO:7所示；外源参考miRNA基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，上述逆转录引物均由美国Invitrigen公司合成。其中，逆转录包括两类，一类为目标基因，即miRNA393a基因的逆转录，另一类为外源参考miRNA基因(外源参考miRNA基因命名为ECK基因)的逆转录，两个逆转录过程平行进行，且所有反应成份与条件均相同，仅逆转录引物不一致。对于miRNA393a基因的逆转录反应来说，所设计的逆转录引物跨过了miRNA393a基因环化时的连接接点，在逆转录时，仅环化成功的miRNA393a基因被逆转录。另外，miRNA393家族还有miRNA393b成员，且前期研究发现：感染白叶枯病24小时内，miRNA393b表达量较大但在对照水稻与待测水稻间变化不大，因此，检测时需要区分miRNA393a与miRNA393b的表达。miRNA393b又分为miRNA393b-3p和miRNA393b-5p两种形式，其中，miRNA393b-3p与miRNA393a序列差异很大，不会与miRNA393a的逆转录引物配对而被逆转录。miRNA393b-5p与miRNA393a比较，miRNA393b-5p在3’的最后位置多了一个碱基。因此，所设计的miRNA393a的逆转录引物的最后一个碱基(决定引物特异性的关键碱基)与miRNA393a的最后一个碱基配对，则miRNA393a的逆转录引物的倒数第二碱基无法与miRNA393b-5p的最后一个碱基配对，使miRNA393b-5p难以逆转录，降低了miRNA393b-5p对结果的干扰。
实时定量PCR方法检测逆转录产物的表达量：实时定量PCR同样包括两类，一类为目标基因，即miRNA393a基因的实时定量，另一类为外源参考miRNA基因的实时定量，二者平行进行，所有反应成份与条件均相同，仅引物不相同。引物包括：miRNA393a基因正向引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；miRNA393a基因反向引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，其中设计的miRNA393a的反向引物的倒数第二个碱基(决定引物特异性的重要碱基)不能与miRNA393家族中的miRNA393b-5p的最后一个碱基配对，使miRNA393b-5p难以被PCR扩增，进一步降低了miRNA393b-5p对结果的干扰。另外，miRNA393a的正向引物与反向引物均不能与miRNA393b-3p配对，因此，miRNA393b-3p不会被扩增。引物还包括：外源参考miRNA基因正向引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；外源参考miRNA基因反向引物序列为如序列表中SEQ ID NO:6所示。实时定量PCR引物均由美国Invitrigen公司合成。
实时定量PCR方法的具体步骤如下：取2μl上述逆转录产物、3μl浓度为1μM的引物(这里的引物指正向引物和反向引物等摩尔比混合物，即指序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA393a基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA393a基因反向引物的等摩尔比的混合物，或者指序列如序列表中SEQ ID NO:5所示的外源参考miRNA基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID NO:6所示的外源参考miRNA基因反向引物的等摩尔比的混合物)、10μl日本Toyobo公司生产的定量PCR混合物(货号为QPS-201)和0.4μl 50倍的ROX荧光校正染料(由日本Toyobo公司生产，并且随QPS-201一起提供)混合均匀，得到第二混合液，将该第二混合液在ABI StepOne实时定量PCR仪中按如下程序进行实时定量PCR检测：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45个循环，其中，66℃30秒和67℃30秒在每循环一次后分别增加0.1℃和0.2℃，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，荧光信号的强弱用于衡量表达量的多少。实时定量的结果由Microsoft Excel 2010进行处理，数据处理时以外源参考miRNA基因为miRNA393a表达分析的参考基因。结果见表1：
表1 miRNA393a基因在对照水稻与待测水稻间的相对表达量
注：表达量*＝2(CT(miRNA393a)-CT(ECK))，其中，CT(miRNA393a)和CT(ECK)分别为实时定量PCR反应中获得的miRNA393a基因和外源参考miRNA基因的CT值。
由表1数据可知，对照水稻在检测时间段中的5个时间点的表达量最大值为0.52，表达量最小值为0.47，二者之间的比值为1.11，该比值小于1.5。表明本次实验中，无白叶枯病或其它因素影响对照水稻miRNA393a基因的表达，实验条件控制较好，实验是成功的，实验结果可用于水稻白叶枯病的预报。在待测水稻中，从2月28号到3月1号这三天，miRNA393a基因的表达量相对恒定，进一步说明本次实验的条件控制较好。到3月2号，miRNA393a基因在待测水稻中的表达量比对照水稻高出3.60倍，这种表达变化在3月4号得以维持，表明所检测到的待测水稻miRNA393a基因表达变化不太可能是检测失误等因素造成。可以判断，待测水稻很可能感染上白叶枯菌，需要药物防治。据此进一步预测，在该地区种植的其它水稻也有近期感染白叶枯病的危险，需要防治。至3月6号开始，待测水稻开始出现白叶枯病症状，至3月12号，症状已经相当明显。同时，当地其它水稻品种也出现了严重的白叶枯病与细菌性条斑病的混合危害，部分田块出现绝收的情况。由此可见，本发明提供的miRNA393a基因的表达量可作为水稻感染白叶菌的早期(24小时内)标志物，可用于明确待测水稻是否染病，以及明确白叶枯发病时间与地点，避免了传统病害预报的模糊性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.miRNA393a基因预报水稻白叶枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
选取9311水稻品种作为待测水稻和对照水稻；
栽培所述待测水稻和所述对照水稻，对照水稻是指通过保护性技术措施和白叶枯病防治措施，除保护性栽培措施和防治白叶枯病外，对照水稻与待测水稻的栽培条件保持一致；
分别分离所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因；
分别检测所述待测水稻和所述对照水稻中的所述总miRNA基因中的miRNA393a基因的表达量，所述miRNA393a基因的序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；
根据所述待测水稻和所述对照水稻中的miRNA393a基因的表达量，判定实验是否成功，若成功，则进一步判断所述待测植株是否感染白叶枯病，其中，所述判定实验是否成功的方法为：若所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量最大值与表达量最小值的比值小于1.5，则实验成功；若所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量最大值与表达量最小值的比值大于等于1.5，则实验不成功；
判定所述待测植株是否感染白叶枯病的方法为：若所述待测水稻的miRNA393a基因的表达量小于2倍所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量，则所述待测水稻未感病；若所述待测水稻的miRNA393a基因的表达量大于或等于2倍的所述对照水稻的miRNA393a基因的表达量，则所述待测水稻感病。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待测水稻和所述对照水稻时，所述对照水稻在栽培时采用保护性栽培措施并防治白叶枯病，除所述保护性栽培措施和防治白叶枯病外，所述对照水稻与所述待测水稻的栽培条件保持一致。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述保护性栽培措施包括土壤隔离、水源隔离和空间隔离。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8：55～9：05利用所述待测水稻和所述对照水稻的相同叶片的相同部位进行所述总miRNA基因的分离。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时定量PCR方法的前处理步骤包括：
利用分光光度计测定并获得分离的所述总miRNA基因的浓度；
向所述总miRNA基因中加入外源参考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源参考miRNA基因的加入量为所述总miRNA基因质量的0.05％，所述外源参考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
分别将所述总miRNA基因和所述外源参考miRNA基因的5’端与3’端连接，得到环化的所述总miRNA基因和环化的所述外源参考miRNA基因的混合液；
将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录，得到的逆转录产物用于进行所述实时定量PCR检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA393a基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量，包括：
将2μl所述逆转录产物、3μl浓度为1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl 50倍的ROX荧光校正染料混合均匀，得到第二混合液，将所述第二混合液在实时定量PCR仪中进行反应，所述反应共45个循环，第一个循环的程序为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，其中，66℃30秒和67℃30秒在每循环一次后分别增加0.1℃和0.2℃，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，所述荧光信号的强弱用于衡量所述表达量的多少；
所述引物包括：序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA393a基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA393a基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:5所示的外源参考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID NO:6所示的外源参考miRNA基因反向引物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录的步骤包括：
取所述环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液2μl、5μl浓度为1μM的逆转录引物、2μl浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DTT和20U的逆转录酶，用水补足50μl混匀后，得到第四混合液，将所述第四混合液于42℃保温2小时，75℃保温15分钟，使酶失活，得到所述逆转录产物；所述逆转录引物包括miRNA393a基因的逆转录引物和外源参考miRNA基因的逆转录引物，所述miRNA393a基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ IDNO:7所示，所述外源参考miRNA基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ IDNO:8所示。
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