CN107406891A - Pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产生靶序列的扩增子构建体的方法,该方法包括提供靶序列;寡核苷酸探针,其包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列;通用引物,其在3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列和进行聚合酶链式反应(PCR)。
Description
本发明涉及使用聚合酶链式反应(PCR)产生DNA或互补DNA(cDNA)靶序列的扩增子构建体的新方法。本发明的方法特别适于制备用于测序目的的DNA或cDNA靶序列。
PCR从DNA模板选择性地扩增靶序列,并且基本上由三个步骤组成:DNA模板的变性;引物与靶序列或侧接靶序列的序列的杂交;并通过DNA聚合酶延伸引物。传统上,通过凝胶电泳分析PCR产物(本文中称为扩增子),凝胶电泳是根据其分子量区分DNA序列的方法。然而,许多当代应用,例如大规模并行测序(也称为下一代测序或NGS)需要PCR扩增子掺入特异性修饰,通常以在其末端上的功能序列的形式。
存在用于产生掺入功能序列的扩增子的许多方法,但都具有诸如增加成本、处理复杂性、交叉污染潜力、遗留物(carry-over)或其组合的缺点。例如,常规的一步PCR方法包括向引物的5'末端加入功能序列,然后以正常方式进行PCR以将功能序列添加到扩增子的任一末端。然而,这种方法是麻烦和昂贵的,特别是当需要大量不同的功能序列时。此外,该方法不适用于复杂的组合或自动处理。
常规的两步PCR方法通常用于产生更复杂的构建体。在常规的两步PCR方法中,如上进行一级PCR步骤以在扩增子的任一末端添加“通用序列”。在一级PCR步骤中使用的引物包含与侧接靶序列的DNA序列互补的3'基因特异性序列和5'通用序列。然后使用在一级PCR中产生的扩增子作为模板进行二级PCR步骤。在二级PCR步骤中使用的引物被设计成使得它们的3'末端与来自一级PCR的扩增子的5'末端的通用序列互补并杂交。在二级PCR步骤中使用的引物通过适当的5'尾的阵列将所需的功能序列添加到扩增子中。该方法允许使用相对较小的引物组将功能序列的更复杂的组合添加到PCR扩增子中。
常规的两步PCR方法需要多个步骤,因此可能是麻烦的,特别是如果自动化液体处理不可用并且需要分析大量样品的情况下。另外,分开进行一级PCR和二级PCR步骤,将一级PCR步骤的产物用作二级PCR步骤中的模板。这需要开放的管和/或管转移。因此,存在交叉污染或遗留物的真正风险。由于PCR涉及指数扩增,即使低水平的污染物也可能具有难以检测的非常显著的效果,特别是当该过程用作敏感分析(如NGS)的准备步骤时。
此外,二级PCR步骤涉及使用“通用引物”,这样称呼它们是因为它们都包含与在一级PCR步骤中使用的引物的通用序列互补的序列。以这种方式,任何通用引物可以与包含适当通用序列的任何靶杂交。这种灵活性带来了扩增和随后查询(interrogation)错误的扩增子的风险增加。
在WO 2007/130967、WO 03/097794、WO 2012/054933和WO 02/14534中公开了两步PCR方法。
已经尝试通过在单个反应中组合一级和二级PCR步骤来简化常规的两步PCR方法。通过优化相对的一级和二级引物浓度和/或PCR反应条件,对于低复杂性构建体已经获得了有限的成功。然而,优化是耗时的,并且该方法不能稳健地产生诸如NGS所需的复杂扩增子构建体。
本发明提供了用于产生扩增子构建体、特别是复杂扩增子构建体的改进方法。与上述讨论的常规的两步PCR方法相反,有利地,本发明的方法可以在单个封闭管PCR中进行。此外,本发明的方法便宜且易于使用,增加靶向特异性,具有多重使用的潜力,并显著降低了扩增不适当的靶或附加不正确功能序列的机会。
本发明提供了产生靶序列的扩增子构建体的方法,该方法包括提供:
靶序列;
寡核苷酸探针,其包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列;
通用引物,其3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列;和
进行聚合酶链式反应(PCR)。
本发明提供使用聚合酶链式反应(PCR)产生靶序列的扩增子构建体的方法。在优选的实施方案中,使用本发明的方法产生的扩增子构建体是被加标签的,在于它们在一个或两个末端掺入侧接经扩增的靶序列的一个或多个功能序列和/或基团。功能序列和/或基团赋予扩增子构建体上的物理和/或化学性质,其可以在下游过程中被利用以进一步查询靶序列。本发明的方法特别适用于产生掺入适用于测序、例如下一代测序(NGS)的功能序列的扩增子构建体。尽管应当理解,本发明的方法可用于产生包含任何适合于其他查询目的的任何所需功能序列的扩增子构建体,包括但不限于法医学以及遗传性或感染性疾病的检测和诊断。
如上所讨论的,本发明的方法包括提供靶序列并通过PCR扩增靶序列。任何形式的PCR可以用于本发明的方法。例如,用于扩增DNA的传统形式的PCR,逆转录酶PCR(RT-PCR),用于扩增表达的DNA的PCR技术和实时PCR(qPCR),用于定量测量扩增的DNA的PCR技术,都是可以用于本发明的方法中的PCR形式。类似地,在本发明的方法中可以采用任何PCR热循环操作条件。
应当理解,为了对靶序列进行PCR,需要另外的试剂,并且这些试剂将根据所使用的PCR技术的类型而变化。例如,为了进行PCR,本发明的方法提供热稳定的DNA聚合酶(Taq聚合酶)和全部四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)。类似地,为了进行RT-PCR,提供了酶逆转录酶。然而,如下面将更详细地讨论的,本发明的方法不提供靶特异性引物。相反,通过本发明的方法原位产生靶特异性引物。
如上所讨论的,本发明的方法包括提供靶序列并通过PCR扩增靶序列。靶序列可以是DNA、cDNA或RNA序列。如果本发明的方法是为了提供cDNA靶序列,则可以在使用本发明的方法之前制备cDNA靶序列。可以使用酶逆转录酶和DNA聚合酶以已知方式从其相应的RNA序列制备cDNA靶序列。或者,可以从其相应的RNA序列原位制备cDNA序列,在这种情况下,本发明的方法提供相应的RNA序列,优选进行逆转录酶PCR(RT-PCR)。
DNA、cDNA或RNA靶序列可以衍生自任何生物体基因组的任何部分。例如,DNA、cDNA或RNA靶序列可以衍生自人基因组或其他动物基因组、植物基因组、真菌基因组、细菌基因组、病毒基因组和/或任何其他DNA分子。应当理解,DNA、cDNA或RNA序列可以作为DNA载体(例如质粒或病毒)的组成部分提供。还应当理解,DNA、cDNA或RNA靶序列可以作为不同DNA、cDNA或RNA靶序列的样品或以分离的形式提供。此外,应当理解,本发明的方法可以用于一次扩增一个特定的DNA、cDNA或RNA靶序列或几个不同的DNA、cDNA或RNA靶序列。
应当理解,本发明的方法可以用于同时产生多个不同DNA、cDNA和/或RNA靶序列的扩增子构建体。在这种情况下,可以对DNA、cDNA和/或RNA靶序列进行多重PCR。
如上所讨论的,本发明的方法包括提供DNA、cDNA或RNA靶序列并进行PCR。因此,本文中一般涉及的与本发明有关的“靶序列”包括DNA、cDNA或RNA靶序列。此外,除非另有说明,否则本文中一般涉及的与本发明有关的“PCR”包括所有类型的PCR和操作条件。
本发明的方法包括提供靶序列,寡核苷酸探针,通用引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。如将在下面更详细地讨论的,本发明的方法可用于在单PCR或一步反应中产生靶序列的扩增子构建体,更优选靶序列的加标签的扩增子构建体。应当理解,单PCR通常将包含一系列循环,每个循环由一系列定义的热孵育组成。
本发明的方法依赖于靶特异性引物的原位产生。在反应开始时,通用引物与寡核苷酸探针杂交并延伸以原位产生靶特异性引物。靶特异性引物可以通过存在于通用引物中的功能序列来包含任何所需的功能序列(以下将更详细地讨论)。寡核苷酸探针在该反应中不会耗尽,因此能够在PCR过程中在随后的多轮热循环中与其他通用引物进行催化作用并杂交以形成更多的靶特异性引物。一旦形成,靶序列由靶特异性引物扩增,以产生侧接有与原位产生的靶特异性引物中包含的序列相对应的序列的扩增子构建体。该方法的优点在于其能够在单PCR中形成复杂的扩增子构建体。
本发明的方法包括提供通用引物和寡核苷酸探针,其在PCR过程中相互作用以形成靶特异性引物。寡核苷酸探针可以是任何核酸序列或核酸序列的组合。在优选的实施方案中,寡核苷酸探针是单链DNA序列。其他实施方案可以使用完全或部分包含其它类型核酸(例如RNA或连接核酸(LNATM))的寡核苷酸探针
寡核苷酸探针不是靶特异性引物,因为它在其3'末端上不包含与靶序列的3'末端之一互补的序列或侧接靶序列的3'末端的序列。因此,探针不能与靶序列杂交。
如上所讨论的,寡核苷酸探针在其5'末端上或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列。朝向寡核苷酸探针的5'末端设置的序列将被解释为设置在寡核苷酸探针的5'末端部分内。
靶特异性序列可以是与靶序列的3'末端序列相同的序列或侧接靶序列的3'末端之一的序列。或者,靶特异性序列可以是与靶序列的3'末端序列基本相同的序列或侧接靶序列的3'末端之一的序列,使得所得靶特异性引物能够与靶特异性序列或侧接靶特异性序列的序列杂交。
寡核苷酸探针还包含能够使寡核苷酸探针与通用引物杂交的通用序列。通用序列可以是任何序列,只要其与位于通用引物上的序列充分互补,使得其可以与位于通用引物上的序列杂交。
通用序列可以位于寡核苷酸探针上的任何位置,而不是在其5'末端。具体地,通用序列可以位于寡核苷酸探针上在5'末端直至3'末端之间并包括3'末端的任何位置。在优选的实施方案中,通用序列位于寡核苷酸探针的3'末端上。
寡核苷酸探针可以包含一个或多个另外的序列。如果这些另外的序列形成一部分或整个通用序列,或者设置在通用序列的5'和靶特异性序列的3',则这些另外的序列的反向互补序列将存在于得到的原位产生的靶特异性引物中。如果存在另外的序列,则这些序列中的一个或多个可以是能够对所得靶特异性引物赋予化学和/或物理性质的功能序列。可以使用任何功能序列。合适的功能序列包括但不限于下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
在一个实施方案中,寡核苷酸探针的3'末端包含能够阻断聚合酶延伸的阻断基团。以这种方式,寡聚核苷酸探针的3'末端在PCR过程中不能通过聚合酶延伸。可以使用任何适合于阻断寡核苷酸3'末端的阻断基团。合适的阻断基团包括但不限于双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP's)和间隔区C3。这些基团是本领域已知的并且可商购获得。已经进行了实验以确定阻断基团的存在是否对于功能是有利的或者必需的,并且已经发现不是如此。然而,阻断基团可以防止由于探针延伸引起的不期望的后果,例如交叉杂交和/或干扰。这些实验的结果在实施例中更详细地讨论。因此,优选使用阻断基团,从而简化寡核苷酸探针的结构,并避免寡核苷酸探针延伸的任何不期望的后果。也可以通过设计寡核苷酸探针来防止寡核苷酸探针的延伸,使得其不与通用引物的3’末端互补。
寡核苷酸探针的长度由通用序列的长度、靶特异性序列和存在的任何另外的序列确定。优选地,通用序列和靶特异性序列的长度是分别赋予通用引物和靶序列杂交足够的特异性所需的最小长度。额外的长度可能导致不期望的交叉杂交二级结构和/或干扰。在优选的实施方案中,寡核苷酸探针包含至多100个核苷酸,更优选至多50个核苷酸,更优选20至50个核苷酸,还更优选30至40个核苷酸。
如上所讨论的,在本发明的方法中,提供寡核苷酸探针。然而,应当理解,可以提供两个或更多个探针,这些探针特异性针对靶序列的相同3'末端或侧接靶序列的3'末端之一的相同序列。或者,两个或更多个探针可以特异性针对靶序列的不同3'末端或侧接靶序列的不同3’末端的序列
在一个优选实施方案中,本发明的方法提供了一对第一和第二寡核苷酸探针。在该实施方案中,第一寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的3’末端序列之一或侧接靶序列的3’末端之一的序列,第二寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的另一3'末端序列或侧接靶序列的另一3'末端的序列。以这种方式,原位产生一对第一和第二靶特异性引物,这些引物能够向靶序列的两个末端添加功能序列。
在该方法提供一对第一和第二寡核苷酸探针的实施方案中,第一和第二寡核苷酸探针可以包含相同或不同的通用序列。优选地,一对第一和第二寡核苷酸探针包含不同的通用序列,以便将功能序列独立地附加到所得扩增子的每个末端。类似地,第一和第二寡核苷酸探针可以包含相同或不同的另外的序列和/或功能序列。优选地,第一和第二寡核苷酸探针包括不同的另外的序列,以增加可由任何一个靶序列形成的不同扩增子构建体的潜在数量。
如上所讨论的,本发明的方法包括提供通用引物和寡核苷酸探针,并进行PCR以产生能够扩增靶序列的靶特异性引物。通用引物与寡核苷酸探针的通用序列杂交,并在PCR中使用寡核苷酸探针的5'末端作为模板,通过DNA聚合酶进行延伸,以形成靶特异性引物。靶特异性引物是靶特异性的,因为它包含与靶序列的3'末端中的一个足够互补的3'序列或侧接靶序列的3'末端的序列,以便允许合适的引发特异性。
通用引物是单链核酸序列。可以使用任何核酸序列或核酸序列的组合。在优选的实施方案中,通用引物是单链DNA序列。其他实施方案可以使用全部或部分包含其它类型核酸(例如RNA或连接核酸(LNATM))的通用引物。
通用引物在其3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列。为了实现这一点,通用引物的3'末端与寡核苷酸探针的通用序列互补,或与寡核苷酸探针的通用序列充分互补以实现杂交。在PCR过程中,通用引物与寡核苷酸探针杂交,并使用寡核苷酸探针的5'末端作为模板进行延伸。所得到的原位产生的靶特异性引物的3'末端能够与靶序列的3'末端序列之一或侧接靶序列的3'末端之一的序列杂交并在进一步的PCR轮中通过聚合酶进行延伸。
在优选的实施方案中,通用引物还包含位于其5’末端或朝向其5’末端的一个或多个功能序列和/或基团。如上所讨论的,朝向通用引物的5'末端设置的功能序列和/或基团应被解释为设置在通用引物的5'末端部分内。功能序列和/或基团对所得到的靶特异性引物和扩增子构建体赋予化学和/或物理性质。可以使用任何功能序列和/或基团,并且这些将根据随后的所得扩增子的预期用途而变化。这样的功能序列的使用是本领域已知的。
例如,如果加标签的扩增子待在Illumina 仪器上测序,则通用引物优选包含样品特异性指数序列。通常在测序分析过程中使用这种类型的序列,以鉴定扩增子来自哪个样品。通用引物优选还包含衔接子序列,用于将扩增子与序列流通池(flow cell)杂交并在测序之前进行扩增子的初始(克隆)扩增。此外,对于该应用,寡核苷酸探针的通用序列优选与用于仪器上配对末端测序读数的测序引物互补。
其他类型的功能序列包括但不限于酶识别序列,用于样品鉴定的序列和用于下游分析应用的寡核苷酸结合序列。通用引物上的功能基团包括但不限于荧光标记和结合基团如生物素。
通用引物的长度由通用序列的长度和存在的任何另外的序列确定。在优选的实施方案中,通用引物包含至多200个核苷酸,更优选至多150个核苷酸,更优选50至100个核苷酸,还更优选70至100个核苷酸。
本发明的方法可以包括提供两种或更多种通用引物,它们能够与共同的寡核苷酸探针或不同的寡核苷酸探针杂交。在优选的实施方案中,提供一对第一和第二通用引物;各自包含能够分别与第一和第二寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列。在本发明方法提供一对第一和第二通用引物的实施方案中,第一和第二通用引物优选包含不同的功能序列和/或这些的组合和/或其组合,以便独立地附加功能序列和/或基团至所得到的扩增子的每个末端并且增加可以从任何一个靶序列形成的扩增子构建体的潜在数量。
在本发明方法的其它实施方案中,提供多个不同的寡核苷酸探针或探针对和通用引物或引物对以在单个多重反应中扩增多个不同的靶序列。
寡核苷酸探针和通用引物以合适的浓度比使用。通过常规实验可以容易地确定合适的浓度比。已经发现,相对于通用引物的浓度,优选提供更低浓度的寡核苷酸探针。
优选地,通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度比大于2:1,更优选大于5:1,还更优选大于10:1。在一个优选的实施方案中,通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度比可以为至多4000:1,更优选至多2000:1,还更优选至多1000:1,更优选至多500:1。
在优选的实施方案中,通用引物与寡核苷酸探针的相对浓度为10:1至300:1,更优选为12:1至275:1,还更优选15:1至265:1。通用引物与寡核苷酸探针的特别优选的相对浓度为16:1至256:1。
如上所讨论的,本发明的方法可用于在单PCR中产生靶序列的扩增子构建体。因此,并发反应没有PCR交叉污染的风险。然而,应当理解,本发明的方法也可以用于在两个分开的PCR步骤中产生靶序列的扩增子构建体。在第一PCR步骤中,靶寡核苷酸探针和通用引物制备靶特异性引物。在第二PCR步骤中,由第一PCR步骤产生的靶特异性引物扩增靶序列。
因此,在另一方面,本发明提供了制备用于从靶序列产生扩增子构建体的靶特异性引物的方法,该方法包括提供:
寡核苷酸探针,其包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上的序列的反向互补序列或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列;
通用引物,其在3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列;和
进行聚合酶链式反应。
关于本发明的第一方面,已经在上文中详细讨论了寡核苷酸探针和通用引物及其在PCR过程中相互作用以形成靶特异性引物的条件。一旦根据本发明另一方面的方法形成,靶特异性引物可用于在随后和分开的PCR中扩增靶序列以产生该靶序列的扩增子构建体,优选侧接有一个或多个功能序列。如上所述,靶序列可以是DNA、RNA或cDNA靶序列,并且可以衍生自任何生物体基因组的任何部分。
如上所述,应当理解,本发明的该另外的方面的方法可用于制备能够在一个末端或两个末端上用功能序列侧接靶序列的一对第一和第二靶特异性引物。为了制备一对第一和第二靶特异性引物,提供了一对第一和第二寡核苷酸探针和一对第一和第二通用引物。
还应当理解,本发明的该另外的方面的方法可以用于制备能够与不同靶序列或侧接不同靶序列的序列杂交的多个靶特异性引物。以这种方式,本发明的该另外的方面的方法可用于制备用于多重PCR的靶组特异性引物组。
如上所讨论的,本发明的方法可用于产生DNA、cDNA或RNA靶序列的扩增子构建体。如果该方法用于产生cDNA靶序列的扩增子构建体,则可以预先从其相应的RNA序列制备cDNA序列。或者,可以原位形成cDNA序列;在这种情况下,提供RNA序列并进行RT-PCR。一旦通过逆转录形成,cDNA在PCR过程中与靶特异性引物杂交并扩增。靶特异性引物也通过PCR原位形成。
然而,应当理解,本发明的方法也可用于直接从RNA靶序列产生cDNA扩增子构建体,cDNA扩增子构建体在一个末端或两个末端上包含一个或多个功能序列或基团,然后可将其根据需要进行分析或处理。
因此,在另一方面,本发明提供了从RNA靶序列产生cDNA扩增子构建体的方法,该方法包括提供:
靶特异性引物;
RNA靶序列;和
进行逆转录
其中靶特异性引物是根据本文中前述方法制备的。
上述关于本发明的第一方面详细描述了靶特异性引物及其如何由寡核苷酸探针和通用引物形成。如上所述,靶特异性引物可以在本发明的另一方面的方法中使用前预先通过PCR制备。或者,靶特异性引物可以原位制备。如果靶特异性引物要在原位制备,则本发明另一方面的方法还提供寡核苷酸探针和通用引物,如上文关于本发明的第一方面所讨论的进行PCR。通过PCR形成靶特异性引物后,可以对RNA靶序列进行逆转录反应。实际上,PCR反应和逆转录反应可以并行发生。
在本发明方法中提供的RNA靶序列可以来自任何生物基因组的任何部分,包括人基因组或其他动物基因组、植物基因组、真菌基因组、细菌基因组、病毒基因组和/或任何其他RNA分子。如上所述,应当理解,RNA靶序列可以作为不同RNA靶序列的样品或以分离的形式提供。此外,应当理解,本发明的方法可以用于一次扩增一个特定的RNA靶序列或几个不同的RNA靶序列。
如上所述,本发明的另一方面的方法需要对RNA靶序列进行逆转录。因此,应当理解,逆转录反应所需的其它试剂如酶逆转录酶是必需的。
在使用中,靶特异性引物结合RNA靶序列,并在逆转录反应过程中被逆转录酶延伸。可以通过PCR进一步扩增得到的cDNA。
在另一方面,本发明提供了用于制备DNA、cDNA或RNA靶特异性引物的寡核苷酸探针,寡核苷酸探针包含通用序列,并且在其5’末端上或朝向其5’末端包含能够与DNA、cDNA或RNA靶序列的3’末端之一的序列的反向互补序列或侧接DNA、cDNA或RNA靶的3’末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列。
关于本发明的第一方面,已经在上文中详细讨论了寡核苷酸探针、包括靶特异性序列和通用序列的组成部分。
现在将通过以下实施例来描述本发明的实施方案,其仅用于说明的目的。
实施例1
进行本发明的方法以产生用于在Illumina 仪器上进行测序的DNA靶序列的加标签的扩增子构建体。用于该测定的靶序列是人MUTYH基因(refSeq NM_001128425)的外显子7的一部分。该测定用于分析已知导致MUTYH相关性息肉病(MAP)的特异性突变(MUTYH:c.536A>G,p.Tyr179Cys)。
将一对第一和第二寡核苷酸探针与一对第一和第二通用引物一起设计成针对靶序列。使用的靶序列、第一和第二寡核苷酸探针以及第一和第二通用引物如图1所示。
参考图1,DNA序列通常表示为2。如图所示,DNA序列是双链的并且包含有义链4和互补反义链6;有义和反义链4和6在彼此相反的方向上运行。DNA序列2还包含根据本发明的方法用于扩增的靶序列8。序列10和12分别在有义链4和反义链6的3’末端上侧接靶序列。
第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针通常分别表示为14和16。如图所示,第一和第二寡核苷酸探针14和16是单链DNA序列,其各自包含能够与靶序列2的3'末端之一的反向互补序列杂交的靶特异性序列或侧接于靶序列2的3'末端之一的序列。具体地,第一寡核苷酸探针14包含与靶序列2的反义链6的序列12相同的序列18。类似地,第二寡核苷酸探针16包含与靶序列2的有义链4的序列10相同的序列20。寡核苷酸探针序列18和20以粗体突出显示。
如将在下面更详细地讨论的,第一和第二寡核苷酸探针14和16还包含通用序列22和24,以促进分别与第一和第二通用引物28和30的杂交。通用序列22和24是加下划线的。
第一和第二寡核苷酸探针14、16进一步包含阻断基团26,在其3’末端用于阻断PCR过程中的聚合酶延伸。
如图所示,第一通用引物28和第二通用引物30是单链DNA序列。第一通用引物28在其3'末端上包含与第一寡核苷酸探针14的通用序列22互补的序列32。类似地,第二通用引物30在其3’末端上包含与第二寡核苷酸探针16的通用序列24互补的序列34。序列32和34是加下划线的。
第一和第二通用引物28和30各自在其5'末端上分别包含功能序列36和38。功能序列36和38是可变的并且可以改变以适合所得到的加标签的扩增子将被修饰和/或分析的方法。为了在Illumina 仪器上进行测序,靶序列的扩增子必须在两个末端上侧接有不同功能序列的组合。那些序列可以选自由设计用于Illumina测序仪器如的不同序列的文库。具体地,测序衔接子P5可以与8个样品特异性指数序列(A501-A507)中的一个组合使用。此外,测序衔接子P7可以与12个样品特异性指数序列(A701-A712)中的一个组合使用。测序衔接子用于流通池杂交和桥联扩增,并且使用样品特异性指数序列来鉴定从哪个样品得到测序读数。
在实施例1中,功能序列36包含与样品特异性指数序列A501组合的P5测序衔接子。此外,功能序列38包含与样品特异性指数序列A701组合的P7测序衔接子。
第一和第二通用引物28和30还分别朝向其5'末端包含功能序列50和52。功能序列50和52也是可变的并且可以被改变以适合所得的加标签的扩增子将被修饰和/或分析的方法。为了在Illumina 仪器上进行测序,靶序列的扩增子必须在两个末端上侧接有测序引物结合位点S1和S2。测序引物结合位点用于在测序过程中杂交用于不同测序读数的引物。
在实施例1中,功能序列50包括测序引物结合位点S1,功能序列52包含测序引物结合位点S2。
如前所讨论的,本发明的方法能够在单个PCR反应顺序中产生靶序列的加标签的扩增子构建体。反应顺序由两个反应组成:第一反应是第一和第二寡核苷酸探针14和16与第一和第二通用引物28和30之间的反应,以产生第一和第二靶特异性引物,第二反应是第一和第二靶特异性引物与靶序列或紧邻侧接靶序列的序列之间的反应,以产生靶序列的加标签的扩增子构建体。一旦形成来自第一反应的产物,它们立即可用作第二反应的组分。因此,第一和第二反应同时发生。图2和图3分别示出了单个反应顺序中的第一和第二反应。
使用 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(New England Biolabs,产品编号:M0494L)和终浓度为2ng/ul的基因组DNA进行本发明的方法,以扩增人MUTYH基因(refSeq NM_001128425)的外显子7。反应热循环如下:
步骤1:98℃30秒
步骤2:40个循环:
98℃10秒
60℃20秒
72℃20秒
步骤3:72℃5分钟
图2说明了该反应顺序的第一反应。为了简单起见,第一和第二通用引物28和30的功能序列36和38已被替换为字母“N”。
如图所示,第一和第二寡核苷酸探针14和16的通用序列22和24分别与第一和第二通用引物28和30的序列32和34杂交。在PCR过程中,使用序列18和20作为模板,通过DNA聚合酶在所示方向延伸通用引物28和30。
所得到的第一和第二靶特异性引物40和42显示在图3中。靶特异性引物40和42分别包含与DNA序列2的3'序列12和10互补的3'序列44和46。因此,第一和第二靶特异性引物40和42能够分别与DNA序列2的序列12和10杂交。在PCR过程中,使用靶序列8作为模板,通过DNA聚合酶延伸第一和第二靶特异性引物40和42。以这种方式,靶序列被扩增,并且用来源于非靶特异性引物28和30的序列对所得到的扩增子构建体在两个末端上加标签。
所得到的加标签的扩增子构建体通常表示为48。为了简单起见,未显示整个扩增子序列。未示出的序列由虚线表示。
扩增子构建体48在Illumina 系统上进行测序以证实正确的靶序列被扩增。扩增子构建体48对应于正确的靶序列。
实施例2
图4a至4d示出了对根据本发明的方法从不同DNA靶序列获得的DNA片段进行凝胶电泳的结果。
如上所讨论的,在PCR过程中,通用引物和寡核苷酸探针相互作用以形成靶特异性引物,其进而能够扩增靶序列。进行实验以确定寡核苷酸探针与靶特异性引物的最佳浓度比。
将4对第一和第二寡核苷酸探针设计针对衍生自人基因组的4种不同DNA靶序列(本文称为靶序列W、X、T和U)。设计了单对第一和第二通用引物以能够与4对第一和第二寡核苷酸探针杂交。
靶序列W、X、T和U是来自人基因组的基因的片段(section)如下:
W:NRAS基因(refseq NM_002524.4)的外显子2
X:NRAS基因(refseq NM_002524.4)的外显子3
T:KRAS基因(refseq NM_004985.3)的外显子3
U:KRAS基因(refseq NM_004985.3)的外显子2
在一系列浓度比,对每个靶序列重复若干次本发明的方法。每一次,通用引物的浓度保持恒定,但降低寡核苷酸探针的浓度。
使用Hot Start High-Fidelity 2X Master (New England Biolabs,产品编号:M0494L)和终浓度为2ng/ul的人基因组DNA进行本发明的方法。反应热循环如下:
步骤1:98℃30秒
步骤2:40个循环:
98℃10秒
60℃20秒
72℃20秒
步骤3:72℃5分钟
使用Agilent Bioanalyzer DNA 1000试剂盒对每个靶序列的每个反应产生的扩增子构建体进行解析。为了确定靶序列是否已经通过本发明的方法成功扩增,扩增子的碱基对中的预期长度是针对DNA的可见条带进行外推的。发现在寡核苷酸探针的浓度范围为2fmol/ul至117amol/ul,通用引物的浓度为30fmol/ul的情况下,获得了更高浓度的所需扩增子构建体。这相当于16:1至256:1的通用引物与寡核苷酸探针的最佳浓度比。使用通用引物与寡核苷酸探针的最佳浓度比的那些反应的结果示于图4a至4d中。
如图4a至4d所示,当寡核苷酸探针的浓度范围为2fmol/ul至117amol/ul并且通用引物的浓度为30fmol/ul时,通过本发明的方法成功形成靶序列W、X、T和U的扩增子构建体。
实施例3
图5至图6显示对根据本发明的方法从不同DNA靶序列获得的DNA片段进行凝胶电泳结果。
另外20对第一和第二寡核苷酸探针被设计针对另外20个DNA靶序列(本文中称为序列A至S和V)。如上所讨论的,将单对第一和第二通用引物设计为能够与20对第一和第二寡核苷酸探针杂交。
使用落入由实施例2获得的最佳浓度(通用引物浓度:30fmol/ul,寡核苷酸探针浓度:1fmol/ul)的浓度比对全部24个靶序列(来自实施例2的序列W、X、T和U和来自实施例3的序列A至S和V)进行本发明的方法。
所有寡核苷酸探针对在其3’末端上包含阻断基团。
使用 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(New England Biolabs,产品编号:M0494L)和终浓度为2ng/ul的人基因组DNA进行本发明的方法。反应热循环如下:
步骤1:98℃30秒
步骤2:40个循环:
98℃10秒
60℃20秒
72℃20秒
步骤3:72℃5分钟
如上所讨论的,使用Agilent Bioanalyzer DNA 1000试剂盒解析产生的扩增子构建体,并将它们在碱基对中的预期大小针对已知大小的DNA的可见条带外推。每个扩增子构建体的碱基对中的近似基因组位置和预期大小如下:
靶 | 基因 | 外显子 | RefSeq | 预期大小(bp) |
A | HFE | 2 | NM_000410 | 241 |
B | HFE | 4 | NM_000410 | 220 |
C | MUTYH | 7 | NM_001128425 | 191 |
D | MUTYH | 13 | NM_001128425 | 249 |
E | FGFR3 | 7 | NM_000142 | 222 |
F | FGFR3 | 9 | NM_000142 | 243 |
G | FGFR3 | 12 | NM_000142 | 201 |
H | FGFR3 | 14 | NM_000142 | 261 |
I | FGFR3 | 18 | NM_000142 | 229 |
J | F2 | 14 | NM_000506 | 242 |
K | F5 | 10 | NM_000130 | 194 |
L | SERPINA1 | 5 | NM_000295 | 210 |
M | SERPINA1 | 3 | NM_000295 | 219 |
N | JAK2 | 14 | NM_004972 | 218 |
O | BRAF | 15 | NM_004333 | 243 |
P | EGFR | 18 | NM_005228 | 275 |
Q | EGFR | 19 | NM_005228 | 233 |
R | EGFR | 20 | NM_005228 | 293 |
S | EGFR | 21 | NM_005228 | 263 |
T | KRAS | 3 | NM_004985 | 206 |
U | KRAS | 2 | NM_004985 | 209 |
V | NPM1 | 11 | NM_002520 | 285 |
W | NRAS | 2 | NM_002524 | 269 |
X | NRAS | 3 | NM_002524 | 225 |
如所显示的,当实施例2所获得的最佳浓度比(通用引物浓度:30fmol/ul,寡核苷酸探针的浓度:1fmol/ul)时,通过本发明的方法成功形成靶序列A至X的扩增子构建体。
实施例4
图7显示对根据本发明的方法从不同DNA靶序列获得的DNA片段进行凝胶电泳结果。
另外4对第一和第二寡核苷酸探针被设计针对另外4个DNA靶序列(本文中称为序列C-NB、N-NB、W-NB和X-NB)。
C-NB:JAK2基因(refseq NM_004972.3)的外显子14
N-NB:MUTYH基因(refseq NM_001128428)的外显子7
W-NB:NRAS基因(refseq NM_002524.4)的外显子2
X-NB:NRAS基因(refseq NM_002524.4)的外显子3
再次,将单对第一和第二通用引物设计为能够与4对第一和第二寡核苷酸探针杂交。使用从实施例2获得的最佳浓度比(通用引物浓度:30fmol/ul,寡核苷酸探针的浓度:1fmol/ul)对全部4个靶序列进行本发明的方法。
4对寡核苷酸探针被设计为没有带有阻断基团,以确定是否影响本发明方法的性能。
使用 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(New England Biolabs,产品编号:M0494L)和终浓度为2ng/ul的人基因组DNA进行本发明的方法。反应热循环如下:
步骤1:98℃30秒
步骤2:40个循环:
98℃10秒
60℃20秒
72℃20秒
步骤3:72℃5分钟
如上所讨论的,使用Agilent Bioanalyzer DNA 1000试剂盒解析产生的扩增子构建体,并将它们在碱基对中的预期大小针对已知大小的DNA的可见条带外推。每个扩增子构建体的碱基对中的预期大小如下:
靶 | 预期大小(bp) |
C-NB | 191 |
N-NB | 218 |
W-NB | 269 |
X-NB | 225 |
如所显示的,当实施例2所获得的最佳浓度比(通用引物浓度:30fmol/ul,寡核苷酸探针的浓度:1fmol/ul)时,通过本发明的方法成功形成靶序列C-NB、N-NB、W-NB和X-NB的扩增子构建体。
产生的所有4个扩增子构建体在Illumina 系统上进行测序以证实扩增正确的靶序列。所有4个扩增子构建体对应于正确的靶序列。因此,阻断基团的存在或不存在不影响该方法的性能。
Claims (73)
1.一种用于产生靶序列的扩增子构建体的方法,该方法包括提供:
靶序列
寡核苷酸探针,其包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列;
通用引物,其在3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列;和
进行聚合酶链式反应(PCR)。
2.根据权利要求1的方法,其中靶序列是DNA、cDNA或RNA序列。
3.根据权利要求1或2中任一项的方法,其中靶序列包含cDNA靶序列,该cDNA靶序列通过在对应于cDNA靶序列的RNA序列上进行逆转录酶PCR(RT-PCR)而原位形成。
4.根据前述权利要求中任一项的方法,其中对多个不同靶序列进行多重PCR。
5.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针是单链DNA序列。
6.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的靶特异性序列与靶序列的3'末端之一上或侧接靶序列的3'末端之一的序列相同。
7.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的通用序列与位于通用引物上的序列充分互补。
8.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的通用序列位于寡核苷酸探针的3'末端上。
9.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针包含一个或多个另外的序列。
10.根据权利要求9的方法,其中一个或多个另外的序列设置在通用序列的5'和靶特异性序列的3'。
11.根据权利要求9或10中任一项的方法,其中一个或多个另外的序列是功能序列。
12.根据权利要求11的方法,其中一个或多个功能序列选自下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
13.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的3'末端包含能够阻断聚合酶延伸的阻断基团。
14.根据权利要求13的方法,其中阻断基团是双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或间隔区C3。
15.根据前述权利要求中任一项的方法,其中寡核苷酸探针包含20至50个核苷酸。
16.根据前述权利要求中任一项的方法,其中通用引物是单链DNA序列。
17.根据前述权利要求中任一项的方法,其中通用引物的3'末端与寡核苷酸探针的通用序列互补。
18.根据前述权利要求中任一项的方法,其中通用引物在其5'末端或其5'末端部分中包含一个或多个功能序列和/或基团。
19.根据权利要求18的方法,其中一个或多个功能序列选自下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
20.根据权利要求19的方法,其中一个或多个基团选自荧光标记和结合基团。
21.根据前述权利要求中任一项的方法,其中通用引物包含50至100个核苷酸。
22.根据前述权利要求中任一项的方法,其中提供了一对第一和第二寡核苷酸探针,第一寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的3’末端序列之一或侧接靶序列的3’末端之一的序列,第二寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的另一3'末端序列或侧接靶序列的另一3'末端的序列。
23.根据权利要求22的方法,其中第一和第二寡核苷酸探针包含不同的通用序列。
24.根据权利要求22或23中任一项的方法,其中提供一对第一和第二通用引物,第一通用引物包含能够与第一寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列,第二通用引物包含能够与第二寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列。
25.根据权利要求24的方法,其中第一和第二通用引物包含不同的功能序列和/或基团。
26.根据前述权利要求中任一项的方法,其中提供多个不同的寡核苷酸探针或探针对和通用引物或引物对以通过多重PCR扩增多个不同的靶序列。
27.根据前述权利要求中任一项的方法,其中相对于通用引物的浓度以较低浓度提供寡核苷酸探针。
28.根据权利要求27的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比大于10:1。
29.根据权利要求28的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比为12:1至275:1。
30.根据权利要求29的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比为16:1至256:1。
31.根据前述权利要求中任一项的方法,其中靶序列的扩增子构建体进一步测序。
32.一种制备用于从靶序列产生扩增子构建体的靶特异性引物的方法,该方法包括提供:
寡核苷酸探针,其包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上的序列的反向互补序列或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列;
通用引物,其在3'末端上包含能够与寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列;和
进行聚合酶链式反应。
33.根据权利要求32的方法,其中寡核苷酸探针是单链DNA序列。
34.根据权利要求32或33中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的靶特异性序列与靶序列的3'末端之一上或侧接靶序列的3'末端之一的序列相同。
35.根据权利要求32至34中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的通用序列与位于通用引物上的序列充分互补。
36.根据权利要求32至35中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的通用序列位于寡核苷酸探针的3'末端上。
37.根据权利要求32至36中任一项的方法,其中寡核苷酸探针包含一个或多个另外的序列。
38.根据权利要求37的方法,其中一个或多个另外的序列设置在通用序列的5'和靶特异性序列的3'。
39.根据权利要求37或38的方法,其中一个或多个另外的序列是功能序列。
40.根据权利要求39的方法,其中一个或多个功能序列选自下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
41.根据权利要求32至40中任一项的方法,其中寡核苷酸探针的3'末端包含能够阻断聚合酶延伸的阻断基团。
42.根据权利要求41的方法,其中阻断基团是双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或间隔区C3。
43.根据权利要求32至42中任一项的方法,其中寡核苷酸探针包含20至50个核苷酸。
44.根据权利要求32至43中任一项的方法,其中通用引物是单链DNA序列。
45.根据权利要求32至44中任一项的方法,其中通用引物的3'末端与寡核苷酸探针的通用序列互补。
46.根据权利要求32至45中任一项的方法,其中通用引物在其5'末端或其5'末端部分中包含一个或多个功能序列和/或基团。
47.根据权利要求46的方法,其中一个或多个功能序列选自下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
48.根据权利要求46的方法,其中一个或多个功能基团选自荧光标记和结合基团。
49.根据权利要求32至48中任一项的方法,其中通用引物包含50至100个核苷酸。
50.根据权利要求32至49中任一项的方法,其中提供了一对第一和第二寡核苷酸探针,第一寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的3’末端序列之一或侧接靶序列的3’末端之一的序列,第二寡核苷酸探针包含靶特异性序列,该靶特异性序列特异性针对靶序列的另一3'末端序列或侧接靶序列的另一3'末端的序列。
51.根据权利要求50的方法,其中第一和第二寡核苷酸探针包含不同的通用序列。
52.根据权利要求50或51的方法,其中提供一对第一和第二通用引物,第一通用引物包含能够与第一寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列,第二通用引物包含能够与第二寡核苷酸探针的通用序列杂交的序列。
53.根据权利要求52的方法,其中第一和第二通用引物包含不同的功能序列和/或基团。
54.根据权利要求32至53中任一项的方法,其中相对于通用引物的浓度以较低浓度提供寡核苷酸探针。
55.根据权利要求54的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比大于10:1。
56.根据权利要求55的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比为12:1至275:1。
57.根据权利要求56的方法,其中通用引物的浓度与寡核苷酸探针的浓度之比为16:1至256:1。
58.根据权利要求32至57中任一项的方法,其中靶特异性引物用于通过PCR扩增DNA、cDNA或RNA靶序列。
59.一种从RNA靶序列产生cDNA扩增子构建体的方法,该方法包括提供:
靶特异性引物;
RNA靶序列;和
进行逆转录;
其中靶特异性引物是根据权利要求32至58中任一项的方法制备的。
60.根据权利要求59的方法,其中原位制备靶特异性引物。
61.根据权利要求59或60中任一项的方法,其中通过PCR进一步扩增cDNA扩增子构建体。
62.一种用于制备靶特异性引物的寡核苷酸探针,寡核苷酸探针包含通用序列,并且在其5'末端或朝向其5'末端包含能够与靶序列的3'末端之一上的序列的反向互补序列或者侧接靶序列的3'末端之一的序列的反向互补序列杂交的靶特异性序列。
63.根据权利要求62的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针是单链DNA序列。
64.根据权利要求62或63的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针的靶特异性序列与靶序列的3'末端之一上或侧接靶序列的3'末端之一的序列相同。
65.根据权利要求62至64中任一项的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针的通用序列与位于通用引物上的序列充分互补。
66.根据权利要求62至65中任一项的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针的通用序列位于寡核苷酸探针的3'末端上。
67.根据权利要求62至66中任一项的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针包含一个或多个另外的序列。
68.根据权利要求67的寡核苷酸探针,其中一个或多个另外的序列设置在通用序列的5'和靶特异性序列的3'。
69.根据权利要求67或68中任一项的寡核苷酸探针,其中一个或多个另外的序列是功能序列。
70.根据权利要求69的寡核苷酸探针,其中一个或多个功能序列选自下游寡核苷酸结合位点、限制酶识别位点和反应鉴定序列。
71.根据权利要求62至70中任一项的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针的3'末端包含能够阻断聚合酶延伸的阻断基团。
72.根据权利要求71的寡核苷酸探针,其中阻断基团是双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或间隔区C3。
73.根据权利要求62至72中任一项的寡核苷酸探针,其中寡核苷酸探针包含20至50个核苷酸。
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