CN105886644A - 密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂中含有五条锁式探针，分别为Seq ID No.1所示序列的CMN锁式探针、Seq ID No.2所示序列的CMM锁式探针、Seq ID No.3所示序列的CMI锁式探针、Seq ID No.4所示序列的CMS锁式探针、Seq ID No.5所示序列的CMT锁式探针。本申请的多重检测试剂，含有五个亚种的特异性锁式探针，能够同时对五个亚种进行特异性检测；提高了检测效率和检测质量。本申请的试剂及试剂盒，为密执安棒状杆菌高通量检测提供了一种简单有效的途径，适于检验检疫部门使用，为保障生物安全，避免病菌传播提供了有力的科学依据。

Description

密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及植物病原菌检测领域，特别是涉及一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
密执安棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)为放线菌目、微球菌科、密执安棒状杆菌属，是重要的植物病原细菌。其中，密执安棒状杆菌的五个亚种：Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(缩写CMN)、Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis(缩写CMM)、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus(缩写CMI)、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(缩写CMS)、Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius(缩写CMT)，是目前密执安棒状杆菌属检验检疫研究的重点。这五个亚种是危害性大、分布广的密执安棒状杆菌属亚种，并且，五个亚种的形态学特征近似，分子生物学特征也相近，因此很难鉴别。
Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis又称玉米内州萎蔫病菌，主要分布于北美洲，自然寄主包括玉米(Zea mays)、墨西哥假蜀黍(Zea mexicana)，接种寄主包括墨西哥假蜀黍(Euchlaena mexicana)、甘蔗(Saccharum officinarum)、高粱(Sorghum bicolor)、苏丹草(Sorghum sudanense)、鸭茅状磨擦禾(Tripsacumdactyloides)。病菌在种子中至少存活1年，可进行远距离传播，对感染的玉米品种具有毁灭性的危害，是我国进境植物检疫性有害生物。
Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis又称番茄细菌性溃疡病菌，在亚洲、欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis的自然寄主包括：番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、茄属(Solanum)、龙葵(Solanum nigrum)、裂叶茄(Solanum triflorum)和其他的茄科杂草。接种寄主包括：燕麦(Avenasativa)、西瓜(Citrullus lanatus)、西瓜(Citrullus vulgaris)、黄瓜(Cucumis sativus)、树番茄(Cyphomandra betacea)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦(ordeumvulgare)、秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、黑麦(Secale cereale)、Solanumhumboldtii、Solanum muricatum、Solanum nigrum var guineense、Solanumpruniforme、Solanum racemiflorum、马铃薯(Solanum tuberosum)、普通小麦(Triticum aestivum)。病菌在在土壤里的病残组织中可存活2～3年。
Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus又称苜蓿细菌性萎蔫病菌，在亚洲、欧洲、北美洲、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，也是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。其自然寄主包括：百脉根Lotuscorniculatus、苜蓿属Medicago(野苜蓿Medicago falcata、紫苜蓿Medicagosativa)、白香草木樨Melilotus albus、驴喜豆Onobrychis viciaefolia、木犀Syringafragrans、车轴草属Trifolium。接种寄主包括：Medicago dzawknetica、Medicagoglutinosa、Medicago hemicycla、小苜蓿Medicago minima、Medicago prostrata、Medicago sativa var.gaetula、Medicago sativa var.parviflora、Medicago sativa var.pilifera、Medicago sogdiana、Medicago suffruticosa、Medicago tianschanica、Medicago transoxana、玉米Zea mays。Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus一般在受害寄主根管和病残寄主组织上越冬，也可在种子和干草上越冬，春季通过伤口侵入根系，引起萎蔫病。
Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus又称马铃薯环腐病菌在亚洲、欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲等都有分布，是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。其自然寄主为马铃薯Solanumtuberosum，接种寄主包括：Athenaea、甜菜Beta vulgaris、番茄Lycopersiconesculentum等茄属植物。带菌种薯是主要的初侵染源，采用切块播种时，切刀传病是扩大再侵染的主要途径。切一刀病薯的切刀能传染24～40个健薯。灌溉水或雨水也可将病薯腐烂释放出来的细菌传到健薯或健株根茎上。带菌种薯细菌随养分和水分流动沿维管束依次向上进入新芽、茎、叶柄和叶内，形成系统侵染。当葡匐茎长出时，病菌又沿葡匐茎的维管束进入新生薯块，但种子不带菌。
Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius又称密执安棒状杆菌棋盘亚种，是Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus的近似种，在检验检疫过程中，极易引起混淆。
由于以上五种密执安棒状杆菌的形态学特征和分子学特征都极其相似，容易引起混淆，因此，亟需一种能够对密执安棒状杆菌进行有效检测鉴定的方法或试剂。
发明内容
本申请的目的是提供一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，该多重检测试剂中含有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No.1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、Seq ID No.2所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、Seq IDNo.3所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、SeqID No.4所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID No.5所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。
本申请的另一面还公开了的密执安棒状杆菌多重检测试剂在密执安棒状杆菌滚环扩增检测、滚环扩增液相芯片检测中的应用。
需要说明的是，本申请的试剂实际上就是五种密执安棒状杆菌亚种的特异性锁式探针，因此，可以将其用于密执安棒状杆菌滚环扩增检测。而本申请的一种优选实现方式中，将滚环扩增与液相芯片结合，利用液相芯片对滚环扩增产物进行检测和分析，与常规的凝胶电泳相比，具有更高的灵敏度和准确性。
还需要说明的是，本申请的试剂，即五条特异性锁式探针，经过严密的设计和验证，五条锁式探针可以组合在一起进行多重检测，并且，五条锁式探针都具有很好的特异性，不会相互干扰，具有很好的一致性。
本申请的另一面公开了一种密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法，包括采用本申请的多重检测试剂，对待测样品进行滚环扩增，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样品中是否含有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus和/或Clavibactermichiganensis subsp.tessellarius。
需要说明的是，本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂，实际上就是五种密执安棒状杆菌亚种的锁式探针，其设计之处就考虑到将其用于滚环扩增，以进行多重检测；因此，本申请提出了多重检测密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法。其中，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样品，目前主要的方法包括凝胶电泳或芯片杂交；而本申请的优选方案中将其与液相芯片结合，通过液相芯片判断锁式探针的扩增情况。
本申请的再一面公开了一种密执安棒状杆菌的滚环扩增液相芯片检测方法，包括以下步骤，
(1)提取待测样品的DNA样本；
(2)采用权利要求1所述的多重检测试剂，对提取的DNA样本进行滚环扩增；
(3)将五种偶联微球对滚环扩增产物进行杂交和液相芯片分析，获得检测结果；
其中，五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球。
优选的，Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.6所示序列，Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.7所示序列，Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.8所示序列，Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.9所示序列，Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列为SeqID No.10所示序列。
需要说明的是，锁式探针的基本结构是，从5’到3’端依序为：T1检测臂区、通用引物结合区、Zip区和T2检测臂区；其中T1检测臂区和T2检测臂区是用于跟靶标序列特异性结合的区域，每条锁式探针的检测臂区是不同的，特别是最末几个碱基是不同的，以此保障检测的特异性；每条锁式探针的通用引物结合区序列是一样的，以方便所有锁式探针在连接成环后，采用一对引物完成所有环状锁式探针的扩增；而Zip区是每条锁式探针的特异识别区，类似于条形码的作用，Zip区通常是一段约20bp的随机序列，每条锁式探针的Zip区都不同。在锁式探针中Zip区的作用就是识别锁式探针，因此，可以用于进行基因芯片杂交，以判别锁式探针是否有扩增等。而本申请中，则是将滚环扩增与液相芯片结合，所以，在液相芯片的微球上偶联Zip区序列；如果锁式探针有连接成环，并且有进行扩增，则其扩增产物就可以与偶联微球结合，从而被液相芯片系统检测出来。
本申请的再一面公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂盒，该试剂盒中含有本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂。
需要说明的是，本申请的试剂，即五条锁式探针，可以单独制成产品，以方便密执安棒状杆菌多重检测使用。
优选的，试剂盒中还含有五条锁式探针的通用引物，通用引物包括第一引物，第一引物为Seq ID No.11所示序列。
更优选的，通用引物还包括第二引物，第二引物为Seq ID No.12所示序列。
需要说明的是，本申请的试剂，实际上就是密执安棒状杆菌五个亚种的五条特异性的锁式探针，因此，在将其制成试剂盒的时候，为了方便滚环扩增使用，还可以在其中配置通用引物。可以理解，对于滚环扩增而言，通用引物可以是一条引物，也可以采用两条引物，都可以进行滚环扩增；当然，优选的，采用两条引物进行滚环扩增能够获得更好的扩增效果。
优选的，试剂盒中还含有五条锁式探针的五条捕获探针，五条捕获探针分别为Seq ID No.6所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.9所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.10所示序列或其反向互补序列。
需要说明的是，在考虑到采用基因芯片或者斑点杂交判断滚环扩增产物的情况，本申请的试剂盒还可以选择性的配备五条捕获探针，这五条捕获探针，实际上就是针对锁式探针的Zip区而设计的；可以直接是Zip区序列，也可以是其反向互补序列；当然，最好采用Zip区序列，这样可以避免锁式探针本底显色。如果使用Zip区的反向互补序列，则即便锁式探针没有连接成环、没有被扩增，同样可以与捕获探针杂交，也就是说直接的锁式探针也可以与捕获探针杂交，从而显色，即本底显色。可以理解，如果配备捕获探针，或者采用基因芯片或斑点杂交对滚环扩增产物进行判断，则需要对第一引物进行生物素标记。
优选的，试剂盒中还含有用于液相芯片检测的，五条锁式探针的五种偶联微球，五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球。
需要说明的是，考虑到滚环扩增与液相芯片结合，为了方便使用，本申请的试剂盒中直接提供了偶联有锁式探针Zip序列的液相芯片微球，滚环扩增完成后，直接采用本申请试剂盒提供的偶联微球进行杂交，然后采用液相芯片系统进行分析，即可获得结果，使用简单方便。
本申请的有益效果在于：
本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂，含有五个亚种的特异性锁式探针，能够同时对五个近似种进行特异性检测；提高了检测效率和检测质量。本申请的试剂以及基于该试剂的试剂盒，为密执安棒状杆菌的高通量检测提供了一种简单有效的途径，特别适合于检验检疫等部门使用，为保障生物安全，避免密执安棒状杆菌传播提供了有力的科学依据。
附图说明
图1是本申请实施例中CMN的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
图2是本申请实施例中CMM的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
图3是本申请实施例中CMI的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
图4是本申请实施例中CMS的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
图5是本申请实施例中CMT的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
图6是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系杂交温度优化结果；
图7是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系杂交时间优化结果；
图8是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系中，杂交时，滚环扩增产物用量优化结果；
图9是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的密执安棒状杆菌多重检测试剂由密执安棒状杆菌的五个亚种：Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus、Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius的五条锁式探针组成。本例采用滚环扩增结合液相芯片对五条锁式探针进行特异性试验，五条锁式探针的设计以及相关试验详细如下：
一、供试材料及主要溶液
1.供试菌株
本例采用了两株CMI菌株、三株CMM菌株、三株CMN菌株、两株CMS菌株和两株CMT菌株进行试验，同时，采用了七个其它近似种属的菌株作为阴性对照进行试验。菌株详细情况如表1所示。
表1 供试菌株及其来源
表1中，菌株编号是本例对菌株的编号，该编号由六个数字组成，是沿用深圳出入境检验检疫局植物检验检疫实验室植物病原细菌保存库菌株编号；原始编号是指菌株来源的原始编号。来源中，1为ATCC,American Type CultureCollection Center；2为ICMP,International Collection of Microorganisms fromPlants；3为NCPPB,National Collection of Plant Pathogenic Bacteria；4为ICPB,International Collection of Phytopathogenic Bacteria；5为LMG,BelgianCo-ordianted Collections of Micro-organisms；6为中国农业大学种子健康检测中心；7为中国检验检疫科学研究院。
2.菌株培养
首先用无菌接种环挑取所用供试菌株在营养培养基(NA)28℃活化48h后备用；然后用无菌水配制成浓度约1×108CFU/mL的细胞菌悬液。菌悬液浓度测定方法为，用紫外光栅分光光度计在波长为600nm测量配制的细菌悬浮液样品光密度值约为0.1，然后以10倍梯度稀释，再分别取100μL稀释为105、106和107倍的细菌悬浮液涂于NA培养基，各梯度4次重复，置28℃培养箱中黑暗培养48-72h后进行平板单菌落计数，并计算原配细菌悬浮液浓度。
3.DNA提取和浓度测量
供试菌株DNA的提取参照Axygen的DNA试剂盒说明书进行。即用1.5mL离心管收集1mL过夜培养的细胞悬浮液，10000g离心2min后弃上清液；加入350μL去离子水悬浮细胞，振荡混匀；加入0.8μL RNaseA，漩涡震荡15s，室温静置1min；加入150μL Buffer C-L和8μL proteinase K立即漩涡震荡1min，短暂离心后，置56℃水浴30min以上；加入350μL Buffer P-D，漩涡震荡30s混匀。12000g离心10min；将DNA制备管至于2mL离心管中，将离心后的上清液移至制备管，12000g离心1min；弃滤液加500μL Buffer W1，12000g离心1min；弃滤液加700μL Buffer W2，12000g离心1min，重复1次；弃滤液后再离心1min；将离心后的制备管另置于洁净的1.5mL离心管中，加入120μL Eluent或无菌水，静置1min后离心1min,最后-20℃保存。最后取1μL按照Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪操作测定DNA浓度。
4.主要溶液
1)0.1M MES偶联缓冲液pH4.5：称取4.88g MES，用200mL去离子水充分溶解，然后定容至250mL，pH调整至4.5，0.22μm过滤除菌，4℃保存备用。
2)0.02％Tween 20，即清洗缓冲液I：量取50μL购买的Tween 20，加入200mL去离子水，混匀，然后定容至250mL，0.22μm过滤除菌，室温保存备用。
3)0.1％SDS，即清洗缓冲液Ⅱ：量取2.5mL 10％SDS，加入200mL去离子水，混匀，然后定容至250mL，0.22μm过滤除菌，室温保存备用。
4)1.5×TMAC杂交缓冲液，即微球稀释液：量取450mL 5M的TMAC、3.76mL 20％的Sarkosyl、37.5mL 1M的Tris-HCl(pH8.0)、6mL 0.5M的EDTA(pH8.0)、2.74mL去离子水；混匀，获得500mL杂交缓冲液，室温保存备用。
5)1×TE pH8.0，即样品稀释液：量取2.5mL的100×TE pH8.0，加入去离子水200mL，混匀，最终定容至250mL，0.22μm过滤除菌，室温保存备用。
6)20％Sarkosyl：称取50g Sarkosyl，用200mL去离子水充分溶解，然后定容至250mL，0.22μm过滤除菌，室温保存备用。
7)1×TMAC杂交缓冲液，即杂交液：量取167mL 1.5×TMAC杂交缓冲液，加入去离子水83mL，混匀，即获得1×TMAC杂交缓冲液，室温保存备用。
二、锁式探针及通用引物的设计合成
通过下载并整理NCBI数据库公布的靶标细菌及其近似种核酸序列，采用BioEdit对其ITS区、16S rRNA gene等保守区域进行比对分析，寻找碱基差异大的保守序列，并找出不同于近似种的靶标特异位点，或采用常规PCR和实时荧光PCR检测方法中使用的特异性检测位点，按照锁式探针设计原则，采用Primer Premier 5.0分析锁式探针T1检测臂区和T2检测臂区的Tm值，并采用RNA structrue 5.4分析锁式探针的二级结构，设计本例的锁式探针。
锁式探针中间的连接序列是一段与检测靶序列无关的序列，主要包括通用引物结合区，约40bp左右，以及用于滚环扩增产物与液相芯片杂交检测的Zip区，约20bp。本例建立了一套Zipcode核酸序列数据库以供外来危险性植物细菌的锁式探针设计选用。本研究设计的锁式探针长度在96bp-103bp之间，锁式探针的发夹结构采用RNA structrue 5.4进行预测，确保发夹结构能值最小。在合成锁式探针时，其5’端需要进行磷酸化修饰，所有锁式探针和引物均由大连宝生物工程有限公司(TAKARA)合成，本例设计的锁式探针及通用引物如表2所示。
表2 锁式探针和通用引物
表2中，CMN-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、CMM-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、CMI-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、CMS-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、CMT-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。5’端的“PO4”为磷酸化修饰。锁式探针虚线部分为T1检测臂区和T2检测臂区，实线部分为通用引物结合区，黑体部分即实线和虚线之间的部分为Zip区。
在锁式探针测试阶段，即采用凝胶电泳验证滚环扩增结果的阶段，所采用的第一引物的5’端没有生物素标记；在采用液相芯片对滚环扩增产物进行分析时，所使用的第一引物的5’端具有“Biotin”生物素标记。
三、液相芯片检测探针的设计合成
基于滚环扩增的液相芯片检测，需要合成两种探针：1)捕获探针(CaptureProbe)，即一段带有5’氨基修饰的-C12-手臂的寡核苷酸，这段序列与锁式探针Zip区的碱基序列相同，与羧基微球偶联，并用于检测滚环扩增产物；2)验证探针(Validation Oligo)，即一段带有5’生物素(Biotin)标记片段，该序列与捕获探针反向互补，用于捕获探针与微球偶联的效率验证。所有探针均由大连宝生物工程有限公司(TAKARA)合成，捕获探针和验证探针如表3所示。本例的捕获探针与微球偶联后即获得偶联微球。
表3 捕获探针和验证探针
名称 序列5’-3’ Seq ID No.
CMN-CP Amino-C12-ATGATGTGCAAAGTGCCGTC 6
CMM-CP Amino-C12-ATTTGACGAACGTATGCCGC 7
CMI-CP Amino-C12-ACATCCTGGACACGAGTGAC 8
CMS-CP Amino-C12-AGCCGCAATGCACGACTGATTA 9
CMT-CP Amino-C12-ATTAACTCGACTGCCGCGTG 10
CMN-VO Biotin-GACGGCACTTTGCACATCAT 13
CMM-VO Biotin-GCGGCATACGTTCGTCAAAT 14
CMI-VO Biotin-GTCACTCGTGTCCAGGATGT 15
CMS-VO Biotin-TAATCAGTCGTGCATTGCGGCT 16
CMT-VO Biotin-CACGCGGCAGTCGAGTTAAT 17
表3中，CMN-CP为Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis的捕获探针、CMM-CP为Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis的捕获探针、CMI-CP为Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus的捕获探针、CMS-CP为Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus的捕获探针、CMT-CP为Clavibactermichiganensis subsp.tessellarius的捕获探针。CMN-VO为Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis的验证探针、CMM-VO为Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis的验证探针、CMI-VO为Clavibactermichiganensis subsp.insidiosus的验证探针、CMS-VO为Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus的验证探针、CMT-VO为Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius的验证探针。其中，“Amino-C12”表示捕获探针的5’端连接有氨基修饰的12个碳的手臂，“Biotin”表示验证探针的5’端有生物素标记。
四、液相芯片偶联微球的制备和质控
1.捕获探针与微球偶联
为后续多重液相悬浮芯片检测，需将本研究中靶标菌对应的捕获探针与不同编号的微球偶联备用。本例捕获探针与偶联微球的编号分别为：CMN-CP偶联52#微球、CMM-CP偶联45#微球、CMI-CP偶联33#微球、CMS-CP偶联51#微球、CMT-CP偶联35#微球。
整个偶联过程需要完全避光，具体步骤包括：
1)取2份新鲜的EDC粉末，使之恢复至室温；
2)蜗旋仪上以最高转速悬浮微球30s混匀，然后在超声清洗仪上超声微球30s防止微球贴壁；
3)取100μL微球到EP离心管中，最高转速离心2min；
4)弃上清，取50μL，pH4.5，0.1M的MES重悬微球，彻底蜗旋30s，超声20s，使微球分散；
5)加入2μL稀释好的0.1nmol/μL的捕获探针于重悬微球中，涡旋震荡20s；
6)制备新鲜的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孵育30min；
7)再次制备新鲜的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孵育30min；
8)加入1mL 0.02％Tween 20，稍微蜗旋混匀，以最高转速离心2min，弃上清液；
9)用1mL 0.1％SDS重悬沉淀40s，最高转速离心2min，弃上清液；
10)用100μL，pH 8.0，1×TE buffer重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋30s，超声20s，4℃黑暗条件下储存。
2.微球计数
通过血球计数器来计算偶联后微球的数量，从而估算微球浓度。
具体步骤如下：
1)微球准备：将偶联好的微球在涡旋仪上重悬40s，用双蒸水按照1:100的比例稀释微球并彻底混匀；
2)血球计数器准备：使用70％乙醇将盖玻片和血球计数器清洁干净，然后将盖玻片润湿并覆盖至血球计数器上；
3)加样：取10μL稀释后的微球转移到血球计数器中并放置几分钟使微球完全扩散，同时用吸水纸吸掉多余的液体；
4)计数：在100倍显微镜下，移动计数器将视野对准计数器的中央大方块，记录计数池四个角以及中央方块内的微球数(每个方块细胞数应不大于20-50)。
5)计算：血球计数器每个大方块可以容纳的体积为1mm2×0.1mm＝0.1mm3＝10-4cm3＝10-4mL，因此，每毫升溶液中微球的个数＝每个方块内微球平均数×细胞稀释比例×104；
6)微球浓度(个/μL)＝(5个方格里微球数量之和)/5×10×100。
本例中CMN-CP偶联52#微球浓度是12500个/μL，CMM-CP偶联45#微球11500个/μL，CMI-CP偶联33#微球浓度是18750个/μL，CMS-CP偶联51#微球浓度是12250个/μL，CMT-CP偶联35#微球浓度是16500个/μL。
3.捕获探针偶联效率验证
制备偶联微球工作混合物：
制备新鲜偶联好的微球工作液，以便进行偶联效率验证或后续杂交检测，具体步骤如下：
1)微球准备：将偶联微球超声15-20s，充分涡旋振荡混匀待用；
2)体系准备：每管反应中工作混合物体系为33μL，每种微球至少5000个，其中包含22μL的1.5×TMAC杂交缓冲液，CMN-CP偶联52#微球体积为0.4μL，CMM-CP偶联45#微球体积为0.4μL，CMI-CP偶联33#微球体积为0.3μL，CMS-CP偶联51#微球体积为0.4μL，CMT-CP偶联35#微球体积为0.3μL；最后加入无菌水9.2μL，置于冰上备用；
制备验证探针工作液：
制备新鲜稀释的验证探针工作液，确保每个探针浓度为10fmol/μL。
1)本例的起始验证探针工作原液浓度为0.01nmol/μL，即10pmol/μL；
2)五个验证探针的工作原液各取4μL，加入80μL pH8.0的TE，获得100μL的验证探针混合原液，其中，各个验证探针的浓度为0.4pmol/μL，即400fmol/μL；
3)取10μL验证探针混合原液，加入到390μL pH8.0的TE中，彻底涡旋混匀，则获得400μL验证探针工作液，其中每个探针的终浓度为10fmol/μL，放置冰上备用。
偶联效率验证
为确保捕获探针和微球偶联的效果，需进行偶联效率验证，具体步骤如下：
1)向每个PCR管中加入新鲜配置的偶联微球工作混合物33μL；
2)向各个PCR管中加入不同浓度的验证探针，形成不同浓度梯度的验证探针体系，每个浓度重复3次，各浓度设置如下：
A.直接分别向三个PCR管中加入17μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，验证探针的浓度为0；
B.分别向三个PCR管中加入0.5μL验证探针工作液和16.5μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为5fmol；
C.分别向三个PCR管中加入1μL验证探针工作液和16μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为10fmol；
D.分别向三个PCR管中加入2μL验证探针工作液和15μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为20fmol
E.分别向三个PCR管中加入5μL验证探针工作液和12μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为50fmol
F.分别向三个PCR管中加入10μL验证探针工作液和7μL TE，每个PCR管的总反应体积为50μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为100fmol
G.分别向三个PCR管中加入20μL验证探针工作液，每个PCR管的总反应体积为53μL，每个反应中，五个验证探针的量分别为200fmol
3)每个PCR管充分混匀后，置于PCR仪进行杂交反应，反应条件为95℃，5min；50℃，15min，然后52℃杂交30min；
4)制备新鲜的4μg/mL的SA-PE，用1×TMAC缓冲液稀释；
5)杂交反应完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；
6)取125μL PCR管的反应液转移至96孔板中，根据Bioplex使用说明书分析荧光值，判定探针与微球的偶联效率。
按照终量为0fmol、5fmol、10fmol、20fmol、50fmol、100fmol、200fmol进行系列梯度稀释后与偶联微球的捕获探针杂交检测。结果如图1-图5所示，结果表明，5个偶联的捕获探针与验证探针杂交后均具有较高的杂交信号，其荧光中位值MFI随着对应验证探针用量增加而逐渐上升，说明微球与捕获探针偶联成功。
五、密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系
1.五重滚环扩增体系
将CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五个亚种的锁式探针配置成，各自终浓度均为200pmol/L的混合锁式探针。
五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20μL，包括：10×Taq DNAligase缓冲液2μL，40U/μL Taq DNAligase 0.5μL，各锁式探针浓度200pmol/L的混合锁式探针1μL，每种模板2μL，无菌ddH2O 6.5μL。
连接反应采用热循环连接法，反应条件为：94℃4min；然后进入20个循环：94℃30s，65℃5min；循环结束后95℃15min灭活Taq DNA ligase，然后置于冰上。
取10μL连接产物加入10μL消化反应混合液：(10×Exonuclease I缓冲液2μL，20U/μL的Exonuclease I 0.5μL；10×ExonucleaseⅢ缓冲液2μL；100U/μL的ExonucleaseⅢ0.05μL；无菌dd H2O补足10μL)，37℃反应2.5h，彻底消化未环化的线性探针和未反应的DNA模板，最后95℃反应20min，灭活剩余的核酸外切酶，冰上操作。
将连接消化后的产物作为模板，用PF/PR扩增引物进行滚环扩增，反应体系为25μL：10×Bst DNA polymerase缓冲液2.5μL，8U/μL Bst DNA polymerase0.5μL，10μmol/L PF 0.5μL，10μmol/L PR 0.5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，消化产物2μL，无菌dd H2O补足25μL，冰上操作。反应条件：62.5℃反应1h。其中滚环扩增下游引物采用带生物素修饰的PR2。
2.五重滚环扩增液相芯片检测体系
将五种偶联微球：CMN-CP偶联52#微球、CMM-CP偶联45#微球、CMI-CP偶联33#微球、CMS-CP偶联51#微球、CMT-CP偶联35#微球，混匀，制成偶联微球工作液。
将带生物素标记的CMN、CMM、CMI、CMS、CMT的五重滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液杂交。杂交体系为：滚环扩增产物2-10μL、偶联微球工作液33μL、TE Buffer补足50μL。其中滚环扩增产物的具体用量按照本例的优化方案添加。
杂交反应条件为：95℃，5min；50℃，15min，杂交温度和时间按照本例的优化方案进行。
杂交的过程中，制备新鲜的4μg/mL的SA-PE，用1×TMAC缓冲液稀释。杂交完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125μL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分析，根据中位荧光强度值(MFI)来进行结果判定。
本例为了获得五重滚环扩增液相芯片检测体系，首先对杂交温度进行了优化，然后对杂交时间、滚环扩增产物用量进行了优化。
具体的，杂交温度优化设定了46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等6个杂交温度梯度进行优化，以温度为变量，其他条件完全相同情况下，每个梯度设置3个重复，确定最佳杂交温度；其他条件包括杂交时间设定为20min，滚环扩增产物的用量为8μL。杂交时间优化设定了10min、15min、20min、25min、30min、40min等6个时间梯度，以时间为变量，其他条件完全相同情况下，每个梯度设置3个重复考察不同时间下杂交效果，确定最佳杂交时间；其它条件包括杂交温度根据优化的结果设定为52℃，滚环扩增产物的用量为8μL。滚环扩增产物用量的优化设定了2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、17μL等6个体积梯度为优化对象，其他条件完全相同，每个梯度设置3个重复；其它条件包括杂交温度和杂交时间，根据优化结果，设定杂交温度为52℃，杂交时间为30min。
3.捕获探针特异性验证
将五条验证探针分别与混合的偶联微球工作液杂交反应，验证探针的用量为100fmol。验证探针工作原液浓度为10pmol/μL，将五条验证探针分别稀释200倍，获得50fmol/μL的验证探针工作液。
杂交反应体系为：混合的偶联微球工作液33μL、50fmol/μL的验证探针工作液2μL、TE Buffer 15μL。另外，设置一个空白对照，即以2μL去离子水空白对照替换2μL的50fmol/μL验证探针工作液。
杂交反应条件根据优化的五重滚环扩增液相芯片检测体系的反应条件进行，具体的，95℃，5min；50℃，15min，然后52℃杂交30min。
杂交完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125μL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分析，观察五种捕获探针是否有交叉反应，以评估捕获探针的特异性。
4.单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
将五条锁式探针分别与其阳性样品进行滚环扩增，引物采用带生物素标记的引物。设置一个去离子水空白对照，即以等体积的去离子水替换阳性样品，其它组分相同，进行滚环扩增。
单重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20μL，包括：10×Taq DNAligase缓冲液2μL，40U/μL Taq DNAligase 0.5μL，200pmol/L的锁式探针1μL，模板2μL，无菌ddH2O 14.5μL。
滚环扩增的消化反应，以及后续的滚环扩增与“1.五重滚环扩增体系”相同，在此不累述。
滚环扩增完成后，将五个滚环扩增产物分别与混合的偶联微球工作液杂交反应。本例采用的五个阳性样品分别为菌株编号470324的CMN菌株的DNA、菌株编号470316的CMM菌株的DNA、菌株编号470343的CMI菌株的DNA、菌株编号470330的CMS菌株的DNA、菌株编号470326的CMT菌株的DNA。
杂交反应体系为：滚环扩增产物2μL、偶联微球工作液33μL、TE Buffer15μL。
杂交反应条件为：95℃，5min；50℃，15min，然后52℃杂交30min。
杂交完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125μL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分析，观察实际扩增产物能否与捕获探针杂交产生荧光中位值，各产物与偶联微球之间是否出现交叉反应。
5.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性
选取菌株CMI(470343、470344)、CMT(470326、470327)、CMS(470330、470333)、CMM(470308、470313、470316)、CMN(470321、470324、470325)的DNA作为单一或协同阳性模板，其他菌株的DNA作为阴性模板，无菌双蒸水作为空白对照，采用五条锁式探针制备的混合锁式探针，进行五重滚环扩增。滚环扩增采用的引物为生物素标记的引物。最后将滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液杂交，评估该检测体系的特异性。
五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20μL，包括：10×Taq DNAligase缓冲液2μL，40U/μL Taq DNAligase 0.5μL，各锁式探针浓度200pmol/L的混合锁式探针1μL，模板2μL，无菌ddH2O 14.5μL。
后续的消化和滚环扩增与“1.五重滚环扩增体系”相同，在此不累述。
杂交反应体系为：滚环扩增产物2μL、偶联微球工作液33μL、TE Buffer15μL。
杂交反应条件为：95℃，5min；50℃，15min，然后52℃杂交30min。
杂交完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125μL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分析，观察阳性模板是否能够有效的检测出五个密执安棒状杆菌亚种，而其它阴性模板和空白对照是否符合预期。
6.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系灵敏度
为评估CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五重液相悬浮芯片检测灵敏度，分别选取CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN(470324)作为标准阳性菌株，提取DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，并制成五重混合模板，按10倍梯度进行稀释至10-6倍。
同时，将该五种菌株分别制成纯菌悬液，利用紫外分光光度计，在波长600nm下调节其光密度值为0.1，并利用无菌水稀释至10-8倍，然后分别取100μL的10-6，10-7，10-8倍梯度稀释的菌悬液涂于NA培养基，每个处理3次重复，置于30℃黑暗培养5天后记录菌落数确定实际的菌悬液浓度，单位cfu/mL。同时将五种菌株的分别制成的纯菌悬液原液混合，制成混合模板，并按10倍梯度进行稀释至10-8倍，分别取10μL各稀释梯度的混合DNA和混合菌悬液进行五重滚环扩增，然后对滚环扩增产物进行液相芯片检测，最终确定五重液相芯片检测灵敏度。
五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20μL，包括：10×Taq DNAligase缓冲液2μL，40U/μL Taq DNAligase 0.5μL，各锁式探针浓度200pmol/L的混合锁式探针1μL，模板2μL，无菌ddH2O 14.5μL。
后续的消化和滚环扩增与“1.五重滚环扩增体系”相同，在此不累述。
杂交反应体系为：滚环扩增产物2μL、偶联微球工作液33μL、TE Buffer15μL。
杂交反应条件为：95℃，5min；50℃，15min，然后52℃杂交30min。
杂交完成后，向每个PCR管中加入100μL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下600rpm震荡孕育10min；震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125μL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分析。
观察DNA模板和菌悬液模板两者分别可以检测的浓度下限，从而判断五重滚环扩增液相芯片检测体系的灵敏度。
7.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五个亚种的混合DNA作为模板，采用五条锁式探针制备的混合锁式探针，进行五重滚环扩增。滚环扩增采用的引物为生物素标记的引物。最后将滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液杂交，评估该检测体系的特异性。在相同条件下做3次重复性试验，计算其变异系数(CV％)，以此验证密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系的重复性。
变异系数(CV％)＝标准差/算数平均值×100％
六、结果及分析
1.五重滚环扩增液相芯片检测体系
杂交温度优化：本例设置了46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等6个杂交温度梯度进行优化，结果表明：五重滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液的杂交温度在46℃-52℃之间时，五种靶标菌被检测到的荧光中位值都逐渐上升；在52℃-56℃之间，五种靶标菌被检测到的荧光中位值都逐渐减少，如图6所示。综合考虑，最终确定该五重检测中杂交最佳温度为52℃。
杂交时间优化：本例设置了10min、15min、20min、25min、30min、40min等6个时间梯度。结果显示，以最佳杂交温度52℃进行杂交时，五重滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液的杂交时间从10min到30min时，其荧光中位值缓慢升高；当杂交时间从30min到40min时，五个靶标菌的荧光中位值都减少；如图7所示。可见30min是比较明显的拐点，因此，确定最佳杂交时间为30min。
滚环扩增产物用量优化：本例设定了2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、17μL等6个体积梯度。结果显示，以最佳杂交温度52℃、最佳杂交时间30min进行杂交时，随着加入体系中滚环扩增产物体积的增加，五种靶标菌的检测荧光强度值相应降低，如图8所示，因此确定最佳添加体积为2μL。
最终确定五重滚环扩增液相芯片检测体系的最佳杂交温度为52℃、最佳杂交时间为30min，杂交反应中滚环扩增产物的用量为2μL。
2.捕获探针特异性验证
采用五条验证探针分别与混合的偶联微球工作液杂交反应，判断五种捕获探针是否有交叉反应，以评估捕获探针的特异性。其中验证探针相当于最理想的扩增产物，与捕获探针完全反向互补，倘若有交叉反应，现实的扩增产物理论上也会出现交叉反应，所以出现交叉反应将无法进行后续检测。
本例的五条捕获探针的特异性验证结果如表3所示，结果显示，本例的五条验证探针仅与其对应的偶联微球有杂交，而与其它微球无杂交，可见，本例的五条捕获探针具有良好的特异性。
表4 验证探针对捕获探针特异性验证结果
表4中，结果判定“CMI/CMT/CMS/CMM/CMN”栏，“+”表示检出为阳性，“-”表示检出为阴性；例如“+/-/-/-/-”表示“CMI”阳性，其余为阴性；“-/+/-/-/-”表示“CMT”阳性，其余为阴性；以此类推。
3.单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
本例将五条锁式探针分别与其阳性样品进行滚环扩增，五个滚环扩增产物分别与混合的偶联微球工作液杂交反应。结果如表5所示，阳性样品与预设的对应的偶联微球有杂交信号，而与其它偶联微球没有杂交信号，例如CMN的阳性样品滚环扩增产物，仅与52#微球有杂交信号，其它偶联微球没有杂交信号。该检测结果与捕获探针特异性验证结果相同。
表5 单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
表5中，结果判定“CMI/CMT/CMS/CMM/CMN”栏，“+”表示检出为阳性，“-”表示检出为阴性；例如“+/-/-/-/-”表示“CMI”阳性，其余为阴性；“-/+/-/-/-”表示“CMT”阳性，其余为阴性；以此类推。
4.五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性
本例以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五个亚种的混合DNA作为阳性模板，其他17个菌株的DNA作为阴性模板，无菌双蒸水作为空白对照，进行五重滚环扩增，扩增完成后与混合的偶联微球工作液杂交。
结果如表6和图9所示，当样品1中包含CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五种混合DNA时，五重检测体系可以同时检测到33、35、51、45、52号微球的荧光中位值分别为360、528.5、587、321、403，根据结果判定全部为阳性。当样品2中只含CMI、CMT、CMM、CMN四种混合DNA时五重检测体系可以同时检测到33、35、45、52号微球的荧光中位值分别为374.5、619.8、461.5、682，而无靶标对应的51号微球仅显示背景值，根据结果判定CMI、CMT、CMM、CMN样品检测均呈阳性。同样，当样品同时含有3种、2种或1种阳性靶标DNA时，五重检测体系均可同时检测出对应微球显示阳性信号，而当仅存在其他非靶标菌DNA时，五种微球菌未出现强荧光值，表明该五重检测体系可在同一反应同时检测出CMI、CMT、CMS、CMM、CMN协同混合模板，也可以检测出单一靶标菌DNA模板，而其他对照菌株结果均为阴性。因此，该CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五重检测方法具有较好的特异性。
表6 五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性检测结果
表6中，1表示CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN(470324)混合DNA；2表示CMI(470343)、CMT(470326)、CMM(470316)、CMN(470324)混合DNA；3表示CMI(470343)、CMT(470326)、CMN(470324)混合DNA；4表示CMS(470330)、CMM(470316)混合DNA；5表示CMM(470316)；6表示CMM(470308)；7表示CMN(470324)；8表示CMN(470325)；9表示CMT(470326)；10表示CMT(470327)；11表示CMI(470343)；12表示CMI(470344)；13表示CMS(470330)；14表示CMS(470333)；15表示AC(470106)；16表示CFF(470366)；17表示XCC(470703)；18表示PSST(470522)；19表示PSPI(470580)；20表示PSTO(470537)；21表示EA(470404)；22表示空白对照。结果判定“CMI/CMT/CMS/CMM/CMN”栏，“+”表示检出为阳性，“-”表示检出为阴性；例如“+/-/-/-/-”表示“CMI”阳性，其余为阴性；“-/+/-/-/-”表示“CMT”阳性，其余为阴性；以此类推。
5.五重滚环扩增液相芯片检测体系灵敏度
将菌株CMI(470343)DNA原始浓度为14.8ng/μL、CMT(470326)DNA原始浓度为17ng/μL、CMS(470330)DNA原始浓度为57.9ng/μL、CMM(470316)DNA原始浓度16ng/μL、CMN(470324)DNA原始浓度56.6ng/μL等体积混匀后按10倍梯度稀释，取各梯度混合DNA作为模板进行五重检测，其结果见表7，可见CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五重液相悬浮芯片检测体系能检测到CMT、CMM和CMN靶标菌稀释倍数为10-4的DNA，以及CMI和CMS靶标菌稀释倍数为10-5的DNA，其对应的微球荧光强度仍大于空白荧光值的3倍，判定为阳性，即CMI、CMT、CMS、CMM、CMN靶标菌DNA最低浓度值分别为148fg/μL、1.7pg/μL、579fg/μL、1.6pg/μL、5.66pg/μL。当混合DNA稀释倍数为10-6时，该五种微球荧光值均显阴性。表明该五重检测体系能够检测到靶标菌DNA的阀值为148fg/μL。
表7 五重滚环扩增液相芯片检测体系DNA检测灵敏度
表7中100表示原始浓度，10-1表示10倍稀释，以此类推，Blank为水空白对照。
将菌株CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)和CMN(470324)混合配制成10-2-10-8CFU/mL的不同梯度菌悬液，然后分别进行连接消化、滚环扩增以及后续的五重液相悬浮芯片检测，结果如表8所示，结果可见，当混合菌悬液的浓度为10-4cfu/mL时，33#、35#、51#、45#和52#五个偶联微球的荧光中位值分别为93、151.5、141.5、124、142，均大于3倍空白对照的荧光值，即检测结果为阳性；当混合菌悬液的浓度为10-3CFU/mL时，仅35#、45#和52#微球的荧光中位值分别为129.5、140和94，并大于3倍的空白对照样品的荧光值，即检测结果都为阳性，而33#和51#微球的荧光中位值都不能大于3倍的空白对照样品的荧光值，即检测结果都为阴性；当混合菌悬液的浓度为10-2CFU/mL时，五者的荧光中位值都不能大于3倍的空白对照样品的荧光值，即检测结果都为阴性，表明该五重检测体系能够检测到CMT、CMM和CMN的菌悬液浓度阈值为10-4CFU/mL，以及CMI和CMS的菌悬液浓度阈值为10-3CFU/mL。
表8 五重滚环扩增液相芯片检测体系菌悬液检测灵敏度
6.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
通过提取CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)和CMN(470324)的DNA进行连接消化以及滚环扩增，然后通过五重液相悬浮芯片体系进行三次重复性检测，并通过计算各批次间检测的平均荧光值的变异系数，以判断检测方法的重复性，结果如表9所示。
表9 密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
表9的结果显示，检测CMI的33#号微球、检测CMT的35#号微球、检测CMS的51#号微球、检测CMM的45#号微球和CMN的52#号微球的荧光中位值都在300以上，三次重复试验的平均荧光值变异系数分别为6.7％、3.7％、8.3％、9.0％和7.3％，以及空白对照的背景荧光值变异系数也为2.8％，均在10％以内，表明该方法具有良好的可重复性。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，其特征在于：所述多重检测试剂中含有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No.1所示序列的Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、Seq ID No.2所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、Seq ID No.3所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、Seq IDNo.4所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID No.5所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。
2.根据权利要求1所述的密执安棒状杆菌多重检测试剂在密执安棒状杆菌滚环扩增检测、滚环扩增液相芯片检测中的应用。
3.一种密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的多重检测试剂，对待测样品进行滚环扩增，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样品中是否含有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus和/或Clavibactermichiganensis subsp.tessellarius。
4.一种密执安棒状杆菌的滚环扩增液相芯片检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)提取待测样品的DNA样本；
(2)采用权利要求1所述的多重检测试剂，对提取的DNA样本进行滚环扩增；
(3)将五种偶联微球对滚环扩增产物进行杂交和液相芯片分析，获得检测结果；
所述五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球。
5.根据权利要求4所述的滚环扩增液相芯片检测方法，其特征在于：所述Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列为Seq IDNo.6所示序列，所述Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.7所示序列，所述Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.8所示序列，所述Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.9所示序列，所述Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No.10所示序列。
6.一种密执安棒状杆菌多重检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的密执安棒状杆菌多重检测试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有所述五条锁式探针的通用引物，所述通用引物包括第一引物，所述第一引物为Seq IDNo.11所示序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述通用引物还包括第二引物，所述第二引物为Seq ID No.12所示序列。
9.根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有所述五条锁式探针的五条捕获探针，所述五条捕获探针分别为Seq ID No.6所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.9所示序列或其反向互补序列、Seq IDNo.10所示序列或其反向互补序列。
10.根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有用于液相芯片检测的，五条锁式探针的五种偶联微球，所述五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球。
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