CN110088296A - 改进的多重和多步扩增反应及其试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于提高多重核酸扩增效率的试剂和方法，特别是在打算产生重叠扩增子的情况下。本发明还涉及用于提高多步核酸扩增效率的试剂和方法，特别是被设计成在同一反应混合物或容器中按顺序发生的两个单独扩增反应的执行。本发明进一步涉及用于通过控制第一扩增反应的输出来改善多步核酸扩增反应的试剂和方法。特别地，提供了一些引物以减少异常扩增产物的形成。当第一和第二扩增反应在单一反应混合物或容器中进行时，这种引物特别有用。
Description
技术领域
本发明涉及用于提高多重核酸扩增效率的试剂和方法，特别是在要产生重叠扩增子的情况下。本发明还涉及用于提高多步核酸扩增效率的试剂和方法，特别是被设计为在同一反应混合物或容器中按顺序发生的两个单独扩增反应的性能。本发明还涉及用于通过控制第一扩增反应的输出来改善多步核酸扩增反应的试剂和方法。特别地，提供了使异常扩增产物的形成最小化的引物。当第一和第二扩增反应在单一反应混合物或容器中进行时，这种引物特别有用。
背景技术
多重聚合酶链式反应(mPCR)是PCR的变体，其中可以通过在单一核酸扩增反应中包括多于一对的核酸扩增或PCR引物来扩增两个或更多个靶序列。多重PCR有可能在实验室中节省大量时间和精力。自1988年被首次提出以来，该技术已成功应用于人体DNA检测的许多领域，包括基因缺失分析、突变和多态性分析，定量分析和逆转录(RT)-PCR。在传染病领域，多重PCR已被证明是鉴定病毒、细菌和寄生虫的有价值的工具。
然而，mPCR的优化带来了一些困难，包括灵敏度差、特异性差、某些特定靶标优先扩增，和/或非预期序列扩增。
在mPCR中，一种靶序列相对于另一种靶序列的优先扩增是一种已知现象。目前已确认诱导这种偏差的两大类过程：PCR漂移和PCR选择。PCR漂移是一种偏差，被认为是由PCR试剂相互作用时的波动所造成的，特别是在早期循环中，尤其是模板浓度极低的情况下。另一方面，PCR选择被定义为由于靶标、靶标侧翼序列或整个靶基因组的特性而有利于扩增某些模板的机制。这些特性包括较短序列的优先扩增。
特别地，多重PCR中存在多于一个引物对可增加了得到异常扩增产物的几率，例如，由于较短的、不期望的片段的优先扩增。图1说明了在进行mPCR时面对的异常(非预期)扩增子的扩增问题。
发明人旨在解决开发基于多重PCR的，对不需要的异常产物(优选较短的异常产物)的测试中的问题，其需要使用多个反应容器进行单一测试。例如，一种用于扩增BRCA基因重叠区域的现有PCR测试需要在四个单独的管中进行扩增，以确保靶序列的可靠覆盖。这增加了测试的复杂性。
通常，多重PCR将在两个单独的反应中发生。在第一反应中，使用具有通用标签(universal tag)的一组靶特异性引物将通用正向和反向标签添加到每个扩增子上。然后在第二次扩增反应之前纯化产物。在第二反应中，用针对这些标签设计的通用引物来扩增所有扩增子，并添加进一步加工和鉴定目的所需的任何其他序列(例如衔接子)。
该系统不是最理想的，并且是劳动密集型的。此外，在第一步之后需要停止反应、分离反应混合物，这可能将误差和污染引入系统。因此，需要确定一种方法，以允许在单个反应容器中进行这两个步骤。
发明内容
发明人设计了各种解决方案，用于处理其在多重和多步核酸扩增反应中遇到的问题。理想地，可以组合各种解决方案以允许在第一次扩增中扩增重叠的靶序列，然后进行“通用”扩增(即基于与靶序列无关的共同引物对)以将衔接子序列合并到最终的扩增产物中，所述扩增产物可用于进一步的检测方法，优选下一代测序。为了清楚起见，在单独的标题下描述了每个改进领域，然后讨论了各种组合。然而，应该牢记，各种解决方案已被设计为便于有利地组合，并且所有这种组合都在本发明的范围内。还应该理解，关于一个改进领域所描述的备选方案经必要的修改后将适用于其他领域；例如样本类型、核酸类型等，视情况而定。然而，为了便于理解本发明所有方面共同的元素，以下提供介绍性定义。该定义适用于本发明的整个公开内容，当进一步详细描述每个方面时，将提供附加说明。
本发明涉及核酸扩增反应。根据本发明的所有方面，核酸扩增通常且优选通过PCR进行。然而，如本领域技术人员所理解的，本发明可以根据需要适应于其他扩增系统。
本发明特别涉及多重核酸扩增，在其中平行扩增可两个或更多个靶序列。这通常通过在单个核酸扩增反应中采用包括多于一对的核酸扩增引物来实现。根据本发明的一些方面，多重扩增涉及扩增靶核酸分子的重叠区域的引物对。
本发明还涉及多步核酸扩增，在其中发生两个或更多个不同的扩增反应。通常，第一扩增反应利用扩增靶核酸分子的靶特异性引物。靶特异性引物还包括通用标签。随着反应的进行，通用标签被合并到扩增产物中。在第二扩增反应中，用被设计为与这些标签序列杂交的通用引物来扩增来自第一扩增的扩增产物。所述第二扩增涉及合并进一步处理和鉴定目的所需的任何其他序列的引物(例如衔接子)。因此，“通用”扩增的概念受以下事实限制：扩增独立于被扩增的初始靶分子的特定靶序列进行。它依赖于将额外序列(所谓的“通用标签”)合并到第一扩增反应的扩增产物中，其可以在第二扩增中充当引物结合位点。因此，第二扩增中引物的引物区对应于通用标签序列。包括这种引物区的引物在本文中被称为“通用引物”。
根据本发明，靶核酸分子不是限制性的。可以使用本发明的试剂和方法扩增任何合适的靶核酸分子。可以靶向多种不同的靶核酸分子。这可能涉及使用多个靶核酸特异性引物对。根据本发明的所有方面，当靶核酸分子是双链时，每个特异性引物对的正向和反向引物的引物区分别与双链靶核酸分子的反平行互补链互补或基本上互补，并且可以与双链靶核酸分子的反平行互补链杂交。当然，由于在扩增过程中扩增(复制)靶核酸分子，每个特异性引物对的正向和反向引物可以通过它们各自的引物区与在扩增过程中形成的扩增的(复制的)靶核酸分子的互补区域结合。事实上，这将优先发生，因为扩增的(复制的)靶核酸分子在扩增过程中(以指数方式)形成，鉴于本领域已知的扩增过程，这对于技术人员来说是显而易见的。因此，术语“靶核酸分子”是指待扩增的核酸分子的所需区域，无论是作为扩增开始前存在的初始靶核酸分子的一部分还是在扩增过程中产生的靶核酸分子。因此，术语“初始靶核酸分子”用于指在扩增开始之前存在的靶核酸分子(即，从起始样本中提取的靶核酸分子)。
在优选的实施例中，根据本发明的所有方面，靶核酸分子是DNA分子。DNA可以是基因组DNA，线粒体DNA等。
基因组DNA是优选的。可以从任何合适的样本中纯化DNA。样本类型包括血液样本(特别是来自血浆和血清)以及其他体液如唾液、尿液或淋巴液。其他样本类型包括实体组织，包括冷冻组织或福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的材料。在特别优选的实施例中，DNA分子是双链DNA(dsDNA)分子。如本领域常规的，链可以分别被称为“有义”或“编码”链和“反义”或“非编码”链。在这些实施例中，特异性引物对的正向引物的引物区与反义链的区域互补，并且相同特异性引物对的反向引物的引物区与正向引物结合的区域下游的有义链区域互补。在替代实施例中，DNA分子是单链DNA(ssDNA)分子。在一些实施例中，ssDNA已经在原始样本中原位变性。例如，ssDNA可以从FFPE材料中纯化。在使用ssDNA的情况下，特异性引物对的正向或反向引物的引物区与ssDNA分子均互补。特异性引物对的另一引物包括与扩增循环期间形成的互补ssDNA分子互补的引物区，并且该引物区与所述互补ssDNA分子杂交。在进一步的实施例中，初始靶核酸分子可以作为ssDNA和dsDNA分子存在。例如，在从FFPE材料纯化的DNA的情况下，DNA可以包括ssDNA和dsDNA二者。DNA可以在样本中的细胞中发现或衍生自样本中的细胞。或者，DNA可以是循环的，或“无细胞的”DNA(cfDNA)。这种DNA可以从一系列体液中获得，包括血液样本(特别是来自血浆，以及血清)和其他体液如唾液、尿液或淋巴液。
在一些实施例中，根据本发明的所有方面，靶核酸分子衍生自RNA分子。如上所述，RNA可以从与DNA相同的样本类型获得。RNA可以是信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)等。优选mRNA。在这种实施例中，通常使用逆转录酶来逆转录RNA以形成互补DNA(cDNA)分子，然后可使用本发明的引物将其扩增。使用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA的方法是本领域熟知的。可以使用任何合适的逆转录酶，合适的逆转录酶的实例在本领域中是广泛可用的。在这种实施例中，初始靶核酸分子因此是cDNA分子。最初的cDNA分子可以是单链的，直到DNA聚合酶用于产生互补链。可以使用本发明的引物进行互补链的这种合成。一旦产生双链DNA分子，本发明的引物对就可以引导进一步扩增。因此，在特定实施例中，根据本发明的所有方面，首先将来自样本的RNA逆转录为cDNA，然后使用如本文所定义的引物组扩增cDNA分子。逆转录反应和随后的扩增反应可以(优选)在同一反应容器中发生。
因此，显而易见的是，根据本发明的所有方面，每个引物的“引物区”定义了引物的区域，其可以与靶核酸分子的链杂交以由(DNA)聚合酶引导合成新的互补核酸分子链。
靶核酸分子可以从任何合适的样本中获得。如将容易理解的，本发明的方法是体外方法，并且可以使用预分离的样本进行。在优选的实施例中，样本可以取自人受试者。然而，根据本发明的各个方面，可能来自任何来源的，任何含有核酸的样本都可以经历扩增。
被设计用于扩增靶核酸分子的引物对通常包括标签。在本发明的大多数实施例中，这些标签对于使通用扩增能够发生是关键的，并且在本文中被称为“通用标签”。这种标签不需要与初始靶核酸分子杂交。该功能由引物区提供。然而，一旦标签已被包括在扩增产物中，它们就可以充当后续靶标，在第二扩增步骤中通用引物与其杂交。合适的标签是本领域熟知的。通常，标签具有足够的长度以允许针对该序列特异性地设计通用引物。因此，它们通常长度为20个核苷酸或更长。根据本发明有用的标签可包括SEQ ID No 1(标签1)或2(标签2)的核苷酸序列，基本上由该核苷酸序列组成，或由该核苷酸序列组成。
根据本发明的所有方面，第二扩增可用于将衔接子序列包括在另外的扩增产物中。衔接子序列可以是用于下游处理的任何合适的序列。下游处理允许在样本中检测和/或量化靶核酸。例如，与固定在合适的固体表面上的寡核苷酸互补的衔接子序列允许合并这种衔接子的序列被固定。其他应用依赖于与液体中的寡核苷酸杂交的衔接子。衔接子可用于基于阵列或基于测序的分析。在根据本发明所有方面的优选实施例中，衔接子序列可以是用于高通量核酸测序的任何合适的衔接子序列。这种测序通常并且优选在下一代测序(NGS)平台进行。NGS平台的实例包括技术人员所熟知的Illumina测序(例如Hi-Seq和Mi-Seq)、SMRT测序(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))、Nanopore测序、SoLID测序、焦磷酸测序(例如Roche 454)、单分子测序(SeqLL/Helicos)和lon-Torrent(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))。如技术人员所知，衔接子序列与固定在合适的固体表面上的寡核苷酸互补(其性质取决于测序平台，例如流动池(Illumina)，零模式波导(SMRT)或珠子(焦磷酸测序))以用于测序。本发明并不受限于衔接子序列的细节。本发明的优点在于对扩增试剂和过程的修改，而不是如何进行下游处理。衔接子的特定实例包括可用于在Illumina MiSeq或HiSeq平台上测序的p5和p7衔接子以及可用于使用赛默飞世尔公司的lon-Torrent平台测序的A和P1衔接子。
本发明的各种引物也可用于将条形码包括在扩增产物中。条形码序列在本领域中是已知的。对于涉及第一扩增中使用的靶特异性引物的本发明的各方面，分子条形码有利地包括在引物中。分子条形码是特异性核酸序列，能使其合并的后续扩增子在后测序、计算机模拟分析中被鉴定。
与涉及第二轮扩增(通常为所谓的“通用”扩增，优选通用PCR)的本发明各方面特别相关的条形码的主要形式是样本条形码。因此，样本条形码可以有利地被包括在第二轮扩增(即通用)引物中。样本条形码序列用于样本鉴定。在单次测序运行中研究多个样本的情况下，这是有利的。但是，这是可选的。对于某些应用，例如对样本进行超深度测序，样本条形码序列可能是多余的。如果被包括，样本条形码序列可以是用于高通量核酸测序的任何合适的样本条形码序列。在一些实施例中，可以基于所选择的NGS平台来选择条形码序列。样本条形码序列在本文中也可被称为分子标识符(MID)序列或独特索引序列。它是预定的、独特的(与其他条形码序列相比)序列，其可用于后测序、计算机模拟分析以鉴定特定扩增子的来源和将特定来源的扩增子组合在一起。这种序列的使用在本领域中是公知的。在特定的实施例中，每个样本条形码的长度为至少4、6或8个核苷酸，可选地最多20个核苷酸。
在本发明的一些方面，引物或引物编码序列可以包括封闭基团。封闭基团可防止相关序列的不必要延伸。可以使用用于该目的的任何合适的封闭基团，并且技术人员非常清楚可以使用的封闭基团。在某些实施例中，封闭基团选自以下各项：3'ddC、3'反向dT、3'C3间隔区(例如C3丙二醇间隔区)、3'氨基和3'磷酸化。
本发明的一个关键优点是能够在单一反应混合物中进行多重和多步反应。“单一反应混合物”是指所有方法步骤(直至并包括产生相关的扩增产物(第一轮和第二轮))都是在不需要分离或除去组分的情况下进行的。特别地，不需要在通用扩增之前纯化第一扩增产物。在一些实施例中，在进行第一扩增之前，组合该方法(即产生另外的扩增产物)所需的所有试剂。因此，该方法可以在单个反应容器中进行。一旦形成反应混合物(除了进行扩增本身，例如热循环)，反应容器可以不需要进一步操作，直到产生了进一步的扩增产物。因此，该方法可以被认为是“单管”或“均相”方法。本发明涉及含有进行本文所述扩增反应的必需试剂的反应容器。
为避免疑义，本发明的方法包括在产生另外的扩增产物后(即在通用或第二轮扩增后)进行额外步骤。这种方法不限于反应容器的相同反应混合物。这种方法通常涉及检测并经常量化靶核酸分子。在优选的实施例中，本发明的方法用于鉴定和可选地量化特定的靶核酸分子。在优选的实施例中，该方法还包括测序进一步的扩增产物。测序通常以大规模平行方式进行。优选地，使用下一代测序(NGS)技术进行测序。测序可以在与本发明的扩增反应不同的反应混合物中进行。
术语“扩增子”与本文的“扩增产物”可互换使用。
改进涉及重叠靶序列的多重扩增
发明人开发了用于进行涉及重叠靶序列的多重扩增(尤其是mPCR)的改进试剂。特别地，发明人提供了在多重核酸扩增测定(例如mPCR)中限制或消除异常扩增子(即非预期的扩增子)的扩增的手段。这对于在单个反应容器或混合物中进行多重核酸扩增测定特别有利。它消除了在单独的反应容器或混合物中进行重叠扩增反应的要求。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，包括：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的第一区域，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签
b.第二引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的第二区域，所述第二区域至少部分地与第一区域重叠，包含：
i.第二正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签，其与被合并在第一反向引物的5'末端的核酸标签在5'至3'方向上相同
ii.第二反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区，
其中，如果在第一反向引物和第二正向引物之间形成异常(短)扩增产物，则在异常(短)扩增产物的5'末端的核酸标签与在扩增过程中形成的异常(短)扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交情况以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。这在图2中示出以说明该概念。靶核酸分子的第一区域是靶核酸分子的第二区域的上游(在5'至3'方向上(当双链时在有义链上))。
在一些实施例中，第一正向引物和第二反向引物还合并引物区的5'核酸标签。另外，第一正向引物的核酸标签和第二反向引物的核酸标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在第一正向引物和第二反向引物之间形成异常(长)扩增产物，则在异常(长)扩增产物的5'末端的核酸标签和在扩增过程中形成的异常(长)扩增产物的3'末端的互补物之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。这在图4中示出以说明该概念。
因此，根据本文的所有方面，可以根据长度(彼此，并且如果需要，与期望的扩增产物)区分异常扩增产物。“短”异常扩增产物来自第一引物对的反向引物，其与紧邻下游第二引物对的正向引物形成扩增产物。相反，“长”异常扩增产物来自第一引物对的正向引物，其与紧邻下游第二引物对的反向引物形成扩增产物。短的异常产品特别成问题，因此是本发明的一个焦点。
当被设计为扩增靶核酸分子的特定区域的特定引物对中的两个引物都含有引物区的5'核酸标签时，被合并在该对中的每个引物中的核酸标签(例如，第一个正向引物的核酸标签和第一个反向引物的核酸标签)是不同的。因此，这些标签基本上不相同，并且优选地，在5'至3'方向上不共享同一性。因此，避免了排除异常扩增产物的进一步扩增的机制。在所需扩增产物的3'末端没有形成5'核酸标签的反向互补序列，以使分子内杂交事件发生。这在图4中示出以说明该概念。
在进一步的实施例中，该引物组还包括：
a.第三引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的至少部分地与第二区域重叠的第三区域，包含：
i.第三正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签
ii.第三反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区，
其中第三正向引物的核酸标签和第二反向引物的核酸标签在5'至3'方向上也是相同的，使得如果在第三正向引物和第二反向引物之间形成异常(短)扩增产物，则在异常(短)扩增产物的5′末端的核酸标签和扩增期间形成的异常(短)扩增产物的3′末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常(短)扩增产物的进一步扩增。这在图5A-C中示出以说明该概念。靶核酸分子的第三区域是靶核酸分子的第二区域的下游(即有义链上的5′至3′方向)。
在进一步的实施例中，第三反向引物还合并引物区的5′核酸标签，其进一步的特征在于第二正向引物的核酸标签和第三反向引物的核酸标签在5′至3′方向上也是相同的，使得如果在第二正向引物和第三反向引物之间形成异常(长)扩增产物，则在异常(长)扩增产物的5′末端的核酸标签和扩增期间形成的异常(长)扩增产物的3′末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。这在图5A-C中示出以说明该概念。
以类似的方式，该组引物可以进一步包括第四引物对、第五引物对等，其被设计为分别扩增靶核酸分子的第四区域和靶核酸分子的第五区域，靶核酸分子的第四区域在第三区域的下游(在有义链上的5'至3'方向)并且至少部分地与第三区域重叠，靶核酸分子的第五区域在第四区域的下游(在有义链上的5'至3'方向)并且至少部分地与第四区域等重叠；第四、第五等引物对具有一个或多个核酸标签，如为第一、第二或第三引物对加以必要的变更所述的那样。可以在根据本发明的单一多重扩增反应(例如mPCR)中同时使用的引物组中的引物对的总数没有被特别限制，而是取决于所需扩增子的数量，所用(DNA)聚合酶的效率，技术人员将会理解。在特定的实施例中，引物组中引物对的数量可以是至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70，，80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000等。在特定的实施例中，引物组中引物对的数量可以高达5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000等。可以根据本发明提供任意数量的遵循这种排列的引物对，以允许以多重形式高效扩增潜在的大DNA靶标，同时最小化或消除异常扩增产物的产生。可以根据任何所需的引物对总数利用相邻引物对之间相同标签的相互排列。类似地，可以在单个反应中多重化多个不同的靶标。至少一个靶标并且优选所有靶标涉及重叠区域的扩增，因此可以使用本发明的引物组对该靶标进行扩增。
因此，在中心的且非常有利的方面，本发明提供了用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，包括：
a.至少两个引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域，每个引物对包括：
i.正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和引物区的5'核酸标签
ii.反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和引物区的5'核酸标签，
其中每个引物对中的正向和反向引物的核酸标签是不同的，紧邻的引物对中的正向和反向引物的标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物的5'末端的核酸标签和在扩增过程中形成的异常扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
注意，如本文所述的“引物对”是指被设计为产生特定所需扩增产物的一对引物。因此，引物对不是用于描述可能无意中导致产生异常扩增产物的引物的术语。每个引物对中的正向和反向引物的核酸标签是不同的。这阻止了被防止进一步扩增的预期扩增产物的产生。与此相反，紧邻的引物对中的正向和反向引物的标签在5'至3'方向上是相同的。如本文详细解释的，这种排列确保，如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物的5'末端的核酸标签和扩增过程中形成的异常扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件。这导致形成二级结构，其阻止了异常扩增产物的进一步扩增。因此，引物对内和引物对之间的标签的这种整体排列阻止了短和长异常扩增产物二者的进一步产生。
根据本发明的所有方面，核酸标签是引物的一个区域，其与初始靶核酸分子不互补，因此不能与初始靶核酸分子杂交。当形成包括其5'末端的核酸标签和其3'末端的互补序列(其在扩增过程中产生，如图3A-C所示并在本文中详细描述)的异常扩增产物时，在核酸标签和在异常扩增产物的3'末端的其互补序列之间发生分子内杂交事件，以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
更具体地，当在扩增的一轮或一个循环(该术语在本文中可互换使用)期间形成异常扩增产物，并将其加热至足够程度以在扩增的下一轮或循环中解离(解链)成单个核酸链(每种扩增方法，例如本领域公知的PCR)时，核酸标签与其在单链异常扩增产物3'末端的互补序列的杂交在退火步骤期间随后降低温度时优于单链异常扩增产物与另外的引物的分子间杂交。该分子内杂交事件形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。标签和互补物之间的相互作用可以产生发夹或马蹄形分子。二级结构的精确构象并不重要。重要的是分子末端之间的相互作用阻止异常扩增产物的进一步扩增。
标签由核苷酸序列形成，并且可以是基于DNA或RNA的或是两者的组合，条件是它们可以用作(DNA)聚合酶的模板以合成互补序列。优选地，它们由DNA构成。核酸标签可包括规范和/或非规范核苷酸。规范核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。非规范核苷酸包括肌苷、硫尿苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和二氨基嘧啶。技术人员非常清楚合适的互补核苷酸碱基配对，即碱基配对是能够彼此杂交的一对核苷酸。
熔解温度(Tm)在本领域(和本文)中定义为核酸双链体的两条链将解离成单链的温度。因此，Tm象征双链体稳定性。在特定的实施例中，由互补标签衍生的序列(在短的异常扩增产物中)之间的分子内杂交产生的二级结构的Tm高于在与靶序列的分子间杂交的情况下的引物的最高Tm。因此，在引起引物与靶核酸分子的互补结合区解离的温度下，核酸标签与其在单链异常扩增产物的3'末端的互补序列之间形成的二级结构可能保持完整，因此阻止了异常扩增产物的进一步扩增。特别地，由互补标签衍生的序列(在短的异常扩增产物中)之间的分子内杂交产生的二级结构的Tm可以比在与靶序列的分子间杂交的情况下的引物的最高Tm高至少1或2℃，可选高达3、4、5、6、7、8、9或10℃或更高。
被合并在本发明的引物中的标签可包括通用标签，基本上由通用标签组成，或由通用标签组成。该通用标签序列被包括在扩增产物中，因此允许进行需要使用通用引物的第二扩增。对于如本文所定义的引物对(即被设计为扩增所需扩增产物的正向引物和反向引物)，被合并在正向引物中的通用标签序列不同于被合并在反向引物中的通用标签序列。这防止产生预期(期望的)扩增产物，其被防止进一步扩增。然而，与这种标签序列的现有实施方式相比，在本发明中，紧邻的引物对中的正向和反向引物的通用标签在5'至3'方向上是相同的。如本文所详细解释的，这种排列确保，如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物5'末端的通用标签和扩增过程中形成的异常扩增产物3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件。这导致形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。因此，引物对内和引物对之间的通用标签的这种总体布置排除了短和长异常扩增产物二者的进一步产生。
应当理解，通用标签序列是所谓“通用的”，因为相同序列对可用于所有引物。第二轮扩增可由单个通用引用对引导进行，而无需考虑靶序列。然而，在本发明中，相邻引物对之间标签的往复布置仅意味着通用引物将以相应的方式扩增来自第一扩增反应的产物。通常，这种扩增产物在分子的每个末端合并标签和衔接子序列。这将在本文中进一步讨论，并且一般概念在图6A-C中示出。
值得进一步注意的是，这种布置在第二扩增中提供了进一步抑制或消除异常扩增产物的机会。如果任何不需要的扩增产物可通过通用引物扩增，它们将在任一端进一步合并互补衔接子和可选的条形码序列。这扩展了链的任一端的互补区域，因此进一步有利于分子内相互作用，从而抑制进一步的扩增。
至于更普遍的标签，为了避免疑义，通用标签由核苷酸序列形成，并且可以是基于DNA或RNA的或是两者的组合，条件是它们可以用作(DNA)聚合酶的模板以合成互补序列。在本文讨论的一些(RNase H)实施例中，它们不是基于RNA的。它们优选由DNA构成。通用标签可包括规范和/或非规范核苷酸。规范核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。非经典核苷酸包括肌苷、硫尿苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和二氨基嘧啶。技术人员非常清楚合适的互补核苷酸碱基配对，即碱基配对是能够彼此杂交的核苷酸对。
每个标签必须位于引物区的5'位(或上游)。然而，引物可以在引物区的上游再次包括额外的序列。它们优选位于标签和引物区之间，但可以位于标签的上游。其他额外序列包括探针，例如所谓的“蝎子”探针，其允许实时监测扩增。这种探针序列通常位于标签的上游。
其他额外序列包括条形码，特别是本领域已知的分子条形码。简而言之，每个分子条形码是一个特定的核酸序列，其能够使该核酸序列被合并于其中的后续扩增子在后测序、计算机分析中被鉴定。
如本领域技术人员容易理解的，对引物也可以进行标记，例如使用荧光团。
本领域技术人员可以容易地确定标签的长度，以确保在给定的扩增反应中，使异常扩增产物的产生最小化。发明人已经表明，虽然24个核苷酸的标签可能是最佳的，但是一定范围的标签长度就足够了。在许多实施例中，标签用于提供将与其他“通用”引物杂交的序列。因此，这种标签与本领域技术人员熟悉的引物设计要求一致。因此，在一些实施例中，每个标签长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。在一些实施例中，每个标签的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。在一些实施例中，每个标签的长度在15至35个核苷酸之间，或长度在20至30个核苷酸之间，优选长度在20至25个核苷酸之间。
就解链温度和杂交特性而言，标签的组成也是重要的。在进一步的实施例中，每个标签包括富含GC的序列。富含GC的序列是优选的，因为每个碱基对包括三个氢键(与仅涉及两个氢键的AT对相比)。“富含GC”是指主要包括鸟嘌呤和/或胞嘧啶核苷酸的核酸序列。这可以是在超过50％至100％之间的任意取值的鸟嘌呤和胞嘧啶残基。例如，标签可以包括50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的鸟嘌呤和/或胞嘧啶核苷酸。在特定的实施例中，标签完全由鸟嘌呤核苷酸或完全由胞嘧啶核苷酸组成。在其他实施例中，标签包括鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的组合。当标签少于100％鸟嘌呤和/或胞嘧啶核苷酸时，剩余的核苷酸可选自任何其他合适的规范或非规范核苷酸。
所需扩增产物的大小可取决于待用的特定扩增反应。它还可能取决于靶序列的性质。对于mPCR，每个引物对可以意图产生范围为30-500个核苷酸，优选30-300个核苷酸，更优选50-150个核苷酸的扩增产物。当扩增产物将要用于随后的下一代测序时，每个引物对可以意图产生范围为30-500个核苷酸，优选30-300个核苷酸，更优选70-250个核苷酸的扩增产物。使用mPCR并实时检测扩增产物时，例如使用基于探针的系统，可以优选短扩增产物。因此，每个引物对可以意图产生范围为30-300个核苷酸，优选30-250个核苷酸，更优选30-150个核苷酸的扩增产物。在相关实施例中，由紧邻的引物对产生的预期扩增产物之间的重叠水平在10-100个核苷酸的范围内，优选10-50个核苷酸，更优选10-30个核苷酸。重叠区域对应于短异常扩增产物的长度(减去标签序列)。然而，应该理解，所需扩增产物的长度不是本发明的必要特征。因此，每个引物对可以意图产生大于500个核苷酸(例如高达1000、2000个核苷酸等)的扩增产物。每种所需的扩增产物的长度可以达到或接近所用(DNA)聚合酶的延伸极限。因此，本发明允许使用者就所需扩增产物的长度而言享有灵活性，因为它仅是与靶核酸分子中的目标靶区域互补的引物区。对于目标靶区域的合适引物区的设计(以及扩增子大小)对于本领域技术人员来说是常规的，这取决于扩增的目的。
在特定的实施例中，每个标签都显示与靶核酸分子没有同一性。这使异常标签结合的可能性最小化。然而，这不是必需的特征，因为引物区也在相同区域中与靶核酸分子结合是极不可能的，因此不会发生有效的(在引导扩增的意义上)杂交。
本发明的引物对也可以以试剂盒的形式提供。因此，在相关方面，本发明提供了用于多重核酸扩增的试剂盒，其包括如本文所定义的一组引物。
在特别的实施例中，所述试剂盒还包括用于后续测序的通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
a.衔接子序列
b.可选地，样本条形码序列
c.通用引物区，其与多重扩增中使用的相应引物的通用标签(在5'至3'方向上)。相同。
衔接子序列可以是使用下一代测序(NGS)平台进行高通量核酸测序的任何合适的衔接子序列。NGS平台的实例包括技术人员公知的Illumina测序(例如Hi-Seq和Mi-Seq)、SMRT测序(太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences))、Nanopore测序、SoLID测序、焦磷酸测序(例如Roche 454)和lon-Torrent(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))。衔接子序列可以与固定在合适的固体表面上的寡核苷酸互补(其性质取决于测序平台，例如流动池(Illumina)，零模式波导(SMRT)或珠子(焦磷酸测序))以用于测序。实例包括使用IlluminaMiSeq或HiSeq平台测序所需的p5和p7衔接子以及使用赛默飞世尔公司的Ion Proton平台测序所需的A和P1衔接子。
样本条形码序列用于允许样本识别。在单次测序运行中研究多个样本的情况下，这是有利的。但是，这是可选的。对于某些应用，例如对样本进行超深度测序，样本条形码序列可能是多余的。在被包括的情况下，样本条形码序列可以是使用所选NGS平台进行高通量核酸测序的任何合适的样本条形码序列。
当引物对以多重方式使用时，与被合并在扩增产物中的通用标签(在5'至3'方向上)相同的通用引物区可以是基于DNA或RNA的或是两者的组合，条件是它可以用作(DNA)聚合酶的引物。优选地，通用引物区由DNA构成。通用引物区可包括规范和/或非规范核苷酸。规范核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。非规范核苷酸包括肌苷、硫尿苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和二氨基嘧啶。同样，本领域公知，通用引物用于各种NGS平台。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于mPCR的合适试剂，包括聚合酶、三磷酸二核苷酸(dNTP)、MgCl2和缓冲液中的一种或多种，直至全部。可以使用任何合适的聚合酶。通常，DNA聚合酶用于扩增根据本发明的核酸靶标。实例包括热稳定聚合酶如Taq或Pfu聚合酶和那些酶的各种衍生物。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在PCR主混合物中，该主混合物包括PCR扩增所需的大部分组分。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于将RNA逆转录成cDNA的合适试剂，包括逆转录酶。可以使用任何合适的逆转录酶。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在逆转录主混合物中，该主混合物包括逆转录所需的大部分组分。
在优选的实施例中，试剂盒包括通用引物对。这些可分别被称为第一和第二通用引物。更具体地，第一通用引物自5’端至3’端包含：
a.第一衔接子序列(如本文所定义)
b.(可选地)样本条形码序列(如本文所定义)
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第一通用标签(在5'至3'方向上)相同；
第二个通用引物自5’端至3’端包含：
a.第二衔接子序列(如本文所定义)。第二衔接子一般与第一衔接子序列不同。通常，第二衔接子序列与第一衔接子序列基本上没有或几乎没有序列同一性。
b.(可选地)如本文所定义的样本条形码序列
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第二通用标签(在5'至3'方向上)相同。
使用如图6A-C所示的通用引物对进行扩增产生所需的扩增产物，其在一端合并第一衔接子序列(和可选的样本条形码序列)，并在另一端合并第二衔接子序列(和可选的样本条形码序列)。这使得能够(立即)用于高通量、大规模平行的DNA测序。在一些优选的实施例中，第一和第二衔接子序列分别是使用Illumina MiSeq或HiSeq平台测序所需的p5和p7衔接子。在其他同样优选的实施例中，第一和第二衔接子序列分别是使用赛默飞世尔公司的Ion Proton平台测序所需的A和P1衔接子。
在进一步的实施例中，通用引物可以包括样本条形码，其如本文所定义并且如本领域已知的，在通用引物区上游但在衔接子序列的下游。因此，在特定的实施例中，所述/每个通用引物自5’端至3’端包含衔接子序列、样本条形码和通用引物区。
在另一方面，本发明还提供多重核酸扩增反应(例如mPCR)，其包括使用如本文所定义的一组引物扩增如本文所定义的靶核酸分子的重叠区域，以产生如本文所定义的经标记的扩增产物。
在一些实施例中，多重核酸扩增反应还包括检测扩增产物的步骤。扩增产物的检测可以通过常规方法进行，诸如，例如，凝胶电泳，或者可以使用实时或终点检测方法进行，诸如使用嵌入荧光染料如SYBR Green I(Sambrook和Russell，《分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)》，第三版)，系统(AppliedBiosystems)，参见Holland等人；通过利用Thermus aquaticus DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性来检测特异性聚合酶链反应产物；《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》USA 88,7276-7280(1991)，Gelmini等人，利用荧光探针的，基于定量聚合酶链反应的均相测定测量C-Erb-2癌基因扩增，《临床化学(Clin.Chem.)》43,752-758(1997)和Livak等人，迈向全自动全基因组多态性筛选，《自然遗传学(Nat.Genet.)》9,341-342(19995)或分子信标系统，参见Tyagi和Kramer，杂交后发荧光的分子信标-探针，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》，14,303-308(1996)和Tyagi等人，用于等位基因鉴别的多色分子信标，《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》，16,49-53(1998)。可根据需要采用其他系统，例如Scorpion系统和基于FRET的系统。
在替代实施例中，多重核酸扩增反应进一步包括额外的扩增以制备用于测序的经标记的扩增产物，额外扩增反应使用通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
a.如本文所定义的衔接子序列
b.可选地，如本文所定义的样本条形码序列
c.通用引物区，当引物对用于本文所定义的多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的通用标签(在5'至3'方向上)相同。
这种额外的扩增优选使用本发明的通用引物对。
上文讨论了衔接子序列、通用引物和样本条形码，该讨论经必要的修正后适用，并且出于简明的原因不再重复。
本发明还包括测序反应以检测和/或量化靶核酸分子。这种方法包括根据本发明的扩增反应，然后对扩增产物进行测序，优选使用下一代测序技术。
通过控制第一扩增反应的程度，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
发明人开发了用于第一扩增反应的引物，其有助于在单一反应混合物或容器中进行多步，通常是两步扩增。第一扩增中第一引物的作用是扩增目标靶序列并将通用标签合并在扩增子中。然后，经标记的扩增子充当第二扩增的模板，在其中通用引物与标签杂交并合并额外的序列，特别是衔接子，这是用于进一步处理和鉴定目的所需的。如果多步扩增在单一反应混合物或容器中进行，则存在第一引物将继续产生产物并因此有效地与第二扩增反应竞争的问题。这可能导致产生异常产物。因此需要控制第一扩增反应的程度。
本发明的引物利用RNase H断裂在一条链上含有RNA碱基的双链DNA序列的能力。如果RNA碱基侧翼有通常至少4个(尽管这可能取决于扩增中使用的精确RNase H酶；实验表明，来自Pyrococcus abyssi的RNase H2需要至少4个碱基对3’至RNA碱基的双链体区域)在任一侧的双链(或“双链体”)DNA碱基对，则RNase H将断裂RNA碱基的5'末端。因此，本发明的引物包括位于这样的位置的RNA碱基，使得RNase H不能起作用直至完整的引物序列被合并在双链扩增产物中。互补链的合成校正RNA碱基。因此，当本发明的另一引物与互补链结合时，将产生含有RNA碱基的双链序列，侧翼有通常至少4个(尽管这可能取决于扩增中使用的精确RNase H酶)在任一侧的双链(或“双链体”)DNA碱基对。因此RNase H断裂RNA碱基。该反应用于降低第一扩增反应的效率并降低最终混合物中异常序列的比例。
虽然任一侧的4个碱基对的双链区域被认为是产生断裂事件的最小值，特别是当使用来自Pyrococcus abyssi的RNase H2时，其他RNase H酶可能对RNA核苷酸的任一侧的较短的双链DNA区域有效。这可以容易地测试，例如使用以下陈述的实验方法：Dobosy JR，Rose SD，Beltz KR，Rupp SM，Powers KM，Behlke MA和Walder JA(2011)依赖RNase H的PCR(rhPCR)：使用封闭的可断裂引物改进的特异性和单核苷酸多态性检测，《BMC生物技术(BMCBiotechnol)》，11:80；参见第7页描述的实验。还应注意，RNA核苷酸的引物区3'需要与靶核酸分子杂交，因此在实践中总是显著长于4个核苷酸。通常，引物区最少为15个核苷酸，一般至少20个核苷酸。
根据一个方面，本发明提供了用于靶核酸分子的多步扩增的引物，其自5’端至3’端包含：
a.通用标签
b.RNA核苷酸
c.与靶核酸分子的链杂交的引物区
由于RNase H的要求，根据本发明该方面的靶核酸分子是DNA。可以通过RNA的逆转录产生DNA。因此，靶核酸分子可包括基因组DNA或cDNA。靶核酸分子可以是双链或单链的。
多步扩增通常是两步反应，优选在单一反应混合物或容器中进行。第一扩增用于扩增靶核酸分子并将通用标签合并在扩增子中。第二扩增是通用扩增，在其中通用标签充当通用引物的杂交位点，通用引物用于合并衔接子序列以进行预期的进一步加工和鉴定。因此，本发明的引物用于多步扩增的第一步。
引物自5’端至3’端包含：
a.通用标签。
标签是所谓的“通用”标签，用于将序列合并到第一轮扩增产物中，第二轮“通用”引物可与之杂交。因此，标签序列被设计成与通用引物的引物区相同。
因此标签与初始靶核酸分子的序列不匹配。通过单独的引物区实现与初始靶核酸分子的杂交。当然，一旦将标签合并在扩增产物中，标签序列就作为引物的进一步杂交区域。
重要的是标签不包括RNA核苷酸，以防止RNase H不希望的断裂，这将阻碍第二扩增反应。因此，标签通常由DNA核苷酸组成。然而，可以使用对RNase H活性不敏感的任何核苷酸，条件是核苷酸能够在第二扩增中与适当设计的通用引物碱基配对。
b.RNA核苷酸
特定的RNA核苷酸并不重要。当它存在于双链DNA环境中时，它只需要是可被RNaseH断裂的核苷酸。如上所述，通常，双链DNA环境在RNA核苷酸的任一侧需要最少双链(或“双链体”)DNA碱基的4个碱基对。优选地，引物中包括单个RNA核苷酸。还应注意，RNA核苷酸可以或可以不与靶DNA分子中的相应DNA核苷酸匹配。在任一种情况下，RNA核苷酸都被合并在扩增产物中。互补链的合成校正RNA碱基并包括相应的DNA核苷酸。因此，当本发明的另一引物与互补链结合时，将产生双链序列，其含有RNA碱基，其侧翼有通常至少4个(尽管这可能取决于扩增中使用的精确RNase H酶)在任一侧的双链(或“双链体”)DNA的碱基对。因此RNase H断裂RNA碱基。该反应用于降低第一扩增反应的效率并降低最终混合物中异常序列的比例。
c.与靶核酸分子的链杂交的引物区
引物区引导靶核酸分子的扩增。同样，重要的是引物区不包括RNA核苷酸，以防止RNase H的不希望的断裂，这将阻碍靶核酸的扩增。因此，引物区通常由与靶DNA序列杂交的DNA核苷酸组成。然而，可以使用对RNase H活性不敏感的任何核苷酸，条件是核苷酸能够与靶核酸序列碱基配对。由于以下作用机制，其中RNase H底物不是在初始引物结合时产生的，而是依赖于互补链的合成，然后引物与互补链结合，因此可以自由地设计与靶标相关的引物区。因此，在引物设计的限制内，为了确保与所需的靶DNA分子杂交，可以容忍错配，并且错配不应对本发明的性能产生不利影响。针对给定靶核酸序列的引物设计完全在本领域技术人员的能力范围内。
应注意，在一些实施例中，引物区可合并RNA核苷酸。条件是与初始靶DNA分子结合的引物不产生RNase H底物。因此，通常，RNA核苷酸在引物区起点的下游(在5'至3'方向上)不超过3个核苷酸。这确保了RNA核苷酸在扩增初始靶核酸分子之前在侧翼任一侧都没有双链(或“双链体”)DNA碱基的至少4个碱基对。这在图10中示意性地示出。
通常，除RNA核苷酸外，引物中剩余的核苷酸是DNA核苷酸。然而，如已经讨论的，可以在引物中使用其他非RNA核苷酸，条件是它们复制相应DNA核苷酸的功能并且不易受RNase H活性的影响。
Dobosy及其同事(Dobosy JR，Rose SD，Beltz KR，Rupp SM，Powers KM，Behlke MA和Walder JA(2011)依赖RNase H的PCR(rhPCR)：使用封闭的可断裂引物改进的特异性和单核苷酸多态性检测，《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》，11:80)发展了rhPCR。该系统依赖于RNAse H活性来消除引物二聚体。它依赖于被RNAse H活性激活的封闭引物。与该系统相比，本发明不需要封闭的引物。因此，本发明的引物不需要封闭基团；特别是不需要RNA碱基下游的封闭基团。然而，在一些实施例中，可以修饰本发明的引物以包括Dobosy首先描述的功能(参见Dobosy的图1)。这需要第一RNA核苷酸下游(在5'至3'方向上)的另外的RNA核苷酸。因此，在一些实施例中，用于靶核酸分子的多步扩增的引物自5’端至3’端包含：
a.通用标签
b.RNA核苷酸
c.与靶核酸分子的链杂交的引物区
d.另一RNA核苷酸
e.另一与靶核酸分子链杂交的区域
f.封闭基团
因此，本发明的引物可以适用于依赖RNase H的PCR(rhPCR)反应。该系统特别有利于避免形成引物二聚体和其他模板非依赖性反应。它取决于在初始引物与靶DNA分子结合时形成的RNase H底物。封闭的引物无活性。在用RNase H断裂后，引物区(c)被有效地解封，然后可以引发DNA链的合成。
这种引物所需的其他特征是：
d.另一RNA核苷酸
需要将另外的断裂位点引入引物中，这需要在引物区的下游。特定的RNA核苷酸并不重要。它只需要是当存在于双链DNA环境中时可被RNase H断裂的核苷酸。如上所述，通常，双链DNA环境在RNA核苷酸的任一侧需要双链(或“双链体”)DNA碱基的最少4个碱基对。优选地，引物中包括单个另外的RNA核苷酸。还应注意，RNA核苷酸优选与靶DNA分子中的相应DNA核苷酸匹配。这使得RNase H的断裂效率最大化。因此，当本发明的引物与靶DNA结合时，产生双链序列，其含有RNA碱基，其侧翼任一侧都有双链(或“双链体”)DNA的通常至少4个(尽管这可能取决于扩增所用的精确RNase H酶)碱基对。因此，RNase H断裂RNA碱基并释放引物区以引导合成。
e.与靶核酸分子的链杂交的另一区域
与仅使用引物区相比，另一区域与靶核酸分子的链杂交并因此改善了对靶DNA分子的特异性。另一RNA核苷酸和另一区域与从引物区的结合位点继续的连续DNA碱基杂交。因为存在另一区域以提供与DNA靶标结合时RNase H断裂的背景，所以仅需要足够的长度以在另一RNA核苷酸的任一侧提供双链(或“双链体”)DNA碱基的足够碱基对，与引物区组合。通常，另一区域长度为最少4个核苷酸，以产生RNase H在靶标结合时介导断裂的相关环境。这些核苷酸中的至少第一个优选与靶DNA分子匹配。这是确保RNase H高效断裂的最重要的核苷酸。然而，理想地，至少前1、2、3或4个，优选所有核苷酸与靶DNA分子匹配。这使断裂效率最大化，但不是必需的。
虽然单个另外的RNA核苷酸是必需的并且因此是优选的，但是另外的RNA核苷酸可能包含在也可以被RNase H断裂的另外区域中。断裂所需要的是解除引物区的封闭，使其能接着引导扩增。另外的区域仅需要为RNase H活性提供合适的底物环境，并且其本身不执行任何进一步的功能。因此，多个断裂事件是可能的，条件是断裂导致封闭基团被移除并允许引物区延伸靶核酸分子。然而，通常，另一区域由与靶DNA序列杂交的DNA核苷酸组成。然而，可以使用对RNase H活性不敏感的任何核苷酸，条件是核苷酸能够与靶核酸序列碱基配对。
f.封闭基团
封闭基团在RNase H断裂之前防止了不希望的延伸(其有效地解封了引物区)。可以使用用于该目的的任何合适的封闭基团，并且技术人员非常清楚可以使用的封闭基团。在某些实施例中，封闭基团选自以下各项：3'ddC、3'反向dT、3'C3间隔区(例如C3丙二醇间隔区)、3'氨基和3'磷酸化。
本发明的引物可以包括其他元素。例如，它们可包括合适的标记以便于监测扩增和/或检测扩增产物。在优选的实施例中，本发明的引物还包括条形码序列。通常，条形码序列位于RNA核苷酸的下游。优选的条形码序列是分子条形码。在特定的实施例中，分子条形码的长度为至少4、6或8个核苷酸。通常，分子条形码的长度不超过20个核苷酸。
虽然本发明的引物可以与“标准”第二引物(即经标记的靶特异性引物)组合使用以形成引物对，但本发明的引物在第一扩增中有利地成对使用。因此，本发明还提供了引物对，其包括根据本发明的正向和反向引物，用于扩增靶核酸分子。
用于实施本发明的关键试剂是RNase H。RNase H的核糖核酸酶活性断裂DNA/RNA双链体底物中RNA的3-O-P键以产生3'-羟基终止产物和5'-磷酸终止产物。可用于本发明的RNase H酶在核酸扩增期间必须是有活性的。当引物与模板杂交时，酶实时作用于扩增产物。这样，由于PCR是根据本发明有用的，最优选的扩增方法，因此通常RNase H是热稳定的RNase H。优选地，这种RNase H在室温下具有比在PCR(热循环)期间使用的高温下显著更低的活性。然而，如果进行等温扩增反应(例如NASBA)，则热稳定的RNase H可能不是必需的。
因此，本发明进一步提供了一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，其包括本发明的引物或引物对以及RNase H。优选地，RNase H是热稳定的。可以使用RNase H2，例如来自Pyrococcus abyssi的RNase H2。
本发明提供靶核酸分子的多步(通常两步)扩增，包括使用本发明的引物，引物对或试剂组。这种反应优选在单一反应混合物或容器中进行。
本发明还提供了扩增靶核酸分子的方法，包括使用本发明的第一引物对在RNaseH存在的情况下扩增靶核酸分子，使得：
a.在第一轮扩增后，靶核酸分子被复制，并且第一扩增产物合并第一正向引物的通用标签和RNA核苷酸，第二扩增产物合并第一反向引物的通用标签和RNA核苷酸；
b.在第二轮扩增中，第一反向引物与第一扩增产物杂交以产生第三扩增产物，其合并第一正向引物的通用标签的互补物和RNA核苷酸的DNA互补物，并且第一正向引物与第二扩增产物杂交以产生第四扩增产物，其合并第一反向引物的通用标签的互补物和RNA核苷酸的DNA互补物，其中第三和第四扩增产物各自代表RNase H活性的底物，导致RNA核苷酸的断裂，从而限制了靶核酸分子的进一步扩增。
如上所述，第一轮和第二轮扩增各自涉及本发明的第一正向和第一反向引物。因此，该方法描述了第一扩增反应。它可以并且实际上优选地在多步扩增反应的背景下发生。这种反应优选在单一反应混合物或容器中进行。
因此，扩增方法可以进一步包括额外的扩增以制备用于测序的经标记的扩增产物，额外扩增反应使用通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
a.如本文所定义的衔接子序列
b.可选地，如本文所定义的样本条形码序列
c.通用引物区，当引物对用于如本文所定义的多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的通用标签(在5'至3'方向上)相同。
这种额外的扩增优选使用本发明的通用引物对。更具体地，第一通用引物自5’端至3’端包含：
a.第一衔接子序列(如本文所定义)
b.(可选地)样本条形码序列(如本文所定义)
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第一通用标签(在5'至3'方向上)相同；
第二通用引物自5’端至3’端包含：
a.第二衔接子序列(如本文所定义)。第二衔接子一般与第一衔接子序列不同。通常，第二衔接子序列与第一衔接子序列基本上没有或几乎没有序列同一性。
b.(可选地)如本文所定义的样本条形码序列
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第二通用标签(在5'至3'方向上)相同。
本发明还包括测序反应以检测和/或量化靶核酸分子。这些方法包括根据本发明的扩增反应，然后对扩增产物进行测序，优选使用下一代测序技术。
本发明的引物、引物对和试剂组也可以以试剂盒的形式提供。因此，在相关方面，本发明提供了用于靶核酸分子的多步扩增的试剂盒，其包含如上所述的引物、引物对或试剂组。
在特别的实施例中，所述试剂盒还包含用于后续测序的通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
a.衔接子序列
b.可选的样本条形码序列
c.通用引物区，其与用于第一扩增的相应引物的通用标签(在5'至3′方向上)相同。
衔接子序列可以是使用下一代测序(NGS)平台进行高通量核酸测序的任何合适的衔接子序列。NGS平台的实例包括技术人员公知的Illumina测序(例如Hi-Seq和Mi-Seq)、SMRT测序(太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences))、Nanopore测序、SoLID测序、焦磷酸测序(例如Roche 454)和lon-Torrent(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))。衔接子序列可以与固定在合适的固体表面上的寡核苷酸互补(其性质取决于测序平台，例如流动池(Illumina)，零模式波导(SMRT)或珠子(焦磷酸测序))用于测序。实例包括使用IlluminaMiSeq或HiSeq平台测序所需的p5和p7衔接子以及使用赛默飞世尔公司的Ion Proton平台测序所需的A和P1衔接子。
样本条形码序列用于允许样本识别。在单次测序运行中研究多个样本的情况下，这是有利的。但是，这是可选的。对于某些应用，例如对样本进行超深度测序，样本条形码序列可能是多余的。在被包括的情况下，样本条形码序列可以是使用所选NGS平台进行高通量核酸测序的任何合适的样本条形码序列。
当引物对用于第一扩增时，与被合并在扩增产物中的通用标签(在5'至3'方向上)相同的通用引物区可以是基于DNA或RNA的或是两者的组合，条件是它可以作为(DNA)聚合酶的引物。优选地，通用引物区由DNA构成。通用引物区可包含规范和/或非规范核苷酸。规范核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。非规范核苷酸包括肌苷、硫尿苷、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和二氨基嘧啶。同样，本领域中公知通用引物用于各种NGS平台。
在优选的实施例中，试剂盒包含一对通用引物。这些可分别被称为第一和第二通用引物。更具体地，第一通用引物自5’端至3’端包含：
a.第一衔接子序列(如本文所定义)
b.(可选的)样本条形码序列(如本文所定义)
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第一通用标签(在5'至3'方向上)相同；
第二个通用引物自5’端至3’端包含：
a.第二衔接子序列(如本文所定义)。第二衔接子一般与第一衔接子序列不同。通常，第二衔接子序列与第一衔接子序列基本上没有或几乎没有序列同一性。
b.(可选的)样本条形码序列(如本文所定义)
c.通用引物区，当引物对用于多重扩增时，该通用引物区与被合并在扩增产物中的第二通用标签(在5'至3'方向上)相同。
在进一步的实施例中，通用引物可以包括样本条形码，其如本文所定义，并且如本领域已知的，在通用引物区的上游但在衔接子序列的下游。因此，在特定的实施例中，所述/每个通用引物自5’端至3’端包含衔接子序列、样本条形码和通用引物区。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于PCR的合适试剂，包括聚合酶、三磷酸二核苷酸(dNTP)、MgCl2和缓冲液中的一种或多种，直至全部。可以使用任何合适的聚合酶。通常，DNA聚合酶用于扩增根据本发明的核酸靶标。实例包括热稳定聚合酶如Taq或Pfu聚合酶和那些酶的各种衍生物。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在PCR主混合物中，该主混合物包括PCR扩增所需的大部分组分。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于将RNA逆转录成cDNA的合适试剂，包括逆转录酶。可以使用任何合适的逆转录酶。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在逆转录主混合物中，该主混合物包括逆转录所需的大部分组分。
试剂盒可以进一步包含用于后续测序的试剂。
试剂盒可包含使用说明。这种说明可作为包装说明书被包含在试剂盒内。
通过延迟通用引物的产生，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
发明人开发了用于进行靶核酸分子的多步、特别是至少两步扩增(尤其是PCR)的改进试剂。特别地，发明人提供了一种用于在单个反应容器中进行多步核酸扩增测定的试剂组。这消除了在不同反应容器中进行多步扩增反应的每个步骤的要求。试剂用于在靶核酸的第一扩增的同时产生通用引物。因此，根据本发明，需要扩增反应以产生通用引物。相对于靶核酸的第一扩增，这延迟了通用引物的生成。该延迟使得能够产生足够量的第一扩增反应产物(即经标记的扩增子)以充当通用引物的底物。这又有助于减少非特异性相互作用，如果在反应开始时简单地加入通用引物，这将是普遍的。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包含：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
b.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团。
c.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
d.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，该扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
e.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，该扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用d和e的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物以扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
因此，第一和第二核酸分子代表形成通用引物对的通用引物序列的反向互补物。第一和第二核酸分子与第一和第二衔接子引物的使用增加了产生通用引物对的时间延迟，该通用引物对扩增由第一引物对产生的扩增产物。这允许使用第一(靶特异性)引物对来充分扩增靶核酸分子，以产生通用引物对的过量底物。这减少了试图在单个反应容器中进行多步扩增所导致的非特异性作用。
与目前使用的经标记的靶特异性引物对相比，扩增靶分子的第一引物对不需要进行修饰(参见图1，用于说明进行多步扩增的现有技术系统)。因此，还提供了一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包含：
a.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物，该第一通用标签被合并在与靶核酸分子的链杂交的第一引物对的正向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
b.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物，该第二通用标签被合并在与靶核酸分子的链杂交的第一引物对的反向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
c.第一衔接子引物，，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，该扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
d.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，该扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用c和d的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物以扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
然而，在优选的实施例中，本发明的引物与这些(反向互补物)核酸分子一起使用。因此，本文所述的试剂(组)适合用于在单一反应混合物中进行的靶核酸分子的多步扩增。
根据本发明的相关方面，提供了一种用于靶核酸分子的多步扩增的方法，包括：
a.使用第一引物对扩增靶核酸分子，所述第一引物对包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
以产生合并第一通用标签和第二通用标签的第一扩增产物，
b.使用与第一衔接子序列的反向互补物杂交的第一衔接子引物扩增第一核酸分子，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
c.使用与第二衔接子序列的反向互补物杂交的第二衔接子引物扩增第二核酸分子，所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
d.使用步骤b和c的扩增产物作为通用引物对来扩增由第一引物对产生的扩增产物，其中第一和第二通用标签充当引物以产生合并第一和第二通用标签和功能序列的进一步扩增产物，其中该方法在单一反应混合物中进行。
为避免疑义，本发明的方法包括在产生进一步扩增产物后(即在通用扩增后)进行额外步骤。这些方法不限于反应容器的相同反应混合物。这些方法通常涉及检测靶核酸分子。在优选的实施例中，本发明的方法用于鉴定和可选地量化特定的靶核酸分子。在优选的实施例中，该方法还包括对进一步扩增产物测序。测序通常以大规模平行方式进行。优选地，使用下一代测序(NGS)技术进行测序。测序可以在与步骤a至d不同的反应混合物中进行。
因此，本发明提供了用于检测和可选地量化靶核酸分子的方法，包括：
靶核酸分子的多步扩增，包括：
a.使用第一引物对扩增靶核酸分子，所述第一引物对包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
以产生合并第一通用标签和第二通用标签的第一扩增产物，
b.使用与第一衔接子序列的反向互补物杂交的第一衔接子引物扩增第一核酸分子，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
iii.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
iv.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
v.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
iii.第一衔接子序列
iv.第一通用标签
c.使用与第二衔接子序列的反向互补物杂交的第二衔接子引物扩增第二核酸分子，所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
vi.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
vii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
viii.阻止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
iii.第二衔接子序列
iv.第二通用标签
d.使用步骤b和c的扩增产物作为通用引物对来扩增由第一引物对产生的扩增产物，其中第一和第二通用标签充当引物以产生合并第一和第二通用标签和功能序列的进一步扩增产物，其中该方法在单一反应混合物中进行；以及
对进一步扩增产物进行测序，优选使用下一代测序技术。
在测序之前，可以纯化进一步扩增产物。取决于所选择的技术，测序可以包括进一步扩增该进一步扩增产物以用于产生信号(如本领域技术人员容易理解的)。这种进一步扩增可以是任何合适的技术，例如桥式扩增或基于珠子的扩增(乳液PCR)。根据本发明有用的NGS平台的实例包括技术人员公知的Illumina测序(例如Hi-Seq和Mi-Seq)、SMRT测序(太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences))、Nanopore测序、SoLID测序、焦磷酸测序(例如Roche 454)、单分子测序(SeqLL/Helicos)和lon-Torrent(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))。
许多测序技术利用条形码序列来进行样本鉴定。因此，在本发明的所有方面，第一核酸分子可以进一步包含核苷酸序列，其是第一条形码序列的反向互补物，通常是第一样本条形码。因此，在优选的实施例中，第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第一样本条形码的反向互补物
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
在第一核酸分子进一步包含核苷酸序列(其是第一条形码序列(通常是第一样本条形码)的反向互补物)的实施例中，第一衔接子引物与第一衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物包含第一衔接子序列、第一条形码序列和第一通用标签。在第一核酸分子进一步包含核苷酸序列(其是第一样本条形码的反向互补物)的优选实施例中，第一衔接子引物与第一衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
i.第一样本条形码
iii.第一通用标签
扩增产物充当通用引物并与使用第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，以产生合并第一和第二通用标签、第一条形码序列(特别是样本条形码)，以及第一和第二衔接子的进一步扩增产物。
根据本发明的所有方面，第二核酸分子可以进一步包含核苷酸序列，其是第二条形码序列的反向互补物，通常是第二样本条形码。因此，在优选的实施例中，第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第二样本条形码的反向互补物
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
在第二核酸分子进一步包含核苷酸序列(其是第二条形码序列(通常是第二样本条形码)的反向互补物)的实施例中，第二衔接子引物与第二衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物包含第二衔接子序列、第二条形码序列和第二通用标签。在第二核酸分子进一步包含核苷酸序列(其是第二样本条形码的反向互补物)的优选实施例中，第二衔接子引物与第二衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
i.第二样本条形码
iii.第二通用标签
该扩增产物充当通用引物并与使用第一衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，以产生合并第一和第二通用标签、第二条形码序列(特别是第二样本条形码)，以及第一和第二衔接子的进一步扩增产物。
在特定的实施例中，第一和第二核酸分子均进一步包含核苷酸序列，其是条形码序列(通常是样本条形码)的反向互补物。在这些实施例中，进一步扩增产物合并第一和第二通用标签，第一和第二条形码序列(优选样本条形码)以及第一和第二衔接子。
因此，本发明的一个关键贡献是提供对应于通用引物的反向互补序列。反向补体序列在3'端被封闭以防止不需要的扩增。因此，在相关方面，本发明提供了一种核酸分子，其自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码序列(优选样本条形码)的反向互补物，
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的衔接子序列的反向互补物
d.防止延伸超出衔接子序列的封闭基团。
通常，这种分子被成对提供以形成通用引物对。因此，本发明提供了第一核酸分子和第二核酸分子的组合，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码序列(优选样本条形码)的反向互补物，
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团；
所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码序列(优选样本条形码)的反向互补物，
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
d.防止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团。
对应于根据本发明使用的通用引物的特定反向互补序列包含SEQ ID No 5-24中任一个的核苷酸序列，基本上由所述序列组成，或由所述序列组成。
使用与衔接子序列的反向互补物杂交的引物产生每种通用引物。因此，通用引物和衔接子引物的组合形成了本发明的另一方面。特别地，提供了通用引物反向互补核酸分子与引物的组合，所述引物与衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的衔接子序列
b.可选的条形码序列，优选样本条形码
c.标签
优选的组合是第一和第二核酸分子，其代表通用引物对与相应的第一和第二衔接子引物的反向互补物。特别地，提供了形成通用引物对的通用引物反向互补核酸分子与第一衔接子引物、第二衔接子引物的组合，所述第一衔接子引物与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的第一衔接子序列
b.可选的第一条形码序列，优选样本条形码
c.第一通用标签
所述第二衔接子引物与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的第二衔接子序列
b.可选的第二条形码序列，优选样本条形码
c.第二通用标签
根据本发明有用的特定衔接子引物包含SEQ ID No 3和/或4的核苷酸序列，基本上由该序列组成，或由该序列组成。
根据本发明的相关方面，提供了多步核酸扩增反应，其包括使用如上定义的试剂组扩增靶核酸分子，以产生合并标签和衔接子序列的扩增产物。
本发明的试剂组也可以以试剂盒的形式提供。因此，在相关方面，本发明提供了用于靶核酸分子的多步扩增的试剂盒，其包含如上所述的试剂组、核酸分子或组合。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于PCR的合适试剂，包括聚合酶、三磷酸二核苷酸(dNTP)、MgCl2和缓冲液中的一种或多种，直至全部。可以使用任何合适的聚合酶。通常，DNA聚合酶用于扩增根据本发明的核酸靶标。实例包括热稳定聚合酶如Taq或Pfu聚合酶和那些酶的各种衍生物。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在PCR主混合物中，该主混合物包括PCR扩增所需的大部分组分。
在进一步的实施例中，试剂盒可以进一步包括用于将RNA逆转录成cDNA的合适试剂，包括逆转录酶。可以使用任何合适的逆转录酶。合适的缓冲液也是公知的并且可商购获得，并且可以被包括在逆转录主混合物中，该主混合物包括逆转录所需的大部分组分。
试剂盒可以进一步包含用于后续测序的试剂。
试剂盒可包含使用说明。这种说明可作为包装说明书被包含在试剂盒内。
通过控制第一扩增反应的程度，改进涉及重叠靶序列的多重扩增并在单一反应混合物中实现多步扩增反应
在优选的实施例中，本发明的引物以多重方式用于第一扩增反应以扩增靶核酸分子的重叠区域。那些引物有利地产生经标记的扩增产物，然后它们可以在第二扩增反应(通常为PCR)中被扩增。本发明还提供了控制第一扩增反应程度的引物，以使其与第二反应的竞争最小化并防止异常扩增产物的过量产生。可以将这些引物的特征包括在本发明的引物中，所述引物被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域。
因此，例如，在用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组中，包括：
a.至少两个引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域，每个引物对包含：
i.正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'通用标签
ii.反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'通用标签，
其中每个引物对中的正向和反向引物的通用标签是不同的，紧邻的引物对中的正向和反向引物的通用标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物的5'末端的核酸标签和在扩增过程中形成的异常扩增产物的3′末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增；
所述引物也可以自5’端至3’端包含：
a.通用标签下游的RNA核苷酸
b.不包含RNA核苷酸并且与靶核酸分子的链杂交的引物区。
在这种实施例中，通用标签不包含RNA核苷酸。
每个相关方面的所有进一步的实施例经必要的修改后适用，并且出于简明的原因不再重复。例如，如本文所定义的通用引物对可以被包括在用于多重和多步扩增的试剂组中。
如本文所讨论的，这种引物组可用于多重和多步扩增。可以将它们包括在如本文所讨论的试剂盒中。可以将包括在如本文所讨论的反应容器中；一个关键的优点是单一反应可以在相同反应混合物中发生。
在第二扩增反应之后，扩增产物包括衔接子和可选的条形码，其能够进行下游处理和鉴定。理想地，这是通过如本文所讨论的NGS进行的，以使得能够鉴定和/或量化靶核酸。
通过延迟通用引物的产生，改进涉及重叠靶序列的多重扩增并在单一反应混合物中实现多步扩增反应
在优选的实施例中，本发明的引物以多重方式用于第一扩增反应以扩增靶核酸分子的重叠区域。那些引物有利地产生经标记的扩增产物，其然后可以在第二扩增反应(通常为PCR)中被扩增。本发明还提供了核酸分子，其形成通用引物的反向互补物，可用于延迟第二扩增反应所需的通用引物的产生。这对于控制第二扩增反应的开始是有用的，直到产生与通用引物杂交的，来自第一扩增反应的足够产物(经标记的扩增子)。可以有利地组合这些试剂以扩增靶核酸分子的重叠区域并确保高效的第二阶段扩增。
因此，例如，在用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组中，所述试剂组包含：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
b.第一核酸分子，以5′至3′顺序包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
c.第二核酸分子，以5′至3′顺序包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
d.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
e.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用d和e的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物以扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物；
可以使用扩增重叠区域的至少两个引物对扩增靶核酸分子的多个重叠区域。在这种方面，有利地，试剂包含用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，所述引物组包含：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的第一区域，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5′核酸标签
b.第二引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的，至少部分与第一区域重叠的第二区域，包含：
i.第二正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和引物区的5′核酸标签，其与被合并在第一反向引物5'末端的核酸标签在5'至3'方向上相同
ii.第二反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
其中，如果在第一反向引物和第二正向引物之间形成异常(短)扩增产物，则在异常(短)扩增产物的5'末端的核酸标签与在扩增过程中形成的异常(短)扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
甚至更优选地，试剂包含用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，所述引物组包含：
a.至少两个引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域，每个引物对包含：
i.正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'通用标签
ii.反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'通用标签
其中每个引物对中的正向和反向引物的通用标签是不同的，紧邻的引物对中的正向和反向引物的通用标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物的5'末端的通用标签和在扩增过程中形成的异常扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
每个相关方面的所有进一步的实施例经必要的修改后适用，并且出于简明的原因不再重复。
在一些实施例中，每个引物对中的至少一个引物包括条形码，可选为分子条形码。在其他实施例中，用于扩增靶核酸分子的每个引物包括条形码，可选为分子条形码。
这种试剂组，包括引物，可用于如本文所述的多重和多步扩增。可以将它们包括在如本文所讨论的试剂盒中。
可以将它们包括在如本文所讨论的反应容器中；一个关键的优点是整个(多重和多步)反应可以在相同的反应混合物中进行。
在第二扩增反应之后，扩增产物包括衔接子和可选的条形码，其能够进行下游处理和鉴定。理想地，这是通过如本文所讨论的NGS进行的，以使得能够鉴定和/或量化靶核酸。
通过延迟通用引物的产生并且通过控制第一扩增反应的程度，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
第一和第二扩增反应之间的平衡是在单一反应混合物或容器中进行两种反应的关键障碍。提供了针对该问题的两种互补解决方案，其可以有利地组合。
因此，例如，在用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组中，包括：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
b.第一核酸分子，以5'至3'顺序包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
c.第二核酸分子，以5'至3'顺序包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
d.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
e.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用d和e的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物以扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物；
第一正向和第一反向引物中的至少一个，优选两个是用于靶核酸分子的多步扩增的引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.RNA核苷酸
c.不包含RNA核苷酸并且与靶核酸分子的链杂交的引物区。
每个相关方面的所有进一步的实施例经必要的修改后适用，并且出于简明的原因不再重复。
因此，可以将RNase H(优选为热稳定的RNase H)添加到反应混合物中。这种试剂组合既控制第一扩增反应的程度又延迟第二扩增反应的开始。这有助于在单一反应混合物或容器中进行两种扩增反应，这是非常有利的。
这种试剂组，包括引物，可用于如本文所述的多重和多步扩增。可以将它们包括在如本文所讨论的试剂盒中。
可以将它们包括在如本文所讨论的反应容器中；一个关键的优点是整个(多步)反应可以在相同的反应混合物中进行。
在第二扩增反应之后，扩增产物包括衔接子和可选的条形码，其能够进行下游处理和鉴定。理想地，这是通过如本文所讨论的NGS进行的，以使得能够鉴定和/或量化靶核酸。
通过控制第一扩增反应的程度来改进涉及重叠靶序列的多重扩增和在单一反应混合物中实现多步扩增反应，通过延迟通用引物的产生并且通过控制第一扩增反应的程度能够在单一反应混合物中实现多步扩增反应
最优选地，本发明的引物以多重方式用于第一扩增反应中以扩增靶核酸分子的重叠区域。那些引物有利地产生经标记的扩增产物，其然后可以在第二扩增反应(通常为PCR)中被扩增。本发明还提供了合并RNA核苷酸并控制第一扩增反应程度的引物，以使其与第二反应的竞争最小化并阻止异常扩增产物的过量产生。可以将这些引物的特征包括在本发明被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域的引物中。
这种第一阶段引物可以有利地与核酸分子组合，形成通用引物的反向互补物，优选通用引物对，其可用于延迟第二扩增反应所需的通用引物的产生。这对于控制第二扩增反应的开始是有用的，直到产生通用引物与其杂交的，来自第一扩增反应的足够产物(经标记的扩增子)。可以有利地组合这些试剂以扩增靶核酸分子的重叠区域并确保高效的第二阶段扩增。
这种试剂组，包括引物，可用于如本文所述的多重和多步扩增。可以将它们包括在如本文所讨论的试剂盒中。
可以将它们包括在如本文所讨论的反应容器中；一个关键的优点是整个(多重和多步)反应可以在相同的反应混合物中进行。
在第二扩增反应之后，扩增产物包括衔接子和可选的条形码，其能够进行下游处理和鉴定。理想地，这是通过如本文所讨论的NGS进行的，以使得能够鉴定和/或量化靶核酸。
每个相关方面的所有相关实施例经必要的修改后适用，并且出于简明的原因不再重复。
附图说明
图1-与在多重PCR反应中产生异常扩增产物相关的问题的示意图，其中扩增子共享重叠区域。
图2-使用本发明的引物组阻止短异常扩增产物扩增的示意图。
图3A-C-使用本发明的引物组的三轮mPCR的示意图，证明了如何形成发夹样二级结构来阻止短异常扩增产物的扩增。
图4-使用本发明的两组引物阻止短异常扩增产物和长异常扩增产物二者的扩增的示意图。
图5A-C-使用本发明的三组引物阻止基本上所有短异常扩增产物和长异常扩增产物的扩增的示意图。
图6A-C-使用本发明的两组引物阻止短异常扩增产物和长异常扩增产物二者的扩增，然后用本发明的通用引物进行第二扩增的示意图。
图7-证明使用标准BRCA肿瘤MASTR Dx引物导致异常短PCR产物的形成的迹线。
图8-证明调整连接到BRCA肿瘤引物对的标签序列以符合重叠扩增子的一步多重化消除了异常短PCR产物的形成，并且仅产生所需扩增子的迹线。
图9-图9A中提供了根据本发明的引物的示意图。图9B中还提供了这种引物和初始靶核酸分子上引物的结合位点的代表性序列。图9C中提供了根据本发明的引物的示意图，其包括分子条形码。
图10-图10A中提供了根据本发明的另一种引物的示意图。图10B中还提供了这种引物和初始靶核酸分子上引物的结合位点的代表性序列。图10C中提供了根据本发明的另一种引物的示意图，其包括分子条形码。
图11-使用本发明的引物降低第一扩增反应效率的示意图(图11A)。第二“通用”扩增反应如图11B所示。
图12-用于进行靶核酸分子的多步扩增的现有技术双管系统的示意图。
图13-使用本发明试剂组在单一反应混合物中进行靶核酸分子的多步扩增的示意图。
图14-使用MID和rcMID引物对第二PCR产物进行片段分析。
图15-基于片段分析，对采用MID引物和rcMID+p5/p7引物的第二PCR结果之间的比较。上图由MID引物的扩增产生；下图由rcMID+p5/7引物的扩增产生。
图16-分别为基于片段分析的MID引物和rcMID+p5/p7引物的2步(上图)和1步(下图)PCR结果之间的比较。彩色框表示预期扩增子的位置。
图17-片段分析结果，其在X轴上显示扩增子的长度，在Y轴上显示每个扩增子的产量，其表示为每个峰的高度。
图17A-显示在第一引物对中没有RNA碱基的情况下的一步PCR的片段分析结果。
图17B-显示相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表第一PCR产物的预期大小。
图17C-显示相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表通用PCR后PCR产物的预期大小。
图18-片段分析结果，其在X轴上显示扩增子的长度，在Y轴上显示每个扩增子的产量，其表示为每个峰的高度。
图18A-显示了在第一引物对中用RNA碱基进行的一步PCR的片段分析结果。
图18B-显示相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表第一PCR产物的预期大小。
图18C-显示相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表通用PCR后PCR产物的预期大小。
具体实施方式
改进涉及重叠靶序列的多重扩增
图1显示了与在多重PCR反应中产生异常扩增产物相关的问题，其中扩增子共享重叠区域。作为实例，这里显示了DNA双链体链(11)，其含有两个待扩增的靶序列：靶序列1(TS1；12)和靶序列2(TS2；13)。为了方便读者，每个分别的靶序列是独立显示的，但应该理解，这两个序列实际上都存在于同一DNA双链体链上并在其上重叠。重叠区域显示为点线框。设计正向引物(14)和反向引物(15)来扩增TS1以产生扩增子1(AM1；16)。设计第二正向引物(17)和第二反向引物(18)来扩增TS2以产生扩增子2(AM2；19)。在扩增过程中，其机制在本领域中是公知的，AM1和AM2均如预期产生。然而，由于靶序列在DNA双链体链上重叠，如所显示的，也产生异常扩增产物。由于TS1正向引物(14)与TS2反向引物(18)共同作用，形成“长”异常扩增产物1(AB1；111)。由于TS2正向引物(17)与TS1反向引物(15)共同作用，形成“短”异常扩增产物2(AB2；112)。作为最短扩增子的AB2可以优先形成。
图2说明了如何使用根据本发明的引物组来帮助解决图1中所示的问题。因此，图2显示了DNA双链体链(21)，其含有两个待扩增的靶序列：靶序列1(TS1；22)和靶序列2(TS2；23)。为了方便读者，每个分别的靶序列是独立显示的，但应该理解，这两个序列实际上存在于同一DNA双链体链(21)上并在其上重叠。重叠区域显示为点线框。设计第一正向引物(24)和第一反向引物(25)来扩增TS1以产生扩增子1(AM1；26)，即第一正向引物(24)包含与DNA双链体链(21)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且第一反向引物(25)包含在TS1的各边界处与DNA双链体链(21)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。设计第二正向引物(27)和第二反向引物(28)来扩增TS2以产生扩增子2(AM2；29)。因此，第二正向引物(27)包含与DNA双链体链(21)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且第二反向引物(28)包含与限定TS2各自边界的DNA双链体链(21)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。
根据本发明，第一反向引物(25)和第二正向引物(27)各自在其各自的5'末端被相同的核苷酸序列标记(白色圆圈；下文中称其为“标签(tag)”)。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。在扩增之前，标签不与初始DNA双链体链(21)杂交。
在至少三个循环的mPCR扩增期间(一个扩增循环是一种如下的顺序：变性步骤，接着是退火步骤，接着是延伸步骤)，其机制在本领域中是公知的，AM1和AM2都按预期产生；由于第一(TS1)正向引物(24)与第一(TS1)反向引物(25)共同作用而产生AM1，并且由于第二(TS2)正向引物(27)与第二(TS2)反向引物(28)共同作用而产生AM2。然而，重要的是，使用常规的、未标记的引物代替第二(TS2)正向引物(27)和第一(TS1)反向引物(25)，以指数方式形成的短异常扩增产物不会累积到任何显著程度。这是因为当形成短异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含核酸标签，在其3'末端包含核酸标签的互补物(由黑色圆圈表示)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成二级发夹样结构(212)，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。更具体地，异常扩增产物在扩增循环期间形成，然后被加热到足以解离(解链)成单个核酸链的程度。在下一个扩增循环期间，当在退火步骤期间降低温度时，与单链异常扩增产物和另外的引物的分子间杂交相比，5'核酸标签与其在单链异常扩增产物3'末端的互补序列的杂交在熵上更有利。因此，阻止了短异常扩增产物的进一步扩增。结果提高了AM1和AM2的扩增效率。
在该实例中，由于第一(TS1)正向引物(24)与第二(TS2)反向引物(28)共同作用，长异常扩增产物(211)仍可形成。然而，AM1和AM2的产生仍然是优选的，因为它们的长度较短。
在图3A-C中更详细地显示了二级发夹样结构由短异常扩增产物形成。如图3A所示，在第一轮mPCR期间，初始靶核酸分子的DNA双链体已被变性(或解链)以分离有义(31)和反义(32)链。退火步骤期间的冷却意味着第二(TS2)正向引物(27)已经通过其互补引物区(实线箭头)与靶核酸分子的反义链(32)杂交。第一(TS1)反向引物(25)通过其互补引物区(虚线箭头)与靶核酸分子的有义链(31)杂交。第二(TS2)正向引物(27)和第一(TS1)反向引物(25)均在其各自的5'末端包含核酸标签；仅作为说明，将核酸标签显示为核苷酸序列CTAGTT(5'至3')。通过DNA聚合酶以5'至3'方向从每个经杂交的引物延伸合成新的有义(33)和反义(34)链，其在它们各自的5'末端合并CTAGTT标签。
如图3B所示，在第二轮mPCR中，在第1轮扩增后形成的双链DNA双链体被变性(或解链)以分离有义链和反义链。为简洁起见，仅显示了在其各自的5′末端合并CTAGTT标签的新的有义(33)和反义(34)链。变性后，退火步骤期间的冷却意味着第二(TS2)正向引物(27)通过其互补引物区(实线箭头)与反义链(34)杂交。第一(TS1)反向引物(25)通过其互补引物区(虚线箭头)与有义链(33)杂交。通过DNA聚合酶从每个经杂交的引物延伸分别合成另一条新的有义(35)和反义(36)链。在它们各自的5′末端，新的有义(35)和反义(36)链包含CTAGTT序列。在它们各自的3′末端，新的有义(35)和反义(36)链通过DNA聚合酶借助复制机制而包含互补的AACTAG序列(在5′至3′方向上)。
如现在图3C中所示，在第三轮mPCR中，在第2轮扩增后形成的双链DNA双链体被变性(或解链)以分离有义链和反义链。在变性后和退化步骤期间的冷却时，新的有义链(35)和新的反义链(36)的互补5′和3′经标记末端杂交(37)以形成折叠或发夹状结构。这种分子内杂交事件在熵方面优于与另外的引物的分子间杂交，因此优先形成。因此，引物现在优先结合靶核酸分子，从而改善mPCR过程。
在另一个实例中，图4说明了使用根据本发明的特别优选的引物组如何防止短异常扩增产物和长异常扩增产物二者的指数扩增，从而有利于所需的扩增产物。可以容易地设想如何增加这样的引物组的数量以扩增单个反应容器中的几个重叠区域。
因此，图4显示了DNA双链体链(41)，其含有两个待扩增的靶序列：靶序列1(TS1；42)和靶序列2(TS2；43)。为了方便读者，每个分别的靶序列是独立显示的，但应该理解，这两个序列实际上都存在于同一DNA双链(41)上并在其上重叠。重叠区域显示为点线框。设计第一正向引物(44)和第一反向引物(45)来扩增TS1以产生扩增子1(AM1；46)，即正向引物(44)包含与DNA双链体链(41)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(45)包含在TS1的各边界处与DNA双链体链(41)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。设计第二正向引物(47)和第二反向引物(48)来扩增TS2以产生扩增子2(AM2；49)，即正向引物(47)包含与DNA双链体链(41)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(48)包含在TS2的各边界处与DNA双链体链(41)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。
至关重要的是，第一反向引物(45)和第二正向引物(47)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列(白色圆圈；下文称其为“标签组1”)标记。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。
标签组1的标签不与初始靶DNA双链体链(41)杂交。另外，第一正向引物(44)和第二反向引物(48)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列标记，所述核苷酸序列具有与标签组1的序列不同的序列(白色三角形；下文称其为“标签组2”)。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。标签组2也不与初始靶DNA双链体链(41)杂交。
在至少三轮的mPCR扩增期间(一轮扩增是一种如下的顺序：变性步骤，接着是退火步骤，接着是延伸步骤)，其机制在本领域中是公知的，AM1和AM2都按预期产生；由于第一(TS1)正向引物(44)与第一(TS1)反向引物(45)共同作用而产生AM1，并且由于第二(TS2)正向引物(47)与第二(TS2)反向引物(48)共同作用而产生AM2。然而，重要的是，使用常规的、未标记的引物以指数方式形成的短异常扩增产物和长异常扩增产物都不会累积到任何显著程度。这是因为当形成短异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组1的核酸标签，并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色圆圈)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成二级发夹样结构(410)，其阻止如前所述的短异常扩增产物的进一步扩增。类似地，当形成长异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组2的核酸标签，并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色三角形)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成二级发夹样结构(411)，其阻止如前所述的长异常扩增产物的进一步扩增。结果，提高了AM1和AM2的扩增效率。该设计特别有益于单个反应容器中靶核酸的多个重叠区域的mPCR，因为相邻引物对中标签的相互排列阻碍了所有异常扩增产生。
在另一个实例中，图5A-C说明了使用根据本发明的特别优选的引物组如何防止基本上所有短和长异常扩增产物的指数扩增，从而就靶核酸分子的三个重叠靶区域而言有利于所需扩增产物。可以容易地设想如何进一步增加这样的引物组的数量以在单个反应容器中扩增四个或更多个(包括数百或数千个)重叠区域。
因此，图5A显示了DNA双链体链(51)，其含有三个待扩增的靶序列：靶序列1(TS1；52)，靶序列2(TS2；53)和靶序列3(TS3；54)。为了方便读者，每个各自的靶序列是独立显示的，但应该理解，所有这些序列实际上都存在于相同的DNA双链体链(51)上。TS1(52)和TS2(53)共享重叠区域，显示为点线框(514)。TS2(53)和TS3(54)共享重叠区域，显示为方格框(515)。
设计第一正向引物(55)和第一反向引物(56)来扩增TS1(52)以产生图5C中所示的扩增子1(AM1；57)，即正向引物(55)包含与DNA双链体链(51)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(56)包含在TS1(52)的各边界处与DNA双链体链(51)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。设计第二正向引物(58)和第二反向引物(59)来扩增TS2(53)以产生图5C中所示的扩增子2(AM2；510)，即正向引物(58)包含与DNA双链体链(51)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(59)包含在TS2(53)的各边界处与DNA双链体链(51)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。设计第三正向引物(511)和第二反向引物(512)来扩增TS3(54)以产生图5C中所示的扩增子2(AM3；513)，即正向引物(511)包含与DNA双链体链(51)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(512)包含在TS3(54)的各边界处与DNA双链体链(51)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。
至关重要的是，第一反向引物(56)和第二正向引物(58)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列(白色圆圈；下文称其为“标签组1”)标记。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。标签组1的标签不与初始靶DNA双链体链(51)杂交。此外，第一正向引物(55)和第二反向引物(59)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列标记，所述核苷酸序列具有与标签组1的序列不同的序列(白色三角形；下文称其为“标签组2”)。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。标签组2也不与初始靶DNA双链体链(51)杂交。此外，第三正向引物(511)也在5'末端被与第二反向引物(59)标签具有相同核苷酸序列(在5'至3'方向上)的标签标记，并且第三反向引物(512)在5′末端被与第二正向引物(58)标签具有相同核苷酸序列(在5′至3′方向上)的标签标记。两种标签都不能与最初的靶DNA双链体链(51)杂交。
在至少三轮的mPCR扩增期间(一轮扩增是一种如下的顺序：变性步骤，接着是退火步骤，接着是延伸步骤)，其机制在本领域中是公知的，AM1、AM2和AM3都按预期产生；AM1(57)由于第一(TS1)正向引物(55)与第一(TS1)反向引物(56)共同作用而产生，AM2(510)由于第二(TS2)正向引物(58)与第二(TS2)反向引物(59)共同作用而产生，并且AM3(513)由于第三(TS3)正向引物(511)与第三(TS3)反向引物(512)共同作用而产生。然而，重要的是，使用常规的、未标记的引物以指数方式形成的基本上所有的短异常扩增产物和长异常扩增产物不会累积到任何显著程度。这是因为当第二正向引物(58)和第一反向引物(56)共同作用形成短异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组1的核酸标签并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色圆圈)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成如图5B所示的二级发夹样结构(516)，其阻止如前所述的短异常扩增产物的进一步扩增。类似地，当由于第三正向引物(511)和第二反向引物(59)共同作用形成短异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组2的核酸标签并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色三角形)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成如图5B所示的二级发夹样结构(517)，其阻止如前所述的短异常扩增产物的进一步扩增。
当由于第一正向引物(55)和第二反向引物(59)共同作用形成长异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组2的核酸标签并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色三角形)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成如图5B所示的二级发夹样结构(518)，其阻止如前所述的长异常扩增产物的进一步扩增。类似地，当由于第二正向引物(58)和第三反向引物(512)共同作用形成长异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含标签组1的核酸标签并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色圆圈)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成如图5B所示的二级发夹样结构(519)，其阻止如前所述的长异常扩增产物的进一步扩增。虽然理论上仍然可能由于第一正向引物(55)和第三反向引物(512)共同作用而形成长异常扩增产物，但由于它是最大的扩增子，因此这是最难的。因此，相对于常规的、未标记的引物对，使用根据本发明的引物组提高了AM1(57)、AM2(510)和AM3(513)的扩增效率。该设计特别有益于单个反应容器中靶核酸的多个重叠区域的mPCR，如所示的，相邻引物对中标签的相互排列基本上阻碍所有异常扩增产生。
在优选的实施例中，本发明的引物包括引物区上游的通用标签。该通用标签被包含在扩增产物中，因此允许进行需要使用通用引物的第二扩增。这在图6A-C中示出。
因此，图6A显示了DNA双链体链(61)，其含有两个待扩增的靶序列：靶序列1(TS1；62)和靶序列2(TS2；63)。为了方便读者，每个各自的靶序列是独立显示的，但应该理解，这两个序列实际上存在于同一DNA双链体链(61)上并在其上重叠。重叠区域显示为点线框。设计第一正向引物(64)和第一反向引物(65)来扩增TS1以产生扩增子1(AM1；66)，即正向引物(64)包含与DNA双链体链(61)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(65)包含在TS1的各边界处与DNA双链体链(61)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。设计第二正向引物(67)和第二反向引物(68)来扩增TS2以产生扩增子2(AM2；69)，即正向引物(67)包含与DNA双链体链(61)的反义链杂交的引物区(实线箭头)，并且反向引物(68)包含在TS2的各边界处与DNA双链体链(61)的有义链杂交的引物区(虚线箭头)。
如先前关于图4所述，第一反向引物(65)和第二正向引物(67)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列(白色圆圈；下文中称其为“第二通用标签”)标记。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。第二通用标签不与初始靶DNA双链体链(61)杂交。另外，第一正向引物(64)和第二反向引物(68)在每个引物的5'末端被相同的核苷酸序列标记，所述核苷酸序列具有与第二通用标签的序列不同的序列(白色三角形；下文称其为“第一通用标签1”)。为避免疑义，序列在5'至3'方向上相同。第一通用标签也不与初始靶DNA双链体链(61)杂交。
从图中可以看出，第一和第二通用标签位于引物区的上游。应该理解的是，通用标签被称为“通用”，因为对于所有引物对采用相同的顺序，往复排列。因此，如果根据本发明存在第三引物对并且第三正向引物包含通用标签，则它将是第一通用标签(即，被包含在第一正向引物中的相同通用标签，但不同于被包含在第二正向引物中的通用标签)。这种通用标签的使用通过减少第二扩增所需的引物数量来简化第二扩增反应。第二扩增依赖于引物与被合并在扩增产物中的通用标签序列的杂交。出于类似的原因，这同样适用于反向引物。因此，如果根据本发明存在第三引物对并且第三反向引物包含通用标签，则它将是第二通用标签(即，被包含在第一反向引物中的相同通用标签，但不同于被包含在第二反向引物中的通用标签)。第一通用标签和第二通用标签都不与初始靶DNA双链体链(61)杂交。
在至少三轮的mPCR扩增期间(一轮扩增是一种如下的顺序：变性步骤，接着是退火步骤，接着是延伸步骤)，其机制在本领域中是公知的，AM1和AM2都按预期产生；由于第一(TS1)正向引物(64)与第一(TS1)反向引物(65)共同作用而产生AM1，并且由于第二(TS2)正向引物(67)与第二(TS2)反向引物(68)共同作用而产生AM2。然而，重要的是，使用常规的、未标记的引物以指数方式形成的短异常扩增产物和长异常扩增产物不会累积到任何显著程度。这是因为当形成短异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含第二通用标签，并且在其3'末端包含第二通用标签的互补物(表示为黑色圆圈)。
这使得分子内杂交事件能够在第二通用标签和其互补物之间发生，以形成二级发夹样结构(610)，其阻止如前所述的短异常扩增产物的进一步扩增。类似地，当形成长异常扩增产物时，每条单链在其5'末端包含第一通用标签，并且在其3'末端包含核酸标签的互补物(表示为黑色三角形)。这使得能够在核酸标签与其互补物之间发生分子内杂交事件，以形成二级发夹样结构(611)，其阻止如前所述的长异常扩增产物的进一步扩增。结果，提高了AM1和AM2的扩增效率。
此外，AM1(66)和AM2(69)包括第一和第二通用标签。重要且更特别地，AM1(66)的有义链在5'末端包含第一通用标签并且AM1(66)的反义链在5'末端包含第二通用标签。相反，AM2(69)的有义链在5'末端包含第二通用标签，并且AM2(69)的反义链在5'末端包含第一通用标签。然后，通用标签的合并允许进行进一步的扩增反应，其在第二轮扩增产物的每个末端合并不同的衔接子分子(和可选的样本条形码分子)。
如图6B所示，通用标签的互补物现在可用作第二扩增中的通用引物对的结合位点。更具体地，第一通用引物(612)自5’端至3’端包含：
a.第一衔接子序列(衔接子1)，其是如本文所定义的衔接子序列
b.如本文所定义的样本条形码序列
c.与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同的通用引物区(白色三角形)，该第一通用标签被合并在所示出的产生的扩增产物中；
并且第二通用引物(613)自5’端至3’端包含：
a.第二衔接子序列(衔接子2)，其是如本文所定义的衔接子序列，其与衔接子1基本上没有或几乎没有序列同一性
b.如本文所定义的样本条形码序列
c.与第二通用标签(在5'至3'方向上)相同的通用引物区(白色圆圈)，该第二通用标签被合并在所示出的产生的扩增产物中。
因此，在第二扩增期间，第一通用引物区(与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同)与第一通用标签的互补物杂交，并通过(DNA)聚合酶引发每个扩增子的延伸，其机制在本领域中是公知的。类似地，第二通用引物区(与第二通用标签(在5'至3'方向上)相同)与第二通用标签的互补物杂交，并通过(DNA)聚合酶引发每个扩增子的延伸。
结果，产生扩增产物(614)和(615)，如图6C所示。至关重要的是，每个产物现在在任一端都包含第一和第二衔接子序列。由于通用标签在引物对中的排列，第一和第二衔接子序列可以在不同扩增产物中位于分子的相对末端。这对后续处理不会有问题。在每个扩增产物(614)和(615)的末端合并第一和第二衔接子序列意味着它们现在准备用于高通量、大规模平行的DNA测序。例如，衔接子1和衔接子2可以分别是使用Illumina MiSeq或HiSeq平台进行测序所需的p5和p7衔接子。或者，衔接子1和衔接子2可以分别是使用赛默飞世尔公司的Ion Proton平台进行测序所需的A和P1衔接子。
特别有利地，使用第一正向引物(64)、第一反向引物(65)、第二正向引物(67)和第二反向引物(65)的第一扩增和使用通用引物(612)和(613)的第二扩增可以在相同的反应容器中进行。也就是说，所有上述引物连同必需的扩增试剂(dNTP、聚合酶等)可以在反应开始时被组合包括。因此，在单一反应容器中，可以产生靶核酸的所需重叠扩增子，其分别在有义链和反义链的5'末端具有必需的衔接子，以进行高通量、大规模平行的DNA测序。应注意，测序将在单独的反应容器中进行(例如在测序仪器中的流动池上)。
通过控制第一个扩增反应的程度，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
图9A示意性地显示了用于靶核酸分子的多步扩增的引物(1)。引物自5’端至3’端首先包含通用标签(2)。标签(2)用于将序列合并在扩增产物中，通用引物可在第二扩增中与之杂交。标签(2)不包含RNA核苷酸，并且不与初始靶核酸分子杂交。在标签(2)的下游(即3'末端)发现RNA核苷酸(3)。RNA核苷酸(3)的下游是引物区(4)。该引物区(4)与靶核酸分子的链杂交以引导扩增。引物区通常是基于DNA的，并且不包括任何RNA核苷酸。
图9B使用与图9A相同的标记，并显示引物与靶核酸分子的初始杂交。这基于理论靶序列。标签(2)由DNA核苷酸构成，并且不与初始靶核酸分子杂交。在标签(2)的下游(即3'末端)发现RNA核苷酸(3)，在这种情况下为尿嘧啶。RNA核苷酸(3)的下游是引物区(4)。该引物区(4)与靶核酸分子的链(6)杂交，以5'-3'方向引导扩增。引物区域由DNA核苷酸构成。
图9C使用与图9A相同的标记，并显示合并分子条形码(7)的引物。在该图中，分子条形码位于RNA核苷酸的下游，尽管这不是必需的。通常，分子条形码在通用标签的下游。
图10A使用与图9相同的标记，并示意性地显示了用于靶核酸分子的多步扩增的另一引物(1)。该引物自5’端至3’端首先包含通用标签(2)。标签(2)用于将序列合并在扩增产物中，通用引物可在第二扩增中与之杂交。标签(2)不包含RNA核苷酸，并且不与初始靶核酸分子杂交。在标签(2)的下游发现RNA核苷酸(3)，在引物区(4)的第三个核苷酸处。该引物区(4)与靶核酸分子的链杂交以引导扩增。除单核苷酸外，引物区是基于DNA的。RNA核苷酸在其5'末端仅侧接2个DNA碱基配对的核苷酸(5)，因此不充当RNase H底物。
图10B使用与图10A相同的标记，并显示引物与靶核酸分子的初始杂交。这基于理论靶序列。标签(2)由DNA核苷酸构成，并且不与初始靶核酸分子杂交。在标签(2)的下游发现RNA核苷酸(3)，在引物区(4)的第三个核苷酸处。该引物区(4)与靶核酸分子的链(6)杂交，以5'-3'方向引导扩增。引物区含有单个RNA-DNA核苷酸对(3)。然而，这不能在RNA核苷酸的上游提供足够的双链特征。因此，经退火的引物不会被RNase H活性断裂。这是因为RNA核苷酸在其5'末端仅侧接2个DNA碱基配对的核苷酸(5)。
图10C使用与图10A相同的标记，并显示合并分子条形码(7)的引物。在该图中，分子条形码位于RNA核苷酸的下游，尽管这不是必需的。通常，分子条形码在通用标签的下游。
图11A是使用本发明的引物限制第一扩增反应的示意图。这对于防止其与第二扩增反应竞争是重要的，如图11B所示。与第二扩增反应的竞争可导致过量的经标记的扩增产物，该产物没有合并用于下游处理的衔接子序列。每个图中都包括一个图例，以便于识别各种分子组分。
在图11A中，显示了靶双链DNA分子(31)。还显示了本发明的正向(32)和反向(33)引物。正向(32)和反向(33)引物与靶DNA(31)的各链杂交，使得通过PCR扩增产生双链扩增产物(34，35)，每个产物的一条链合并RNA碱基和标签二者。
使用合并来自正向引物(32)的RNA碱基和标签的扩增产物(34)作为实例显示PCR的第二个循环。在PCR的第二个循环中，反向(33)引物在扩增产物(34)的3'末端杂交并延伸以产生双链扩增产物(36)。在延伸反应期间，正向引物被复制。作为该过程的一部分，DNA聚合酶“校正”RNA碱基。因此，扩增产物(36)包含一条链，该链在5'末端包含反向引物(33)并且在3'末端包含含标签但不含RNA碱基的正向引物的反向互补物(37)。
该扩增产物(36)代表RNase H的底物，其断裂RNA碱基的5'末端并释放第一标签(38)。扩增产物(36)的顶部链的两个可替换的结局进一步显示于图11A中。首先，如果正向引物(32)与该链杂交，则在杂交时将产生RNase H活性的底物(39)。正向引物(32)被断裂，因此只能引导不合并标签的链的扩增(未显示)。因此，该产物不可用于第二轮扩增。其次，如果来自正向引物(32)的经断裂的标签充当引物，则其产生双链扩增产物(310)。在延伸反应期间，反向引物被复制。作为该过程的一部分，DNA聚合酶“校正”RNA碱基。因此，扩增产物(310)包含一条链(311)，该链在5'末端包含不含RNA碱基的正向引物(32)，并且在3'末端包含含标签但不含RNA碱基的反向引物的反向互补物。该链(311)是第二扩增反应的所需产物。该双链扩增产物(310)是RNase H的另一种底物，其断裂RNA碱基的5'末端并释放第二标签(312)。
对于链(311)，该链又有两个可替换的结局。首先，如果反向引物(33)与该链杂交，则在杂交时将产生RNase H活性的底物(未显示)。反向引物(33)被断裂，因此只能引导不合并标签的链的扩增(未显示)。
因此，该产物不可用于第二轮扩增。其次，如果来自反向引物(33)的断裂标签充当引物，则其产生不含RNA碱基并在分子的两端被标记的双链扩增产物(313)。这是引导第二扩增反应的所需产物。
在图11B中，基于来自第一扩增反应的双链扩增产物(313)的扩增显示了第二扩增反应。将双链扩增产物(313)的顶部链用于代表性目的，合并第一衔接子序列和标签1序列的通用正向引物(314)与标签1序列的反向互补物杂交并指导延伸以将衔接子合并在延伸产物(315)中。合并第二衔接子序列和标签2序列的通用反向引物(316)与标签2序列的反向互补物杂交并以延伸产物(315)作为模板指导延伸以将衔接子合并在延伸产物(317)中。该链在任一末端合并衔接子。使用通用正向引物(314)延伸该链(317)产生所需的双链产物(318)，其在任一末端合并衔接子序列。应注意，由于在相关的双链DNA环境中没有发现任何RNA核苷酸，RNase H无法对这些产物中的任一个起作用。因此，第二扩增反应的效率不受反应混合物中存在的RNase H的阻碍。
通过延迟通用底物的产生，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
图12显示了用于进行多步扩增的现有技术系统，其中两个反应步骤在单独的反应容器(管1和管2)中进行。
第一反应容器含有含待扩增的靶序列(9)的DNA双链体链(8)。设计第一正向引物(13)和第一反向引物(14)来扩增靶序列；即第一正向引物(13)包含与靶序列(12)的反义链杂交的引物区(10)，并且第一反向引物(14)包含与靶序列(12)的有义链杂交的引物区(11)。
第一正向引物(13)在其5'末端被第一通用标签(15)标记，并且第一反向引物(14)在其5'末端被第二通用标签(16)标记。在PCR扩增过程中，其机制是本领域公知的，第一正向引物(13)和第一反向引物(14)产生扩增产物(17)，其合并第一通用标签(15)和第二通用标签(16)。
在随后的第二反应容器(管2)中的反应中，使用第二正向引物(18)和第二反向引物(19)扩增来自管1的第一反应的扩增产物(17)。第二正向引物(18)自5’端至3’端包含第一衔接子序列(110)、可选的第一条形码序列(111)和与被合并在反义链中的第一通用标签(15)的互补物杂交的引物区(112)。第二反向引物(19)自5’端至3’端包含第二衔接子序列(113)、第二条形码序列(114)和与第二通用标签(16)的有义链杂交的引物区(115)。在PCR扩增期间，第二正向引物(18)和第二反向引物(19)产生另外的扩增产物(116)，其合并第一和第二通用标签(15、16)，第一和第二条形码(111、114)以及第一和第二衔接子序列(110、113)。
该系统效率低，劳动强度大。此外，在第一步之后停止和分离反应混合物的要求将可能的错误和污染引入系统。
图13说明了使用本发明的试剂组如何允许靶核酸分子的多步扩增在单一反应混合物中进行，这提供了优于先前方法的许多优点。
提供图13以说明在相同反应混合物或容器中平行发生的三个单独的扩增过程。
图13A显示了第一扩增。单一反应混合物含有含待扩增的靶序列(22)的DNA双链体链(21)。设计第一正向引物(23)和第一反向引物(24)来扩增靶序列；即第一正向引物(23)包含与靶序列(22)的反义链杂交的引物区(20)，并且第一反向引物(24)包含与靶序列(22)的有义链杂交的引物区(28)。
第一正向引物(23)在其5′末端被第一通用标签(25)标记，并且第一反向引物(24)在其5′末端被第二通用标签(26)标记。在PCR扩增过程中，其机制是本领域公知的，第一正向引物(23)和第一反向引物(24)产生扩增产物(27)，其合并第一通用标签(25)和第二通用标签(26)。
图13B显示与第一扩增平行发生的扩增。反应混合物还含有第一核酸分子(28)，其自5’端至3’端包含：核苷酸序列(29)，其是第一通用标签的反向互补物；可选地，核苷酸序列(210)，其是第一条形码的反向互补物；核苷酸序列(211)，其是第一衔接子序列的反向互补物；以及阻止超出衔接子序列(211)的延伸的封闭基团(227)。第一衔接子引物(212)与第一衔接子序列(211)的反向互补物杂交以产生扩增产物(213)，其自5’端至3’端包含：第一衔接子序列(214)、可选的第一条形码(215)和第一通用标签(216)。
反应混合物还含有第二核酸分子(217)，其自5’端至3’端包含：为第二通用标签的反向互补物的核苷酸序列(218)，可选地为第二条形码的反向互补物的核苷酸序列(219)，为第二衔接子序列的反向互补物的核苷酸序列(220)和阻止超出衔接子序列(220)的延伸的封闭基团(228)。第二衔接子引物(221)与第二衔接子序列(220)的反向互补物杂交以产生扩增产物(222)，其自5’端至3’端包含：第二衔接子序列(223)，可选地第二条形码(224)和第二通用标签(225)。
图13C显示了第二扩增。来自图13B的扩增产物213和225形成通用引物对，其中第一通用标签序列(216)和第二通用标签序列(223)充当引物以扩增来自第一扩增的扩增产物(27)。这产生了进一步扩增产物(226)，其包含第一和第二通用标签(25，26)、可选的第一和第二条形码(215，224)以及第一和第二衔接子(214，223)。进一步扩增产物可用于下游处理，通常涉及测序以检测和/或量化靶核酸分子。
第一和第二核酸分子(28，217)与第一和第二衔接子引物(212，221)的使用暂时延迟扩增产物213和222的产生。这允许靶核酸分子的第一扩增以产生经标记的扩增产物(27)。到扩增产物213和222(其作为通用引物进行第二扩增)已产生时，底物扩增产物(27)已经过量存在。
条款
如本文所述的改进可以各自有利地彼此组合以允许改进的方法。在下面的条款中更详细地描述了这种组合。
1.一种用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，包含：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的第一区域，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签
b.第二引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的至少部分与第一区域重叠的第二区域，包含：
i.第二正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签，该5'核酸标签与被合并在第一反向引物的5'末端的核酸标签在5'至3'方向上相同
ii.第二反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
其中，如果在第一反向引物和第二正向引物之间形成异常(短)扩增产物，则在异常(短)扩增产物的5'末端的核酸标签与在扩增过程中形成的异常(短)扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
2.根据条款1所述的引物组，其中所述第一正向引物和第二反向引物还合并引物区的5'核酸标签，其进一步的特征在于所述第一正向引物的核酸标签和第二反向引物的核酸标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在第一正向引物和第二反向引物之间形成异常(长)扩增产物，则在异常(长)扩增产物的5'末端的核酸标签和在扩增过程中形成的异常(长)扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
3.根据条款2所述的引物组，还包括：
a.第三引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的至少部分与第二区域重叠的第三区域，包含：
i.第三正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签
ii.第三反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区
其中所述第三正向引物的核酸标签和第二反向引物的核酸标签在5'至3'方向上也是相同的，使得如果在第三正向引物和第二反向引物之间形成异常(短)扩增产物时，则在异常(短)扩增产物的5'末端的核酸标签和扩增过程中形成的异常(短)扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
4.根据条款3所述的引物组，其中所述第三反向引物还合并所述引物区的5'核酸标签，其进一步的特征在于所述第二正向引物的核酸标签和第三反向引物的核酸标签在5'至3'方向上也是相同的，使得如果在第二正向引物和第三反向引物之间形成异常(长)扩增产物，则在异常(长)扩增产物的5'末端的核酸标签和扩增过程中形成的异常(长)扩增产物的3′末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
5.一种用于靶核酸分子的重叠区域的多重扩增的引物组，包括：
a.至少两个引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域，每个引物对包括：
i.正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签
ii.反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5'核酸标签，
其中每个引物对中的正向和反向引物的核酸标签是不同的，紧邻的引物对中的正向和反向引物的核酸标签在5'至3'方向上是相同的，使得如果在紧邻的引物对的正向和反向引物之间形成异常扩增产物，则在异常扩增产物的5'末端的核酸标签和在扩增过程中形成的异常扩增产物的3'末端的互补序列之间发生分子内杂交事件以形成二级结构，其阻止异常扩增产物的进一步扩增。
6.根据任一前述条款所述的引物组，其中核酸标签及其互补序列的Tm高于引物区的最高Tm。
7.根据条款5所述的引物组，其中核酸标签及其互补序列的Tm比引物区的最高Tm高至少2℃，可选最多高10℃。
8.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个标签的长度为至少4个核苷酸，可选最多20个核苷酸。
9.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个标签的长度为4、6、8或10个核苷酸。
10.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个标签包含富含GC的序列。
11.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个引物对旨在产生50-150个核苷酸的扩增产物。
12.根据任一前述条款所述的引物组，其中由紧邻的引物对产生的预期扩增产物之间的重叠水平为10-30个核苷酸。
13.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个标签显示与靶核酸分子没有同一性。
14.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个核酸标签包含通用标签。
15.根据条款14所述的引物组，其中每个引物对包含第一通用标签和第二通用标签。
16.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个引物对中的至少一个引物包括条形码，可选为分子条形码。
17.根据任一前述条款所述的引物组，其中每个引物包括条形码，可选为分子条形码。
18.用于多重核酸扩增的试剂盒，其包含如条款1至17中任一项所定义的引物组。
19.根据条款18所述的试剂盒，还包含以下各项中的至少一个：
a.通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
i.衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与多重扩增中使用的相应引物的通用标签(在5'
至3'方向上)相同
b.DNA聚合酶
c.dNTP
20.根据条款18或19所述的试剂盒，包含：
a.第一通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同
b.第二通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第二通用标签(在5'至3'方向上)相同
21.一种用于多重核酸扩增的反应容器，其包含如条款1至17中任一项所定义的引物组。
22.根据条款21所述的反应容器，还包含以下各项中的至少一个：
a.用于后续测序的通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
i.衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与多重扩增中使用的相应引物的通用标签(在5'至3'方向上)相同
b.DNA聚合酶
c.dNTP
23.根据条款21或22所述的试剂盒，包含：
a.第一通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同
b.第二通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第二通用标签(在5'至3'方向上)相同
24.根据条款18至20中任一项所述的试剂盒或根据条款21至23中任一项所述的反应容器，其进一步包含逆转录酶。
25.根据条款20所述的试剂盒或根据条款23所述的反应容器，其中第一衔接子序列与第二衔接子序列不同。
26.根据条款25所述的试剂盒或反应容器，其中第一衔接子序列是p5衔接子，并且第二衔接子序列是p7衔接子。
27.根据条款25所述的试剂盒或反应容器，其中第一衔接子序列是A衔接子，并且第二衔接子序列是P1衔接子。
28.一种多重核酸扩增反应，包括使用如条款1至17中任一项所定义的引物组扩增靶核酸分子的重叠区域，以产生经标记的扩增产物。
29.根据条款28所述的多重核酸扩增反应，其进一步包含额外的扩增以制备用于测序的经标记的扩增产物，所述额外的扩增反应利用通用引物，每个通用引物自5’端至3’端包含：
a.衔接子序列
b.可选的样本条形码序列
c.通用引物区，其与多重扩增中使用的相应引物的通用标签(在5'至3'
方向上)相同。
30.根据条款28或29所述的多重核酸扩增反应，其中通用引物形成通用引物对，包含：
a.第一通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同
b.第二通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第二通用标签(在5′至3'方向上)相同
31.根据条款30所述的多重核酸扩增反应，其中第一衔接子序列是p5衔接子，并且第二衔接子序列是p7衔接子。
32.根据条款30所述的多重核酸扩增反应，其中第一衔接子序列是A衔接子，并且第二衔接子序列是P1衔接子。
33.根据条款29-32中任一项所述的多重核酸扩增反应，其中所述测序是下一代测序。
34.一种用于靶核酸分子的多步扩增的引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与靶核酸分子的链杂交。
35.根据条款34所述的引物，其不包括RNA核苷酸下游的封闭基团。
36.根据条款34所述的引物，其自5’端至3’端包含：
a.通用标签
b.RNA核苷酸
c.与靶核酸分子的链杂交的引物区
d.另一RNA核苷酸
e.与靶核酸分子链杂交的另一区域
f.封闭基团。
37.根据条款34-36中任一项所述的引物，其中标签和/或引物区由DNA核苷酸组成。
38.根据条款34-37中任一项所述的引物，其进一步包含RNA核苷酸下游的条形码序列，可选分子条形码。
39.根据条款34至38中任一项所述的引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.最多4个核苷酸，其与靶核酸分子的链杂交
c.RNA核苷酸
d.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与靶核酸分子的链杂交，其中区域b和d都与相同的靶核酸分子杂交，使得RNA核苷酸与靶核酸分子中的DNA碱基配对。
40.一种引物对，其包含如条款34至39中任一项所述的正向和反向引物，用于扩增靶核酸分子。
41.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包括：
a.根据条款34至39中任一项所述的引物或如条款40中所定义的引物对
b.RNase H。
42.靶核酸分子的多步扩增，包括使用如条款34至39中任一项所述的引物，如条款40中所述的引物对或如条款41中所述的试剂组。
43.一种扩增靶核酸分子的方法，包括使用第一引物对在RNase H存在的情况下扩增靶核酸分子，所述引物对包含：
i.第一正向引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与靶核酸分子的链杂交
ii.第一反向引物，其自5’端至3’端包含：
a.通用标签，其不包含RNA核苷酸(不与初始靶核酸分子杂交)
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与靶核酸的链杂交
使得：
c.在第一轮扩增后，所述靶核酸分子被复制，并且第一扩增产物合并第一正向引物的通用标签和RNA核苷酸且第二扩增产物合并第一反向引物的通用标签和RNA核苷酸；
d.在第二轮扩增中，第一反向引物与第一扩增产物杂交以产生第三扩增产物，其合并第一正向引物的通用标签的互补物和RNA核苷酸的DNA互补物，并且第一正向引物与第二扩增产物杂交以产生第四扩增产物，其合并第一反向引物的通用标签的互补物和RNA核苷酸的DNA互补物，其中所述第三和第四扩增产物各自代表RNase H活性的底物，导致RNA核苷酸的断裂，从而限制了靶核酸分子的进一步扩增。
44.根据条款43所述的方法，其中第一正向引物和/或第一反向引物如条款34至39中任一项所定义。
45.根据条款34至39中任一项所述的引物，根据条款40所述的引物对或根据条款41所述的试剂组或根据条款42至44中任一项所述的扩增，其中：
a.RNase H是热稳定的，例如RNase H2，可选来自Pyrococcus abyssi'的RNaseH2，和/或
b.靶核酸分子包含基因组DNA或cDNA；和/或
c.靶核酸分子是双链或单链的。
46.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂盒，其包含根据条款34至39中任一项所述的引物，根据条款40中所述的引物对或根据条款41中所述的试剂组。
47.根据条款46所述的试剂盒，其进一步包含DNA聚合酶和dNTP中的至少一种。
48.根据条款1至17中任一项所述的引物组，其中所述组中的至少一种引物是根据条款34至39中任一项所述的引物。
49.根据条款1至17中任一项所述的引物组，其中所述组中的每个引物对包含根据条款34至39中任一项所述的引物。
50.根据条款1至17中任一项所述的引物组，其中所述组中的每个引物对包含根据条款40所述的引物对。
51.根据条款1至17中任一项所述的引物组，其中所述组中的每个引物是根据条款34至39中任一项所述的引物。
52.靶核酸分子的多重和多步扩增，包括使用根据条款48至51中任一项所述的引物组。
53.根据条款52所述的扩增，其中所述扩增包括多重核酸扩增反应，其包括扩增靶核酸分子的重叠区域。
54.根据条款52或53所述的扩增，包括采用以下各项的第二扩增：
a.第一通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第一通用标签(在5'至3'方向上)相同
b.第二通用引物，其自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.可选的样本条形码序列
iii.通用引物区，其与第二通用标签(在5'至3'方向上)相同
55.一种检测和/或量化靶核酸分子的方法，包括：
a.执行根据条款54所述的方法以产生合并通用标签和衔接子序列的扩增产物
b.对扩增产物进行测序以检测和/或量化靶核酸分子，可选地，其中所述测序是下一代测序。
56.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包含：
a.第一引物对，其被设计为扩增靶核酸分子，包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
b.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
c.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团
d.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
e.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用d和e的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物来扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
57.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包括：
a.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物，所述第一通用标签被合并在与靶核酸分子的链杂交的第一引物对的正向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团
b.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物，所述第二通用标签被合并在与靶核酸分子的链杂交的第一引物对的反向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团
c.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
d.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
其中使用c和d的第一和第二衔接子引物产生的扩增产物形成通用引物对，在其中第一和第二通用标签充当引物以扩增由第一引物对产生的扩增产物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
58.一种靶核酸分子的多步扩增方法，包括：
a.使用第一引物对扩增靶核酸分子，所述第一引物对包含：
i.第一正向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
以产生合并第一通用标签和第二通用标签的第一扩增产物，
b.使用与第一衔接子序列的反向互补物杂交的第一衔接子引物扩增第一核酸分子，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一通用标签
c.使用与第二衔接子序列的反向互补物杂交的第二衔接子引物扩增第二核酸分子，所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二通用标签
d.使用步骤b和c的扩增产物作为通用引物对来扩增由第一引物对产生的扩增产物，其中第一和第二通用标签充当引物以产生合并第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物，其中该方法在单一反应混合物中进行。
59.一种检测和/或量化靶核酸分子的方法，包括：
a.执行根据条款58所述的方法以产生进一步扩增产物
b.对进一步扩增产物进行测序以检测和/或量化靶核酸分子，可选地，其中所述测序是下一代测序。
60.根据条款56至59中任一项所述的试剂组或方法，其中：
a.第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第一条形码(优选样本条形码)的反向互补物，
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团，以及
b.第一衔接子引物与第一衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，该扩增产物以5'到3'的顺序包含：
i.第一衔接子序列
ii.第一条形码，优选第一样本条形码
iii.第一通用标签
并且其中所述进一步扩增产物合并第一和第二通用标签、第一条形码(优选第一样本条形码)，以及第一和第二衔接子。
61.根据条款56至60中任一项所述的试剂组或方法，其中：
a.第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第二条形码(优选样本条形码)的反向互补物，
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团，以及
b.第二衔接子引物与第二衔接子序列的反向互补物杂交以产生扩增产物，该扩增产物以5′到3′的顺序包含：
i.第二衔接子序列
ii.第二条形码，优选第二样本条形码
iii.第二通用标签
并且其中所述进一步扩增产物合并第一和第二通用标签、第二条形码(优选第二样本条形码)，以及第一和第二衔接子。
62.根据条款56至61中任一项所述的试剂组或方法，其中靶核酸分子是DNA。
63.根据条款56至62中任一项所述的试剂组或方法，其中靶核酸分子是RNA。
64.根据条款56至63中任一项所述的试剂组或方法，其中靶核酸分子：
a.从福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织中提取；或者
b.是无细胞DNA，可选地：
i.从母体血流中获得的无细胞胎儿DNA；或者
ii.从体液，可选的血液、尿液或脊髓液中获得的无细胞DNA；或者
iii.无细胞肿瘤DNA
c.来源于血液。
65.一种形成通用引物的反向互补物的核酸分子，自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码(优选样本条形码)的反向互补物
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团。
66.一种根据条款65所述的核酸分子与引物的组合，该引物与衔接子序列的反向互补物杂交以产生通用引物作为扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的衔接子序列
b.可选的样本条形码
c.标签。
67.第一核酸分子与第二核酸分子的组合，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码(优选样本条形码)的反向互补物
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出第一衔接子序列的封闭基团。
所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
e.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
f.可选的核苷酸序列，其是条形码(优选样本条形码)的反向互补物
g.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
h.防止延伸超出第二衔接子序列的封闭基团。
68.根据条款67所述的核酸分子的组合，该组合含有：
a.第一衔接子引物，其与第一衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的第一衔接子序列
b.可选的第一条形码序列，优选样本条形码
c.第一通用标签
d.第二衔接子引物，其与第二衔接子序列的反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的第二衔接子序列
b.可选的第二条形码序列，优选样本条形码
c.第二通用标签。
69.根据条款56至68中任一项所述的试剂组、方法、核酸分子或组合，其中衔接子序列是用于下一代测序的衔接子序列。
70.根据条款59至70中任一项所述的试剂组、方法、核酸分子或组合，其中每个条形码的长度为至少4、6或8个核苷酸，可选最多20个核苷酸。
71.根据条款56至70中任一项所述的试剂组、方法、核酸分子或组合，其中每个标签的长度为至少20个核苷酸，可选最多30个核苷酸。
72.根据条款56至71中任一项所述的试剂组、方法、核酸分子或组合，其中所述封闭基团选自以下各项：3'ddC、3'反向dT、3'C3间隔区、3'氨基和3'磷酸化。
73.一种多步骤核酸扩增反应，包括使用如条款56至72中任一项所定义的试剂组扩增靶核酸分子以产生合并标签和衔接子序列的扩增产物。
74.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂盒，其包含根据条款56至72中任一项所述的试剂组、核酸分子或组合。
75.根据条款74所述的试剂盒，其进一步包含DNA聚合酶和dNTP中的至少一种。
76.根据条款56至72中任一项所述的试剂组，其包含引物组，所述引物组包含至少第一和第二引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域。
77.根据条款77所述的试剂组，其中所述引物组包含如条款1至17中任一项所述的引物组。
78.靶核酸分子的多重和多步扩增，包括使用如条款76或77中所述的试剂组。
79.一种检测和/或量化靶核酸分子的方法，包括：
a.执行根据条款78所述的扩增，以产生合并通用标签和衔接子序列的扩增产物
b.对扩增产物进行测序以检测和/或量化靶核酸分子，可选地，其中所述测序是下一代测序。
80.根据条款56至72中任一项所述的试剂组，其中第一引物对中的至少一种引物是根据条款34至41中任一项所述的引物。
81.根据条款56至72中任一项所述的试剂组，其中第一引物对中的两个引物均为条款34至41中任一项所述的引物。
82.根据条款56至72中任一项所述的试剂组，其中被设计为扩增靶核酸分子的每种引物是根据条款34至41中任一项所述的引物。
83.靶核酸分子的多步扩增，包括使用如条款80至82中任一项所述的试剂组。
84.检测和/或量化靶核酸分子的方法，包括：
a.执行根据条款83所述的扩增，以产生合并通用标签和衔接子序列的扩增产物
b.对扩增产物进行测序以检测和/或量化靶核酸分子，可选地，其中所述测序是下一代测序。
85.根据条款56至72中任一项所述的试剂组，其包含引物组，所述引物组包含至少第一和第二引物对，其被设计为扩增靶核酸分子的重叠区域。
86.根据条款85所述的试剂组，其中所述引物组包含如条款48至51中任一项所述的引物组。
87.靶核酸分子的多重和多步扩增，包括使用如条款85或86所述的试剂组。
88.根据条款87所述的扩增，其中扩增包括多重核酸扩增反应，其包括扩增靶核酸分子的重叠区域。
89.一种检测和/或量化靶核酸分子的方法，包括：
a.执行根据条款87或88所述的扩增，以产生合并通用标签和衔接子序列的扩增产物
b.对扩增产物进行测序以检测和/或量化靶核酸分子，可选地，其中所述测序是下一代测序。
现在通过以下说明性的非限制性实例将更好地理解本发明。
实例
改进涉及重叠靶序列的多重扩增的实例
实例1-在重叠扩增子的多重扩增中,在相邻引物对之间使用相互排列的相同标签减少了异常产物的形成
方法
进行实验以证明用于重叠扩增子的一步多重化按理论预期进行。作为概念验证，使用BRCA肿瘤MASTR Dx测定(Multiplicom NV，比利时)。该测定产生181个扩增子，使用重叠引物对扩增其中173个扩增子。因此，当将扩增作为用含有标签序列的规则排列的原始引物组进行的多重反应(即作为单一PCR反应)执行时，存在产生比预期PCR产物短的异常PCR片段的可能性。为了显示本发明可作为该问题的解决方案，重新设计相关的引物组，使得标签序列满足重叠扩增子的一步多重化的要求(即如本文所解释的引物对之间的引物上的标签的往复排列)。因此，在现有的引物组中，每个正向引物含有标签1，且每个反向引物含有标签2。在重新设计的引物中，相邻的引物对具有相反的标签方向(正向引物1-标签1，反向引物1-标签2；正向引物2-标签2，反向引物2-标签1等)。标签1序列作为SEQ ID NO：1被提供，且标签2序列作为SEQ ID NO：2被提供。
两种引物组均用于标准的2步PCR方案，其中实验条件在使用该测定的说明书中概述。简而言之，对于每个引物组，使用50ng基因组模板DNA建立一个多重PCR反应，并使第一PCR反应进行20个循环。将得到的扩增子稀释1000倍，随后将2μl该稀释的产物用于标准的，有20个循环的第二PCR。
结果
在片段分析仪上分析两个实验的所得PCR产物(图7和图8)。
图7显示，使用标准BRCA肿瘤MASTR Dx引物的大多数单一PCR反应条件导致PCR产物的形成，其大小范围与在重叠扩增子的引物之间形成的短的、不需要的扩增子一致，并且更短的扩增子的形成优先于预期的(更长的)扩增子的形成。
从图8清楚可见，调整附着于BRCA肿瘤引物对的标签序列使其符合重叠扩增子的一步多重化，在该实验中仅形成预期的扩增子，并且不存在短的，不需要的扩增子。
通过延迟通用底物的产生，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
实例2-可以使用与反向互补序列的衔接子部分杂交的引物扩增反向互补序列以产生通用引物
方法
进行了第一次概念验证实验，以证明合并特定衔接子(和条形码)序列的通用引物的反向互补物以及衔接子序列引物(在这些实例中分别被称为rcMID和p5/p7引物)可以替代常规通用引物(在这些实例中被称为MID引物)以产生预期的扩增子。至此，使用常规MID序列和rcMID+p5/p7引物执行2步PCR方案以扩增商业测定的所有靶扩增子(HNPCC MASTR)。该程序如HNPCC使用说明书文件(www.multiplicom.com/product/hnpcc-mastr)中所述进行。使用如使用说明书中所述的HNPCC MASTR试剂盒执行基于多重PCR的靶向扩增条件，对其加以修改后使用，所述修改是将所有HNPCC引物在1个反应中混合而不是在5个单独的组中。简而言之，使用50ng基因组模板DNA建立含有所有HNPCC引物对的一个多重PCR反应，并使第一PCR反应进行20个循环。将得到的扩增子稀释1000倍，随后将2μl该稀释的产物用于有20个循环的第二轮PCR，该轮PCR采用MID或rcMID+p5/p7引物进行。
进行第二次概念验证实验以证明rcMID+p5/p7引物与第一PCR引物对一起可以在一步反应中产生预期的扩增子。至此，来自第一组BRCA肿瘤MASTR加上Dx商业测定(www.multiplicom.com/product/brca-tumor-mastr-plus-dx)的第一个PCR引物对作为使用MID引物的2步PCR或作为使用rcMID+p5/p7引物的一步PCR进行。在20个PCR循环中的每一个中以2个反应进行2步PCR。在历经30个PCR循环的单一反应中进行一步PCR。对于两个实验，使用50ng输入基因组DNA。
P5引物序列作为SEQ ID NO：3被提供，且P7引物序列作为SEQ ID NO：4被提供。
rcMID序列(其中每个用3'反向dT封闭基团封闭)作为SEQ ID No 5-24被提供。延伸SEQ ID No 5-14以使用P5引物产生用于第二阶段扩增的MID引物。它们含有标签1序列的反向互补物，并且各自包括紧邻标签序列下游的不同条形码序列。延伸SEQ ID No 15-24以使用P7引物产生用于第二阶段扩增的MID引物。它们含有标签2序列的反向互补物，并且各自包括紧邻标签序列下游的不同MID序列。
结果
第一次概念验证实验的结果如图14所示。图14呈现出片段分析结果，在X轴上显示扩增子的长度，在Y轴上显示每个扩增子的产量，产量由每个峰的高度表示(高度越高，产量越高)。
图14的左上图显示了使用常规MID引物的第二PCR的片段分析结果，得到该测定的预期片段分析图谱。右上图显示了使用rcMID+p5/p7引物的第二PCR的片段分析结果。得到的图谱与左上图相同，仅总产量较低。这可以通过以下事实来解释：来自rcMID引物的MID引物的产生延迟了第二PCR的开始，导致产量较低。
此外，从下图中清楚地看出要求提供利用rcMID和P5/P7的反应以获得成功的第二PCR。左下图显示当仅将P5和P7引物加入到反应中时不存在扩增产物。右下图显示在没有p5/P7引物的情况下仅添加rcMID引物时不存在扩增。
图15更详细阐述了用MID和rcMID+P5/P7引物获得的结果的片段分析结果。该图清楚地显示两种扩增的图谱是相同的，并且rcMID+p5/p7反应仅产量较低(下图)。
第二次概念验证实验的结果显示在图16中。从该图中可以清楚地看到，所有预期的扩增子都存在于一步PCR设置中(尽管产量较低；注意Y轴不相同)。此外，在一步PCR中观察到存在另外的扩增子。这些额外的扩增子是第一PCR产物扩增子的相对丰富的结果，导致在最终扩增子的一端或两端扩增子缺失MID引物。然而，该数据清楚地表明rcMID+P5/P7系统允许两种扩增在相同的单一反应混合物中进行(一步反应)。
通过延迟通用引物的产生并且通过控制第一扩增反应的程度，在单一反应混合物中实现多步扩增反应
实例3-一步反应
进行概念验证实验以证明：与结合rcMID+p5/p7引物的，不含RNA的第一PCR引物对相比，结合rcMID+p5/p7引物的正向和反向引物(即引物对)(各自在引物区(与初始靶DNA分子中的靶序列杂交)和标签序列(第一PCR引物对)之间具有RNA碱基)在一步反应(即，在同一反应容器中平行进行第一和第二扩增的反应)中产生较少的不需要的短PCR产物。
使在引物区和来自第一组BRCA肿瘤MASTR加上Dx商业测定(www.multiplicom.com/product/brca-tumor-mastr-plus-dx)的标签之间的，具有和不具有RNA碱基的第一PCR引物对与rcMID+p5/p7引物在单管中混合。意图产生包括合适衔接子的第二轮扩增产物的一步PCR在历经30个PCR循环的单一反应中进行。对于两个实验，使用50ng输入基因组DNA。与标准(靶特异性)多重PCR反应中使用的引物浓度相比，第一引物的引物浓度为1：8。还以9.1mU/反应(或0.45mU/μl)的浓度将热稳定的RNase H2(IDT)加入到反应中。
结果
概念验证实验的结果显示在图17和18中。这些图呈现出片段分析结果，在X轴上显示扩增子的长度，在Y轴上显示每个扩增子的产量，产量每个峰的高度表示(峰越高，产量越高)。
预期没有含有RNA碱基的第一引物对的一步反应将主要产生对应于用第一引物对扩增的扩增产物。这些扩增产物比使用通用(MID)引物产生的，在第二扩增后出现的所需扩增产物短。从图17中可以非常清楚地看到这一结果。
图17A的上图显示了第一引物对中没有RNA碱基的一步PCR的片段分析结果。图17B的中间图显示了相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表第一PCR产物的预期大小。从图17B清楚可见，所有形成的扩增子都是从第一(靶特异性)扩增预期的短扩增子，而来自通用PCR的第二轮扩增子则不存在。图17C证实了这一点；这里的箱(灰色条带)代表通用PCR后PCR产物的预期大小。
相反，预期使用含有RNA碱基的第一引物对的一步反应将主要产生由第二轮通用PCR产生的所需扩增产物。那些扩增产物比用第一引物对产生的预期片段长。从图18中可以非常清楚地看到这一结果。
图18A的上图显示了在第一引物对中具有RNA碱基的一步PCR的片段分析结果。图18C的下图显示了相同的结果，但具有箱覆盖(灰色条带)，其中每个箱代表通用PCR产物的预期大小。从图18C清楚可见，大多数形成的扩增子是第二轮通用扩增预期的长扩增子，而来自第一PCR的扩增子则不存在。图18B证实了这一点；这里的箱(灰色条带)代表第一PCR后PCR产物的预期大小。
该概念验证实验清楚地表明，在第一引物对中添加RNA碱基允许通过一步反应进行靶特异性和通用扩增，从而形成所需的通用PCR大小的产物。相反，在第一引物对中不包含RNA碱基的情况下，仅观察到第一PCR所预期的扩增产物。
本发明不限于本文所述的特定实施例的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将根据前面的描述和附图而变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求书的范围内。此外，视情况而定，本文描述的所有实施例被认为可广泛应用并且可与任何和所有其他一致的实施例组合。
本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用整体并入。
序列表
<110> 姆提普力科姆公司
尤尔根·彼得洛德·戴尔法韦罗
利恩·赫曼
巴特·泰根波士
德克·古森斯
约阿希姆·德-斯赫雷弗
<120> 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
<130> KP10281WO
<150> GB1621477.7
<151> 2016-12-16
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
gcgatcgtca ctgttctcca 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> p5的反向互补序列
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ggagatgctg ccgagtcttt cctctgtcga ctatactagg tgtagatctc ggtggtcgcc 60
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<223> p5的反向互补序列
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ggagatgctg ccgagtcttt cctctgtcga cgcttgactg tgtagatctc ggtggtcgcc 60
gtatcatt 68
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ctgcttg 67
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ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gtgatagtga ggaatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
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<223> p7的反向互补序列
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ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gatcaaaggg caaatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<223> p7的反向互补序列
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ctgcttg 67
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<223> p7的反向互补序列
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ctgcttg 67
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<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
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<220>
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<220>
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ctgcttg 67
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<400> 21
ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gactgccatt aacatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 22
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> 标签2的反向互补序列
<220>
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<223> p7的反向互补序列
<400> 22
ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gttggccact tccatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 23
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 标签2的反向互补序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(43)
<223> MID 序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(67)
<223> p7的反向互补序列
<400> 23
ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gattcctgtg agtatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
<210> 24
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 标签2的反向互补序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(43)
<223> MID 序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(67)
<223> p7的反向互补序列
<400> 24
ggagaacagt gacgatcgct tgggacctag gccatggaca cagatctcgt atgccgtctt 60
ctgcttg 67
Claims (16)
1.一种用于靶核酸分子的多步扩增的引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与所述靶核酸分子的链杂交。
2.根据权利要求1所述的引物，其自5’端至3’端包含：
a.通用标签
b.RNA核苷酸
c.与所述靶核酸分子的链杂交的引物区
d.另一RNA核苷酸
e.与所述靶核酸分子的链杂交的另一区域
f.封闭基团。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.最多4个核苷酸，其与所述靶核酸分子的链杂交
c.RNA核苷酸
d.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与所述靶核酸分子的链杂交，其中区域b和d都与相同的靶核酸分子杂交，使得RNA核苷酸与所述靶核酸分子中的DNA碱基配对。
4.一种引物对，其包含用于扩增靶核酸分子的根据权利要求1至3中任一项所述的正向和反向引物。
5.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包含：
a.根据权利要求1至3中任一项所述的引物或根据权利要求4所述的引物对
b.RNase H。
6.一种靶核酸分子的多步扩增，包括使用根据权利要求1至3中任一项所述的引物，根据权利要求4所述的引物对或根据权利要求5所述的试剂组。
7.一种扩增靶核酸分子的方法，包括使用第一引物对在RNase H存在的情况下扩增所述靶核酸分子，所述引物对包含：
i.第一正向引物，其自5’端至3’端包含：
a.不包含RNA核苷酸的通用标签
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与所述靶核酸分子的链杂交
ii.第一反向引物，其自5’端至3’端包含：
a.通用标签，其不包含RNA核苷酸(不与所述初始靶核酸分子杂交)
b.RNA核苷酸
c.引物区，其不包含RNA核苷酸并且与所述靶核酸的链杂交
使得：
a.在第一轮扩增后，所述靶核酸分子被复制，并且第一扩增产物合并所述第一正向引物的所述通用标签和RNA核苷酸且第二扩增产物合并所述第一反向引物的所述通用标签和RNA核苷酸；
b.在第二轮扩增中，所述第一反向引物与所述第一扩增产物杂交以产生第三扩增产物，其合并所述第一正向引物的所述通用标签的互补物和所述RNA核苷酸的DNA互补物，并且所述第一正向引物与所述第二扩增产物杂交以产生第四扩增产物，其合并所述第一反向引物的所述通用标签的互补物和所述RNA核苷酸的DNA互补物，其中所述第三和第四扩增产物各自代表RNase H活性的底物，导致RNA核苷酸的断裂，从而限制了所述靶核酸分子的进一步扩增。
8.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包括：
a.第一引物对，其被设计为扩增所述靶核酸分子，包含：
i.第一正向引物，其合并与所述靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与所述靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
b.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是所述第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出衔接子序列的封闭基团
c.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出所述第二衔接子序列的封闭基团
d.第一衔接子引物，其与所述第一衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第一衔接子序列
ii.所述第一通用标签
e.第二衔接子引物，其与所述第二衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第二衔接子序列
ii.所述第二通用标签
其中使用d和e的所述第一和第二衔接子引物产生的所述扩增产物形成通用引物对，其中所述第一和第二通用标签充当引物来扩增由所述第一引物对产生的扩增产物，以产生合并所述第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
9.一种用于靶核酸分子的多步扩增的试剂组，包括：
a.第一核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物，所述第一通用标签被合并在与所述靶核酸分子的链杂交的第一引物对的正向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出所述第一衔接子序列的封闭基团
b.第二核酸分子，其自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物，所述第二通用标签被合并在与所述靶核酸分子的链杂交的所述第一引物对的反向引物中
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iii.阻止延伸超出所述第二衔接子序列的封闭基团
c.第一衔接子引物，其与所述第一衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第一衔接子序列
ii.所述第一通用标签
d.第二衔接子引物，其与所述第二衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第二衔接子序列
ii.所述第二通用标签
其中使用c和d的所述第一和第二衔接子引物产生的所述扩增产物形成通用引物对，其中所述第一和第二通用标签充当引物来扩增由所述第一引物对产生的扩增产物以产生合并所述第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物。
10.一种靶核酸分子的多步扩增方法，包括：
a.使用第一引物对扩增所述靶核酸分子，所述第一引物对包含：
i.第一正向引物，其合并与所述靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第一通用标签
ii.第一反向引物，其合并与所述靶核酸分子的链杂交的引物区和所述引物区的5’端第二通用标签
以产生合并所述第一通用标签和所述第二通用标签的第一扩增产物，
b.使用与第一衔接子序列的反向互补物杂交的第一衔接子引物扩增第一核酸分子，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是所述第一通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的所述第一衔接子序列的所述反向互补物
iii.阻止延伸超出所述第一衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第一衔接子序列
ii.所述第一通用标签
c.使用与第二衔接子序列的反向互补物杂交的第二衔接子引物扩增第二核酸分子，所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是所述第二通用标签的反向互补物
ii.核苷酸序列，其是后续处理所需的所述第二衔接子序列的所述反向互补物
iii.阻止延伸超出所述第二衔接子序列的封闭基团
以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
i.所述第二衔接子序列
ii.所述第二通用标签
d.使用步骤b和c的所述扩增产物作为通用引物对来扩增由所述第一引物对产生的所述扩增产物，其中所述第一和第二通用标签充当引物以产生合并所述第一和第二通用标签和衔接子的进一步扩增产物，其中所述方法在单一反应混合物中进行。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的试剂组或方法，其中：
a.第一核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是所述第一通用标签的所述反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第一条形码，优选样本条形码的反向互补物，
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出所述衔接子序列的封闭基团，以及
b.所述第一衔接子引物与所述第一衔接子序列的所述反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物以5'到3'的顺序包含：
i.所述第一衔接子序列
ii.所述第一条形码，优选第一样本条形码
iii.所述第一通用标签
并且其中所述进一步扩增产物合并所述第一和第二通用标签、第一条形码，优选第一样本条形码，以及第一和第二衔接子。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的试剂组或方法，其中：
a.所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
i.核苷酸序列，其是所述第二通用标签的所述反向互补物
ii.核苷酸序列，其是第二条形码，优选样本条形码的反向互补物，
iii.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
iv.阻止延伸超出所述衔接子序列的封闭基团，以及
c.所述第二衔接子引物与所述第二衔接子序列的所述反向互补物杂交以产生扩增产物，所述扩增产物以5'到3'的顺序包含：
i.所述第二衔接子序列
ii.所述第二条形码，优选第二样本条形码
iii.所述第二通用标签
并且其中所述进一步扩增产物合并所述第一和第二通用标签、第二条形码，优选第二样本条形码，以及第一和第二衔接子。
13.一种形成通用引物的反向互补物的核酸分子，自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是标签的反向互补物
b.任选的核苷酸序列，其是条形码，优选样本条形码的反向互补物
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出所述衔接子序列的封闭基团。
14.一种根据权利要求13所述的核酸分子与引物的组合，所述引物与所述衔接子序列的所述反向互补物杂交以产生通用引物作为扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的所述衔接子序列
b.可选的样本条形码
c.标签。
15.一种第一核酸分子与第二核酸分子的组合，所述第一核酸分子自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是第一通用标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码序列，优选样本条形码的反向互补物
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的第一衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出所述第一衔接子序列的封闭基团；
所述第二核酸分子自5’端至3’端包含：
a.核苷酸序列，其是第二通用标签的反向互补物
b.可选的核苷酸序列，其是条形码序列，优选样本条形码的反向互补物
c.核苷酸序列，其是后续处理所需的第二衔接子序列的反向互补物
d.阻止延伸超出所述第二衔接子序列的封闭基团。
16.根据权利要求15所述的核酸分子的组合，所述组合含有：
a.第一衔接子引物，其与所述第一衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
a.后续处理所需的所述第一衔接子序列
b.可选的所述第一条形码序列，优选样本条形码
c.所述第一通用标签
d.第二衔接子引物，其与所述第二衔接子序列的所述反向互补物杂交，以产生扩增产物，所述扩增产物自5’端至3’端包含：
e.后续处理所需的所述第二衔接子序列
f.可选的所述第二条形码序列，优选样本条形码
g.所述第二通用标签。
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