CN110195099B

CN110195099B - 一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用

Info

Publication number: CN110195099B
Application number: CN201910453561.XA
Authority: CN
Inventors: 赵永席; 赵越; 房晓星; 陈锋
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110195099A

Abstract

本发明公开了一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用，包括一对茎环结构探针和一对双链杂交结构探针；所述茎环结构探针，是将5'寡核苷酸链5'末端的互补序列通过C18 spacer与之连接，形成以C18为环且携带3'寡核苷酸突出单链的茎环结构探针；所述双链杂交结构探针，包括一条5'端标记荧光基团的长链和一条3'标记淬灭基团的短链，短链全长与长链部分互补，形成双链复合物。本发明设计的标记有多色荧光的结构核酸探针组合，可用于多靶标基因的同时检测，灵敏度高达1拷贝/微升；联合链置换热力学以及聚合酶动力学的双重调控，识别分辨率达到单核苷酸水平，实现了多基因并行检测中的单核苷酸变异的准确识别。

Description

一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用。

背景技术

多基因联合检测可同时获取多基因序列、位点以及丰度信息，全面获取样本特征，有效提高分析检测的可靠性与准确性，在生物研究及疾病诊断等领域具有重要意义。多重PCR扩增技术可在同一反应体系中采用多对特异性引物同时扩增多靶标序列，已被广泛应用于多基因联合检测。然而，多重PCR技术需依赖于可精确控温的热循环装置，难以满足人们对简单、便捷分子诊断技术的分析需求。

核酸等温扩增技术可在恒定温度下快速累积扩增产物，实现高效的信号放大，在现场分析与疾病诊断中表现出独特的优势，环介导的恒温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)作为一种典型的恒温指数扩增方法，可通过多引物特异性结合靶标的多个位点，在工具酶的作用下启动自循环链置换扩增，放大效率高达10⁶-10⁹倍，已广泛用于临床诊断。为了准确获取基因序列中的单核苷酸变异(single nucleotidevariation,SNV)信息，大量的研究已见报道。核酸链置换反应可根据入侵序列的不同调节反应速率以识别SNV位点，但由于单碱基差异产生的热力学能量变化较小，极易受到环境干扰，从而影响SNV识别准确性。等位基因特异性扩增方法利用聚合酶对引物3'端末端碱基与其模板形成互补结构的偏好性，设计等位基因特异性扩增引物，有效抑制错误引物延伸，通过聚合反应的动力学差异实现SNV位点检测。

然而，在现有的检测方法中，由于多重扩增体系涉及的引物种类多、浓度高，多靶标并行检测交叉干扰严重、靶标序列识别分辨率不足。因此，发展可在多基因并行检测中准确识别单核苷酸变异的方法依旧是个挑战。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多靶标基因并行检测组合探针及其试剂盒的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种多靶标基因并行检测组合探针，包括一对茎环结构探针和一对双链杂交结构探针；

所述茎环结构探针，是将5'寡核苷酸链5'末端的互补序列通过C18spacer与之连接，形成以C18为环且携带3'寡核苷酸突出单链的茎环结构探针；

所述双链杂交结构探针，包括一条5'端标记荧光基团的长链和一条3'标记淬灭基团的短链，短链全长与长链部分互补，形成双链复合物；

其中：

所述茎环结构探针能够特异性识别序列匹配的靶标基因，产生信号响应；

所述双链杂交结构探针的粘性末端完全与靶标序列互补，发生链置换作用，产生荧光信号。

茎环结构探针的3'寡核苷酸链保留了原本环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)体系线性引物的所有序列，并将5'末端的互补序列通过C18spacer与之连接，形成以C18为环、携带3'突出单链的茎环结构。标记于5'端的荧光基团与标记于探针内部的淬灭基团彼此靠近，通过荧光共振能量转移作用淬灭信号。其中3'突出单链可作为引物识别靶标基因并通过聚合延伸触发信号放大。

双链杂交结构探针的粘性末端完全与靶标序列互补，可发生链置换作用，产生较强的荧光信号。同时置换结合于靶标的长链探针可继续作为引物，加速富集靶标基因序列。

优选地，所述茎环结构探针中，5'寡核苷酸链长度为14个碱基，3'寡核苷酸链长度为40-44个碱基，且其中有14个碱基与5'寡核苷酸链互补，中间由C18 spacer连接链连接，在LAMP反应温度(60-65℃)的条件下形成3'末端携带有26-30个碱基单链的茎环结构；

标记于5'端的荧光基团与标记于探针内部的淬灭基团彼此靠近，通过荧光共振能量转移作用淬灭信号，当3'末端单链结合靶标时，即能够作为LAMP扩增内引物启动聚合反应，打开茎环结构产生荧光信号。

优选地，所述双链杂交结构探针中，5'端标记荧光基团的长链长度为30个碱基，3'标记淬灭基团的短链长度为24个碱基，短链全长24个碱基均与长链互补；

长链剩余的6个碱基作为粘性末端，与靶标发生链置换作用，打开双链杂交结构，产生信号，同时置换结合于靶标或其扩增产物的长链探针能够继续作为引物，加速富集靶标基因序列。

进一步优选地，长链剩余的6个碱基的末端位点对碱基错配极为敏感，通过对链置换热力学能量以及聚合酶动力学反应速率的调控，能够实现单核苷酸变异的位点高分辨率识别。

本发明还公开了上述的多靶标基因并行检测组合探针在检测临床样品中多靶标基因的应用。

如可用于临床血清样本中乙肝病毒多靶标基因(S基因与C基因)的并行检测，灵敏度达1拷贝/微升；同时根据基因序列中单核苷酸变异位点的差异，实现B型乙肝、C型乙肝与其他亚型乙肝的准确分型。

本发明还公开了上述的多靶标基因并行检测组合探针的试剂盒，包括：

1)基因I识别与扩增的引物

0.4μM正向外引物，0.4μM反向外引物；

1.2μM正向内引物，1.2μM反向内引物；

0.8μM正向环引物，0.8μM反向环引物；

2)基因II识别与扩增的引物

0.4μM正向外引物，0.4μM反向外引物；

1.2μM正向内引物，1.2μM反向内引物；

0.8μM正向环引物，0.8μM反向环引物；

3)信号组合探针

0.2μM FIP Hex，0.4μM LB-Cy5，0.4μM LB-Block BHQ2；

0.2μM BIP Tex，0.4μM LF FAM，0.4μM LF Block BHQ2；

4)其他反应组分，共30μL，pH值为8.8，包括：

20mM Tris-HCl；10mM KCl；10mM(NH₄)₂SO₄；6mM MgSO₄；0.8mM 0.1％Triton X-100；1M dNTPs；8U Bst 2.0

DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒的反应条件为：60-65℃作用3h，通过实时定量PCR仪采集数据，间隔时间2min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、设计的颈环探针与双链杂交探针结构稳定，作为体系信号来源特异性较高，不易因引物间相互作用产生非特异性扩增信号，提高扩增体系准确性与特异性。

2、颈环探针由C18spacer区域连接，可在形成茎环结构的同时阻断扩增延伸，保留了标准LAMP扩增产物自环化折叠的发卡结构，具有较强的指数扩增能力。

3、双链杂交探针将待区分的单核苷酸变异位点设计在长链粘性末端，可通过调控链入侵热力学能量以及聚合酶扩增动力学速率联合调控，准确识别SNV单位点差异。

4、信号探针组合标记四种不同荧光，可通过多通道信号同步采集在多基因并行检测中准确获取单核苷酸变异信息。

5、标记有多色荧光的结构核酸探针组合，可用于多靶标基因的同时检测，灵敏度高达1拷贝/微升；联合链置换热力学以及聚合酶动力学的双重调控，识别分辨率达到单核苷酸水平，实现了多基因并行检测中的单核苷酸变异的准确识别。

附图说明

图1为茎环探针结构示意图；

图2为双链杂交探针结构示意图；

图3为茎环探针扩增原理示意图；

图4为双链杂交探针的单核苷酸变异识别原理图；

图5为多靶标并行检测体系中茎环结构探针的浓度优化；

图6为多靶标并行检测体系中双链杂交结构探针的浓度优化；

图7为B型乙肝病毒的检测结果；

图8为C型乙肝病毒的检测结果；

图9临床样本中乙肝病毒的多基因检测与分型。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明设计的用于多靶标基因并行检测的探针，包括一对茎环结构探针和一对双链杂交结构探针，其中：

茎环探针结构示意图如图1所示，包括：5'寡核苷酸链、中部C18spacer连接链以及3'寡核苷酸链。该探针结构的3'寡核苷酸链保留了原本LAMP体系线性引物的所有序列，并将5'末端的互补序列通过C18spacer与之连接，形成以C18为环、携带3'突出单链的茎环结构。其扩增原理图如图3所示，标记于5'端的荧光基团与标记于探针内部的淬灭基团彼此靠近，通过荧光共振能量转移作用淬灭信号。当体系内存在靶标基因时，茎环探针3'沿模板延伸，延伸产物被置换解离后将结合新的引物，打开发卡结构。此时，荧光集团与淬灭集团分离，表现出较强的荧光信号。延伸过程在C18spacer区域被阻断，所得扩增产物基本与标准LAMP扩增体系一致，可得到分子内自折叠形成发卡结构，进入循环扩增阶段。由于该结构保留了标准LAMP扩增体系引物序列的所有特性，环引物与内引物可交替与环形部位结合。

双链杂交探针结构示意图如图2所示，包括：一条5'端标记荧光基团的长链(LF-FAM或LB-Cy5)与一条3'标记淬灭基团的短链(LF Block BHQ2或LB Block BHQ2)，短链全长与长链部分互补，形成双链复合物。双链杂交探针的单核苷酸变异识别原理图如图4所示，双链杂交探针的粘性末端完全与靶标序列互补，可发生链置换作用，产生较强的荧光信号。同时置换结合于靶标的长链探针可继续作为引物，加速富集靶标基因序列。若待测基因中含有单核苷酸变异位点，则长链的粘性末端与靶标识别区存在碱基错配，链置换竞争力较弱，链入侵动力学过程较慢。即便长时间反应后有少量链置换产物生成，其末端错配碱基也会严重影响聚合酶识别，无法作为引物启动后续的扩增反应。由此，通过双链杂交探针双重调控链置换热力学与聚合酶反应动力学过程，可有效分辨单核苷酸变异的区分。

茎环结构探针不仅是扩增反应的信号来源之一，还可作为扩增引物对靶标序列进行指数富集。然而，由于茎环结构探针识别特异性高，与线性引物相比位阻较大。为了获得最佳的扩增效果，对反应体系所使用的茎环结构探针浓度进行了系列优化，结果如图5所示，可以看出，0.2μM的茎环结构探针扩增效果最佳。双链杂交结构探针不仅可识别单核苷酸变异位点，还可作为扩增引物对靶标序列进行指数富集。然而，过多淬灭探针的引入不利于反应体系内荧光信号的实时采集。为了获得最佳的扩增效果，对反应体系所使用的双链杂交结构探针浓度进行了系列优化，结果如图6所示，0.4μM的双链杂交结构探针扩增效果最佳。

实施例1上述组合探针B型乙肝病毒的多靶标基因并行检测

结合图7所示的检测结果，通道1、2、3、4分别对应Tex、Hex、FAM、Cy5的荧光信号。当体系内存在B型乙肝时，FIP-Hex、BIP-Tex分别与靶标S基因与C基因作用，通道1、2均产生较强的荧光信号。LAMP的扩增产物与B型特异性的杂交结构探针(LF-FAM/LF Block BHQ2)的粘性末端完全互补，可产生较强的Toe-hold置换作用，通道3可采集较强的FAM荧光。同时置换结合的标记FAM荧光的探针可作为环引物定向加速B型乙肝S基因的扩增。由于B型乙肝与C型乙肝病毒基因组存在碱基差异，故上述LAMP扩增产物作用C型特异性的杂交结构探针(LB-Cy5/LB Block BHQ2)的能力较弱，故通道4不产生可读取信号。

实施例2上述组合探针可用于C型乙肝病毒的多靶标基因并行检测

结合图8所示的检测结果，通道1、2、3、4分别对应Tex、Hex、FAM、Cy5的荧光信号。当体系内存在C型乙肝时，FIP-Hex、BIP-Tex分别与靶标S基因与C基因作用，通道1、2均产生较强的荧光信号。LAMP的扩增产物与C型特异性的杂交结构探针(LB-Cy5/LB Block BHQ2)的粘性末端完全互补，可产生较强的Toe-hold置换作用，通道4可采集较强的FAM荧光。同时置换结合的标记Cy5荧光的探针可作为环引物定向加速C型乙肝S基因的扩增。由于B型乙肝与C型乙肝病毒基因组存在碱基差异，故上述LAMP扩增产物作用B型特异性的杂交结构探针(LF-FAM/LF Block BHQ2)的能力较弱，故通道3不产生可读取信号。

实施例3上述组合探针可用于临床血清样本中乙肝病毒的多靶标基因并行检测与分型

采集24例乙型肝炎患者血清样本各300μL，采用商品化试剂盒提取血清中的病毒基因组。经多通道信息有效整合，数据互相校验，可准确获取靶标定量以及分型的高质量数据。结果如图9所示：2号与14号样本为B型乙肝病毒，1号与11号样本为其他亚型乙肝病毒，其余均为C型乙肝病毒，上述结果与测序结果一致。

综上所述，本发明构建多重LAMP扩增体系，信号探针组合包括：一对茎环结构探针(FIP-Hex、BIP-Tex)、一对杂交结构探针(LF-FAM/LF Block BHQ2、LB-Cy5/LB BlockBHQ2)。

如下表1所示，以乙肝病毒为例，我们设计了可定向识别乙肝病毒S基因的茎环结构探针FIP-Hex，可定向识别乙肝病毒C基因的茎环结构探针BIP-Tex，可分辨B型乙肝单位点变异的杂交结构探针LF-FAM/LF Block BHQ2以及可分辨B型乙肝单位点变异的杂交结构探针LB-Cy5/LB Block BHQ2。经试验验证，通过多通道实时采集上述组合探针的荧光信号，可在乙肝病毒S基因与C基因并行检测的同时，准确分辨不同亚型乙肝的单位点变异。

表1

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种多靶标基因并行检测试剂盒，其特征在于，包括如下引物和信号探针：

。

2.根据权利要求1所述的多靶标基因并行检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：60～65℃作用3h，通过实时定量PCR仪采集数据，间隔时间2min。