CN114381500A - 一种基于双链特异性核酸酶和链置换反应的点突变检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体为一种点突变检测方法。本发明提供的检测方法结合了双链特异性核酸酶(DSN)和链置换反应的单碱基识别能力，在不对称PCR的产物中加入检测体系，实现对扩增产物的鉴定。该检测体系包括两条10‑15nt的寡核苷酸探针，其中一条核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团；待稳定后加入DSN，产生荧光信号。其中标记荧光探针与野生型基因完全互补，未标记荧光探针与突变型基因完全互补，两条探针部分重叠。本发明适用于单碱基突变检测，整个流程均可在实时荧光PCR仪上完成,特异性好，结果判定简单,具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种点突变检测方法，特别涉及一种不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法。
背景技术
单核苷酸突变(SNV)是由单个核苷酸改变引起的DNA突变，是人类基因组最常见、最稳定的一种突变形式。SNV影响着人类对疾病的易感性以及对病原体、药品、疫苗等的反应，影响着细菌对抗生素的耐药性等。因此对SNV的准确检测在疾病的风险性评估、诊断、治疗、实现精准医疗等方面具有重要价值。
目前，国内外用于检测SNV的技术基于不同的原理主要可划分为三类：核酸杂交，包括比较基因组杂交、荧光原位杂交和寡核苷酸微阵列分析等；聚合酶链式反应(PCR)包括实时定量PCR、等位基因特异性PCR、以及数字PCR等；以及新一代核酸测序技术。上述方法在基因检测上各具优点。但从临床诊断的角度来看，由于临床标本中通常同时存在野生型和突变型核酸，特别是在疾病的早期，大量野生型核酸的存在，使得突变型核酸所占比例常常很低，为低丰度突变核酸(<1％)，受测序技术和聚合酶本身属性的限制，很难直接从临床样本中检测出低丰度SNV。因此发展一种准确检测低丰度SNV的技术，可以为推广SNV检测在疾病的研究及临床诊断、治疗，推进精准医疗等方面提供强有力的技术手段。
本发明结合了双链特异性核酸酶(DSN)和链置换反应的单碱基识别能力，在不对称PCR的产物中加入检测体系，实现对扩增产物的鉴定。该检测体系包括两条10-15nt的寡核苷酸探针，其中一条核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团；待稳定后加入DSN，产生荧光信号。其中标记荧光探针与野生型基因完全互补，未标记荧光探针与突变型基因完全互补，两条探针部分重叠。本发明适用于单碱基突变检测，整个流程均可在实时荧光PCR仪上完成，特异性好，结果判定简单，具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是开发出一种简单、特异、灵敏检测点突变的方法。
具体技术方案如下：
一种不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法包括以下步骤：
(1)全血基因组DNA模板的提取
用全血基因组DNA提取试剂盒(天根)对全血进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)不对称PCR扩增
用2×Taq Master Mix(Vazyme，南京)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的2×Taq Master Mix,1μL的模板DNA，前引物浓度为10μM，加入体积为2μL，后引物浓度为1μM，加入体积为1μL。反应循环参数为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃60s，30个循环；72℃5min。
(3)点突变的检测
反应体系总体积为100μL，其中包括10μL PCR产物，10μL 10×DSN masterbuffer，10μL protector(1μM)，10μL invader(1μM)，0.2U DSN，最后ddH2O补充至100μL。反应条件为避光50℃孵育30min，最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
所述步骤(2)中反应总体系为50μL,具体为25μL的2×Taq Master Mix,1μL的模板DNA，前引物浓度为10μM，加入体积为2μL，后引物浓度为1μM，加入体积为1μL。反应循环参数为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 60s，30个循环；72℃5min。
所述步骤(3)中反应体系总体积为100μL，其中包括10μL PCR产物，10μL 10×DSNmaster buffer，10μL protector(1μM)，10μL invader(1μM)，0.2U DSN，最后ddH2O补充至100μL。反应条件为避光50℃孵育30min，最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
本发明建立了一种不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法。其检测原理为利用双链特异性核酸酶(DSN)和链置换反应的单碱基识别能力，在不对称PCR的产物中加入检测体系，实现对扩增产物的鉴定。该检测体系包括两条10-15nt的寡核苷酸探针，其中一条核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团；待稳定后加入DSN，产生荧光信号。其中标记荧光探针与野生型基因完全互补，未标记荧光探针与突变型基因完全互补，两条探针部分重叠。本发明适用于单碱基突变检测，整个流程均可在实时荧光PCR仪上完成，特异性好，结果判定简单，具有潜在的应用价值。
不对称PCR对此点突变检测方法的构建起着至关重要的作用，本发明首先对不对称PCR引物浓度比例进行了优化。如附图1所示，引物比例分别为1:1，1:5，1:10，1:20，1:50，1:100，在引物比例为1:20时，曲线呈线性，说明不对称PCR结果较好，产生了较多的单链。随后，对点突变检测的反应温度进行了优化，如附图2所示，在52.7℃时，DF值最高，在50℃左右DF值都表现良好，因此为方便检测，后续将反应温度定为50℃。
接下来是protector链的验证，如附图3所示，单独DSN酶处理，加入protector链时，只有完全匹配的曲线a才可以看到明显的动力学曲线。而在附图4中，没有加入protector链时，完全匹配的曲线a同样可以看到明显的动力学曲线，但是错配GT的曲线b、错配TT的曲线c、错配CT的曲线d的动力学都有了明显的信号，说明protector链的加入确实可以对错配碱基的信号进行抑制。
另外，还对protector链与模板的比例的进行了优化，如附图5所示，完全互补匹配之间的动力学曲线没有明显的差异。如附图6所示，错配碱基之间的动力学曲线却有一定的影响。
最后，则是对错配碱基与tohold之间距离的影响大小的探索。附图7为链置换快速进行的反应，可以看到除了空白之外，曲线之间的动力学信号区分度较小。附图8为较慢的可逆链置换反应，可以看到，错配碱基与tohold之间距离越大，信号受到的影响越小。
综上所述，我们证明了不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法的优越性，整个流程均可在实时荧光PCR仪上完成，特异性好，结果判定简单，具有潜在的单碱基突变检测的应用价值。
附图说明
图1是不对称PCR引物浓度比例的优化
图2是点突变检测反应温度的优化
图3是加入protector链的验证
图4是没有加入protector链的验证
图5是完全互补的protector链与模板的比例的优化
图6是错配的protector链与模板的比例的优化
图7是链置换快速进行时，错配碱基与tohold之间距离的信号差异
图8是链置换可逆进行时，错配碱基与tohold之间距离的信号差异
具体实施方式
一种不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，按以下步骤操作：(1)全血基因组DNA模板的提取
用全血基因组DNA提取试剂盒(天根)对全血进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)不对称PCR扩增
用2×Taq Master Mix(Vazyme，南京)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的2×Taq Master Mix,1μL的模板DNA，前引物浓度为10μM，加入体积为2μL，后引物浓度为1μM，加入体积为1μL。反应循环参数为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃60s，30个循环；72℃5min。
(3)点突变的检测
反应体系总体积为100μL，其中包括10μL PCR产物，10μL 10×DSN masterbuffer，10μL protector(1μM)，10μL invader(1μM)，0.2U DSN，最后ddH2O补充至100μL。反应条件为避光50℃孵育30min，最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
Claims (5)
1.一种不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法包括以下步骤：
(1)全血基因组DNA模板的提取
用全血基因组DNA提取试剂盒(天根)对全血进行基因组DNA的提取，将提取的DNA置于-20℃保存备用。
(2)不对称PCR扩增
用2×Taq Master Mix(Vazyme，南京)试剂盒进行扩增，反应总体系为50μL,具体为25μL的2×Taq Master Mix,1μL的模板DNA，前引物浓度为10μM，加入体积为2μL，后引物浓度为1μM，加入体积为1μL。反应循环参数为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃60s，30个循环；72℃5min。
(3)点突变的检测
反应体系总体积为100μL，其中包括10μL PCR产物，10μL 10×DSN master buffer，10μL protector(1μM)，10μL invader(1μM)，0.2U DSN，最后ddH2O补充至100μL。反应条件为避光50℃孵育30min，最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
2.如权利要求1所述的不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法步骤(2)中反应总体系为50μL,具体为25μL的2×Taq Master Mix,1μL的模板DNA，前引物浓度为10μM，加入体积为2μL，后引物浓度为1μM，加入体积为1μL。
3.如权利要求1所述的不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法步骤(2)中反应循环参数为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 60s，30个循环；72℃5min。
4.如权利要求1所述的不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法步骤(3)中反应体系总体积为100μL，其中包括10μL PCR产物，10μL 10×DSN master buffer，10μL protector(1μM)，10μL invader(1μM)，0.2U DSN，最后ddH2O补充至100μL。
5.如权利要求1所述的不对称PCR结合双链特异性核酸酶及链置换反应的点突变检测方法，其制备方法步骤(3)中反应条件为避光50℃孵育30min，最后用荧光分光光度计测量荧光信号。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220422 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |