CN110878356B

CN110878356B - 一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用

Info

Publication number: CN110878356B
Application number: CN201911203844.5A
Authority: CN
Inventors: 赵永席; 赵越; 付有兰
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110878356A

Abstract

本发明公开了一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用，属于基因检测技术领域。针对靶标核酸的不同识别探针之间只有与靶标核酸杂交的识别区域序列不同，其余位置均为通用序列。所有经靶标特异性连接形成的多种环形模板均可以通过一对通用的扩增引物实现指数扩增，避免多重引物种类不同或浓度过高对扩增体系的干扰，消除体系非特异性扩增的干扰。同时结合不同荧光颜色组合标记扩增产物的编码序列，提升单一样本的信息采集通量，可准确获取多重肿瘤标志核酸信息，为肿瘤早期诊断、预后评估及治疗监测提供新思路。

Description

一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多重核酸指数扩增探针及基于其的肿瘤检测试剂盒和应用。

背景技术

肿瘤的发生发展是涉及多分子、多通路的高度复杂事件，全面准确的检测确定肿瘤需要同时对多重肿瘤标志核酸进行检测。

现有的核酸检测方法大多存在灵敏度低，低丰度靶标检测准确性差；同时，由于荧光信号形式单一且靶标特异引物间存在碱基偏好性与交叉干扰，难以在同体系内实现多靶标同时检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多重核酸指数扩增探针及基于其的肿瘤检测试剂盒和应用，以克服现有的核酸检测方法中存在的灵敏度低、特异性差、难以实现多重核酸指数扩增的缺点。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种多重核酸指数扩增探针，该多重核酸指数扩增探针是以靶标核酸为检测对象设计得到的能够使靶标核酸信号扩增放大并被检测的功能核酸链，包括一条识别探针链、一对通用扩增引物和一条具有荧光标记的信号探针链；

其中，所述识别探针链包括靶标识别区、反向引物延伸区、正向引物延伸区、正向引物识别区、反向引物识别区，不同识别探针链间只有靶标识别区不同，其余位置均为通用序列；

所述一对通用扩增引物，其中正向扩增引物3’端与识别探针链正向引物识别区互补，其余序列与正向引物延伸区相同，反向扩增引物3’端与识别探针链反向引物识别区相同，其余序列与反向引物延伸区互补；

所述具有荧光标记的信号探针链与识别探针链靶标识别区域序列互补(或相同)，5’端标有特定的荧光探针。

优选地，识别探针链的5’端和3’端分别有10～20个碱基与待检测核酸互补，能够在杂交识别后经连接酶连接形成环形模板。

优选地，识别探针与靶标核酸一一对应，通过多种识别探针链的设计实现多重靶标核酸的识别。

优选地，正向扩增引物3’端的15～25个碱基与与识别探针正向引物识别区域互补，在聚合酶作用下触发线性扩增，同时发生分子内自折叠形成茎环结构；反向扩增引物3’端的15～25个碱基与线性扩增产物互补，能够识别线性扩增产物在聚合酶作用下延伸生成哑铃环状结构；正向扩增引物识别哑铃环状结构一端的茎环结构在聚合酶作用下继续扩增延伸，同时哑铃环状结构以自身3’端为起点沿自身模板延伸再次形成茎环结构，该结构能够被反向扩增引物识别从而实现指数扩增。

优选地，所述的具有荧光标记的信号探针链在未结合识别序列时与互补的淬灭探针杂交，检测不到荧光；当遇到互补的区域时，荧光探针链与淬灭探针分离，能够检测到荧光。

本发明还公开了含有上述的多重核酸指数扩增探针的试剂盒，其特征在于，该试剂盒首先用于连接反应，使识别探针链成为环形模板，然后环形模板用于扩增反应，其中包括：

20μM识别探针链

T4 DNA连接酶(反应浓度为5U/μL)；

10×T4 DNA Ligase Buffer(500mM Tris-HCl(pH 7.5@25℃)，100mM MgCl₂，100mM DTT，10mM ATP)；

20μM正向扩增引物；

20μM反向扩增引物；

10×等温扩增缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，500mM KCl，10 0mM(NH₄)₂S0₄，20mM MgS0₄,1％Tween-20)；

10mM dNTPs；

5M甜菜碱；

100mM Mg²⁺；

10μM荧光探针；

H₂O；

Bst DNA聚合酶(反应浓度为0.2U/μL)。

所述试剂盒使用时，连接反应温度和时间为：先65℃，5min冷却室温1h打开识别探针链，然后16℃，2h完成连接反应，最后65℃，10min灭活酶。

所述试剂盒使用时，扩增反应温度和时间为：先65℃，3h完成指数扩增，然后80℃，20min灭活聚合酶。

本发明还公开了上述的多重核酸指数扩增探针在检测肿瘤多靶标中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明所述的多重核酸指数扩增探针实现了高灵敏地多重核酸指数扩增，信号放大效率大大增加。

2)本发明所述的多重核酸指数扩增探针仅需要一对通用引物便可实现多种肿瘤靶标核酸的指数扩增，避免多重引物种类不同或浓度过高对扩增体系的干扰，消除体系非特异性扩增的干扰。

3)本发明所述的多重核酸指数扩增探针可实现连接反应、扩增反应的一体化，实验方法过程简单易做，后续可发展为微流控一体化检测。

4)本发明可通过多重核酸指数扩增在同体系内实现肿瘤多靶标同时检测，经过简单修改设计以及对荧光信号排列组合，还可拓展应用于十种以上核酸标志物的同时检测，具有很好的临床实用价值与应用前景。

附图说明

图1为本发明的原理图；

图2为核酸指数扩增结果图；

图3为核酸指数扩增多目标核酸的多色荧光信号响应结果图；其中，(a)为 Tk1靶标核酸发生指数扩增时，Cy5作为信号探针检测得到的实时荧光曲线；(b) 为GAPDH靶标核酸发生指数扩增时，Texas Red作为信号探针检测得到的实时荧光曲线；(c)为PFN1靶标核酸发生指数扩增时，Hex作为信号探针检测得到的实时荧光曲线；

图4为Tk1、PFN1、GAPDH这三种肿瘤靶标核酸发生多重核酸指数扩增的结果图；其中，(a)为在同一体系中，Tk1发生指数扩增时Cy5作为信号探针标记到靶向核酸序列上得到的实时荧光曲线；(b)为在同一体系中，GAPDH发生指数扩增时Texas Red作为信号探针标记到靶向核酸序列上得到的实时荧光曲线； (c)为在同一体系中，PFN1发生指数扩增时Hex作为信号探针标记到靶向核酸序列上得到的实时荧光曲线。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中出现的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1，一种基于多重核酸指数扩增的获取多重肿瘤标志核酸信息的方法，包括以下步骤：

1)以靶标核酸为检测对象，设计能使其信号扩增放大并被检测的功能核酸链。包括：一条为识别探针链，其包括靶标识别区、反向引物延伸区、正向引物延伸区、正向引物识别区、反向引物识别区，不同识别探针链间只有靶标识别区不同，其余位置均为通用序列，识别探针链5’端标记有磷酸基团；一对通用扩增引物，其中正向扩增引物3’端与识别探针链的正向引物识别区互补，其余序列与正向引物延伸区相同，反向扩增引物3’端与线性扩增产物互补，其余序列与反向引物延伸区相同；还有一条带有特定荧光标记的信号探针链，其与靶标识别区核酸序列互补(或相同)，5’端标有特定荧光探针。

2)识别探针链5’端和3’端分别有15个碱基与靶标核酸互补，两者一一对应特异性识别杂交后，识别探针链在连接酶的作用下将其5’端的磷酸末端和3’羟基末端连接形成环形模板。

3)环形探针链与正向扩增引物3’端20个碱基互补，在聚合酶作用下触发线性扩增，同时发生分子内自折叠形成茎环结构；反向扩增引物3’端18个碱基与线性扩增产物互补，可识别线性扩增产物在聚合酶作用下延伸生成哑铃环状结构；正向扩增引物识别哑铃环状结构一端的茎环结构在聚合酶作用下继续扩增延伸，同时哑铃状结构以自身3’端为起点沿自身模板延伸再次形成茎环结构，该结构可被反向扩增引物识别从而实现指数扩增。

4)信号探针5’端标记特异荧光基团，在未结合识别序列时与互补的淬灭探针杂交，检测不到荧光，当体系内发生扩增，信号探针链遇到互补的区域时，荧光探针与淬灭探针分离，释放出荧光。

5)通过实时荧光仪器进行检测，实现同时对多种肿瘤靶标核酸的扩增和时时监测。

实施例1

选取MCF-7细胞中的mRNA Tk1作为肿瘤靶标核酸，合成与Tk1 mRNA序列相同的寡核苷酸模拟待测靶标，TK1 padlock反应浓度为500nM、待测靶标核酸Tk1反应浓度为100nM，反应65℃，5min、冷却室温1h；加入1μL 100U/μL T4 连接酶，反应16℃，2h，65℃，10min，使TK1 padlock连接成环形模板。取4μL 连接成环的TK1 padlock(反应浓度100nM)进行扩增，扩增反应体系共20μL，包括4μL上述连接成环的TK1 padlock，1μL 20μM正向扩增引物，1μL20μM反向扩增引物，2μL 10×等温扩增缓冲液；1μL 10mM dNTPs；5μL 5M甜菜碱；1μL 100mMMg²⁺；1μL 10μM荧光探针；2μL H₂O；2μL 2U/μL Bst DNA聚合酶进行反应65℃，3h，80℃，20min。

扩增结果如图2所示，图2中，黑色曲线是没有正向扩增引物、反向扩增引物不扩增的空白对照；红色曲线是只有正向引物发生线性滚环扩增的产物；蓝色曲线是正向引物、反向引物同时存在发生指数扩增的产物，从图中可以看出蓝色曲线比红色曲线上升的快且整体高于红色曲线。

实施例2

以MCF-7为例，选取MCF-7中具有重要临床意义的多种肿瘤靶标核酸进行检测(Tk1、PFN1、GAPDH)。连接反应、扩增反应实验过程如上所述，图3 中，(a)图为不同浓度Tk1指数扩增1h时，Cy5作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为20nM Tk1扩增后得到的荧光值，第三条红色柱为200nM Tk1扩增后得到的荧光值，从图中可以看出， Tk1浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。(b)图为不同浓度GAPDH指数扩增1h时，Texas Red作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为 20nM GAPDH扩增得到的荧光值，第三条红色柱为200nM GAPDH扩增得到的荧光值，从图中可以看出，GAPDH浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。(c)图为不同浓度PFN1指数扩增 1h时，Hex作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为20nM PFN1扩增得到的荧光值，第三条红色柱为200nM PFN1 扩增得到的荧光值，从图中可以看出，PFN1浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。图3说明该方法可通过指数扩增用于检测肿瘤核酸。

图4为Tk1、PFN1、GAPDH这三种肿瘤靶标核酸发生多重核酸指数扩增的结果图，(a)图为在同一体系中，不同浓度Tk1指数扩增1h时，Tk1作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为 20nM Tk1扩增得到的荧光值，第三条红色柱为200nM Tk1扩增得到的荧光值，从图中可以看出，Tk1浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。(b)图为在同一体系中，不同浓度GAPDH指数扩增1h时，Texas Red作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为20nM GAPDH扩增得到的荧光值，第三条红色柱为200nM GAPDH扩增得到的荧光值，从图中可以看出，GAPDH浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。(c) 图为在同一体系中，不同浓度PFN1指数扩增1h时，Hex作为信号探针检测得到的实时荧光值，左起第一条红色柱是空白对照，第二条红色柱为20nM PFN1扩增得到的荧光值，第三条红色柱为200nM PFN1扩增得到的荧光值，从图中可以看出，PFN1浓度越高，扩增得到的荧光值就越高，且空白对照荧光值明显低于靶标存在时的荧光值。图4说明该方法可在同一体系内，发生多重肿瘤核酸的指数扩增，由此可用于多重肿瘤核酸标志物的检测。

上述实施例中所涉及的相关引物序列如下表1所示：

表1

综上所述，为了发展高灵敏、高特异性地多重核酸指数扩增的肿瘤检测新方法，本发明方法引入通用引物。具体为：首先针对不同靶标核酸设计多种识别探针，探针两端分别与特定靶标核酸序列互补，可在杂交识别靶标后经连接酶连接形成环形模板；环形模板与其中一条扩增引物杂交后在聚合酶作用下发生滚环扩增；滚环扩增产物与另一条扩增引物杂交后在聚合酶作用下发生环介导的等温扩增。针对靶标核酸的不同识别探针之间只有与靶标核酸杂交的识别区域序列不同，其余位置均为通用序列。所以，所有经靶标特异性连接形成的多种环形模板均可以通过一对通用的扩增引物实现指数扩增，避免多重引物种类不同或浓度过高对扩增体系的干扰，消除体系非特异性扩增的干扰。同时结合不同荧光颜色组合标记扩增产物的编码序列，提升单一样本的信息采集通量，可准确获取多重肿瘤标志核酸信息，为肿瘤早期诊断、预后评估及治疗监测提供新思路。因此，本发明将待检测靶标核酸被相应识别探针特异性捕获，进而与通用引物识别杂交，在聚合酶作用下实现指数扩增，放大的信号被信号探针链标记释放出荧光，通过监测荧光信号实现同时对多种肿瘤靶标核酸的检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 一种多重核酸指数扩增探针及其肿瘤多靶标检测应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcacagaga aggaggtcga ggtgattggg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acacacaaac cattttattt tttgggccat 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccatccct tgtgcatatt tccagggaga 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcaccttg tcatgtacca tcaataaagt 30

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgccgacggg acgtaaacaa ctaggctgta ctgccaactg 40

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgggagtct ctcgtcccct tccgcgtaaa gagaggtgc 39

<210> 7

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccttctct gtgccgaagg ggacgagaga ctcccaacgc cgacgggacg taaacaacag 60

ttggcagtac agcctagccg cgtaaagaga ggtgccccaa tcacctcgac 110

<210> 8

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaatggtttg tgtgtaaggg gacgagagac tcccaacgcc gacgggacgt aaacaacagt 60

tggcagtaca gcctagccgc gtaaagagag gtgcatggcc caaaaaata 109

<210> 9

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcacaaggga tggggaaggg gacgagagac tcccaacgcc gacgggacgt aaacaacagt 60

tggcagtaca gcctagccgc gtaaagagag gtgctctccc tggaaatat 109

<210> 10

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catgacaagg tgcggaaggg gacgagagac tcccaacgcc gacgggacgt aaacaacagt 60

tggcagtaca gcctagccgc gtaaagagag gtgcacttta ttgatggta 109

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccaatcacc tcgacctcct tctctgtgcc 30

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaggaggtc gaggtgattg gg 22

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggcccaaa aaataaaatg gtttgtgtgt 30

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accattttat tttttgggcc at 22

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actttattga tggtacatga caaggtgcgg 30

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtcatgtac catcaataaa gt 22

Claims

1.一种多重核酸指数扩增探针，其特征在于，该多重核酸指数扩增探针是以靶标核酸为检测对象设计得到的能够使靶标核酸信号扩增放大并被检测的功能核酸链，包括一条识别探针链、一对通用扩增引物和一条具有荧光标记的信号探针链；

其中，所述识别探针链包括靶标识别区、反向引物延伸区、正向引物延伸区、正向引物识别区、反向引物识别区，不同识别探针链间只有靶标识别区不同，其余位置均为通用序列，且识别探针链5’端有磷酸基团标记，识别探针链的5’端和3’端分别有10~20个碱基与待检测核酸互补，能够在杂交识别后经连接酶连接形成环形模板；识别探针与靶标核酸一一对应，通过多种识别探针链的设计实现多重靶标核酸的识别；

所述一对通用扩增引物，其中正向扩增引物3’端与识别探针链正向引物识别区互补，其余序列与正向引物延伸区相同，反向扩增引物3’端与识别探针链反向引物识别区相同，其余序列与反向引物延伸区互补，正向扩增引物3’端的15~25个碱基与识别探针正向引物识别区域互补，在聚合酶作用下触发线性扩增，同时发生分子内自折叠形成茎环结构；反向扩增引物3’端的15~25个碱基与线性扩增产物互补，能够识别线性扩增产物在聚合酶作用下延伸生成哑铃环状结构；正向扩增引物识别哑铃环状结构一端的茎环结构在聚合酶作用下继续扩增延伸，同时哑铃环状结构以自身3’端为起点沿自身模板延伸再次形成茎环结构，该结构能够被反向扩增引物识别从而实现指数扩增；

所述具有荧光标记的信号探针链与识别探针链靶标识别区域序列互补，5’端标有特定的荧光探针；该具有荧光标记的信号探针链在未结合识别序列时与互补的淬灭探针杂交，检测不到荧光；当遇到互补的区域时，荧光探针链与淬灭探针分离，能够检测到荧光。

2.含有权利要求1所述的多重核酸指数扩增探针的试剂盒，其特征在于，该试剂盒首先用于连接反应，使识别探针链成为环形模板，然后环形模板用于扩增反应，其中包括：

20μM识别探针链；

T4 DNA连接酶，反应浓度为5U/μL；

10×T4 DNA Ligase Buffer，包括500mM Tris-HCl，pH值为7.5，25℃，100mM MgCl₂，100mM DTT，10mM ATP；

20μM正向扩增引物；

20μM反向扩增引物；

10×等温扩增缓冲液，包括200mM Tris-HCl，pH值为8.8，25℃，500mM KCl，100mM(NH₄)₂S0₄，20mM MgS0₄， 1% Tween-20；

10mM dNTPs；

5M甜菜碱；

100mM Mg²⁺；

10μM荧光探针；

H₂O；

Bst DNA聚合酶，反应浓度为0.2U/μL。

3.根据权利要求2所述的多重核酸指数扩增探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，连接反应温度和时间为：先在65℃下，5min，冷却室温，1h打开识别探针链，然后在16℃下，2h完成连接反应，最后在65℃下，10min灭活酶。

4.根据权利要求2所述的多重核酸指数扩增探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用时，扩增反应温度和时间为：先65℃，3h完成指数扩增，然后80℃，20min灭活聚合酶。