JP2018507706A - Pcr方法 - Google Patents
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Abstract
Description
標的配列;
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行すること
を含む方法を提供する。
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうちの1つの配列の逆相補体または標的配列の3’末端のうちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、オリゴヌクレオチドプローブの汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法を提供する。
標的特異的プライマー;
RNA標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含む方法を提供し、標的特異的プライマーは本明細書で上に記載される方法によって調製される。
本発明の方法は、Illumina MiSeq(登録商標)装置での配列決定のためにDNA標的配列のタグ付きのアンプリコン構築物を生成するために実行された。このアッセイのための標的配列は、ヒトMUTYH遺伝子(refSeq NM_001128425)のエクソン7の一部である。このアッセイは、MUTYH関連のポリポーシス(MAP)を引き起こすことが知られている特異的突然変異(MUTYH:c.536A>G、p.Tyr179Cys)を分析するために使用される。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
図2は、反応シーケンスの第1の反応を例示する。簡潔に示すために、第1および第2の汎用性プライマー28および30の機能性配列36および38は、文字「N」で置き換えた。
図4a〜4dは、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
W:NRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_002524.4)
X:NRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_002524.4)
T:KRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_004985.3)
U:KRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_004985.3)
各標的配列に対して様々な濃度比で、本発明の方法を数回繰り返した。各回、汎用性プライマーの濃度は一定にしておいたが、オリゴヌクレオチドプローブの濃度は減少させた。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
各標的配列の反応の各々から生成したアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA 1000キットを使用して展開した。標的配列が本発明の方法によって首尾よく増幅されたかどうか立証するために、塩基対でのアンプリコンの予想される長さを、DNAの視認可能なバンドに対して外挿した。オリゴヌクレオチドプローブの濃度が2fmol/μlから117amol/μlの範囲内であり、汎用性プライマーの濃度が30fmol/μlであった場合に、必要とされるアンプリコン構築物のより高い濃度が得られることが判明した。これは、16:1から256:1の汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比に等しい。汎用性プライマー対オリゴヌクレオチドプローブの最適な濃度比が使用された反応の結果を、図4a〜4dに示す。
図5〜6は、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片でのゲル電気泳動の結果を示す。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA1000キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのDNAの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々のおよそのゲノム位置および塩基対での予想サイズは、以下の通りであった:
図7は、本発明の方法により異なるDNA標的配列から得られたDNA断片のゲル電気泳動の結果を示す。
C−NB:JAK2遺伝子のエクソン14(refseq NM_004972.3)
N−NB:MUTYH遺伝子のエクソン7(refseq NM_001128428)
W−NB:NRAS遺伝子のエクソン2(refseq NM_002524.4)
X−NB:NRAS遺伝子のエクソン3(refseq NM_002524.4)
再び、第1および第2の汎用性プライマーの単一の対を、4対の第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることが可能なように設計した。本発明の方法は、実施例2から得られた最適な濃度比(汎用性プライマーの濃度:30fmol/μlおよびオリゴヌクレオチドプローブの濃度:1fmol/μl)を使用して、全4つの標的配列に対して実行した。
ステップ1:98℃で30秒間
ステップ2:以下を40サイクル:
98℃で10秒間
60℃で20秒間
72℃で20秒間
ステップ3:72℃で5分間
上記のように、生成されたアンプリコン構築物は、Agilent Bioanalyzer DNA1000キットを使用して展開し、塩基対でのそれらの予想サイズを既知のサイズのDNAの視認可能なバンドに対して外挿した。アンプリコン構築物の各々の塩基対での予想サイズは、以下の通りであった:
Claims (73)
- 標的配列のアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的配列;
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行すること
を含む方法。 - 前記標的配列がDNA、cDNAまたはRNA配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列がcDNA標的配列を含み、前記cDNA標的配列が前記cDNA標的配列に対応するRNA配列に対して逆転写酵素PCR(RT−PCR)を実行することによってin situで形成される、請求項1または2のいずれかに一項に記載の方法。
- 複数の異なる標的配列に対して多重PCRが実行される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNA配列である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端のうちの1つまたはそれに隣接する配列と同一である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、請求項9に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項9または10のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、請求項13に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが一本鎖DNA配列である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端の配列のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項22に記載の方法。
- 第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項22または23のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、請求項24に記載の方法。
- 複数の異なる標的配列を多重PCRによって増幅するために、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ対および汎用性プライマーまたはプライマー対が提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、請求項27に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、請求項28に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、請求項29に記載の方法。
- 前記標的配列の前記アンプリコン構築物がさらに配列決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 標的配列からアンプリコン構築物を生成するのに使用するための標的特異的プライマーを調製するための方法であって、
汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、前記標的配列の3’末端のうちの1つにおける配列の逆相補体または前記標的配列の3’末端うちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ;
その3’末端に、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む汎用性プライマー
を提供すること、および
ポリメラーゼ連鎖反応を実行すること
を含む方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖DNA配列である、請求項32に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端の配列またはそれに隣接する配列と同一である、請求項32または33のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項32〜34のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、請求項32〜35のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが1つまたは複数の追加の配列を含む、請求項32〜36のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、請求項37に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項37または38のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項32〜40のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、請求項41に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが20から50個のヌクレオチドを含む、請求項32〜42のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが一本鎖DNA配列である、請求項32〜43のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの3’末端が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列に相補的である、請求項32〜44のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーがその5’末端またはその5’末端部分に1つまたは複数の機能性配列および/または基を含む、請求項32〜45のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の機能性基が、蛍光性標識および結合性基から選択される、請求項46に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーが50から100個のヌクレオチドを含む、請求項32〜48のいずれかに一項に記載の方法。
- 第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの対が提供され、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列または前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含み、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的配列の他の3’末端の配列または前記標的配列の他の3’末端に隣接する配列に特異的である標的特異的配列を含む、請求項32〜49のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが異なる汎用性配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 第1および第2の汎用性プライマーの対が提供され、前記第1の汎用性プライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含み、前記第2の汎用性プライマーは、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列とハイブリダイズすることが可能な配列を含む、請求項50または51のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の汎用性プライマーが異なる機能性配列および/または基を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記汎用性プライマーの濃度と比較してより低い濃度で提供される、請求項32〜53のいずれかに一項に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が10:1を超える、請求項54に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が12:1から275:1である、請求項55に記載の方法。
- 前記汎用性プライマーの濃度対前記オリゴヌクレオチドプローブの濃度の比が16:1から256:1である、請求項56に記載の方法。
- PCRによってDNA、cDNAまたはRNA標的配列を増幅するために前記標的特異的プライマーが使用される、請求項32〜57のいずれかに一項に記載の方法。
- RNA標的配列からcDNAアンプリコン構築物を生成するための方法であって、
標的特異的プライマー;
RNA標的配列
を提供すること、および
逆転写を実行すること
を含み、前記標的特異的プライマーは請求項32〜58のいずれかに一項に記載の方法によって調製される方法。 - 前記標的特異的プライマーがin situで調製される、請求項59に記載の方法。
- 前記cDNAアンプリコン構築物がPCRによってさらに増幅される、請求項59または60のいずれかに一項に記載の方法。
- 標的特異的プライマーを調製するのに使用するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、汎用性配列を含み、その5’末端に、またはそれに向かって、標的配列の3’末端のうち1つの配列の逆相補体または前記標的配列の3’末端のうちの1つに隣接する配列の逆相補体とハイブリダイズすることが可能な標的特異的配列をさらに含むオリゴヌクレオチドプローブ。
- 一本鎖DNA配列である、請求項62に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的配列が、前記標的配列の3’末端のうちの1つの配列またはそれに隣接する配列と同一である、請求項62または63のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記汎用性プライマー上に位置する配列に十分に相補的である、請求項62〜64のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの前記汎用性配列が、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端に位置する、請求項62〜65のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 1つまたは複数の追加の配列を含む、請求項62〜66のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が前記汎用性配列の5’および前記標的特異的配列の3’に配置される、請求項67に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記1つまたは複数の追加の配列が機能性配列である、請求項67または68のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記1つまたは複数の機能性配列が、下流オリゴヌクレオチド結合部位、制限酵素認識部位および反応識別配列から選択される、請求項69に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端が、ポリメラーゼ伸長をブロックすることが可能なブロック基を含む、請求項62〜70のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記ブロック基がジデオキシヌクレオチドトリホスフェート(ddNTP)またはスペーサーC3である、請求項71に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 20から50個のヌクレオチドを含む、請求項62〜72のいずれかに一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
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