KR20110138387A - Ｆｍｒ１ 및 ｆｍｒ２ 유전자의 ５´ 비번역 영역을 규명하기 위한 ｐｃｒ 방법 - Google Patents

Ｆｍｒ１ 및 ｆｍｒ２ 유전자의 ５´ 비번역 영역을 규명하기 위한 ｐｃｒ 방법 Download PDF

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리앙징 첸
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Abstract

본 공개내용은 트리뉴클레오타이드(예를 들면, CGG) 반복부 영역 내에 AGG 또는 인터럽터 요소의 존재 및 위치를 결정하는 방법 및 1 이상이 CGG 반복부 영역의 일부를 포함하는 프라이머 세트에 의해 생성물 세트를 증폭하고 생성물을 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻음으로써 이 영역 내에 존재하는 반복부 수를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＦＭＲ１ 및 ＦＭＲ２ 유전자의 ５´ 비번역 영역을 규명하기 위한 ＰＣＲ 방법{PCR METHODS FOR CHARACTERIZING THE 5' UNTRANSLATED REGION OF THE FMR1 AND FMR2 GENES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2009년 3월 24일자에 출원된 미국 가출원 제61/162,977호의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 특히 GC 풍부 주형 및 생성물과 관련하여 DNA 합성 및 분석의 분야에 관한 것이다.
일반적인 설명
DNA 폴리머라제의 최초 분리 및 DNA가 실험실내 합성될 수 있는 조건의 결정 이후에, 생명공학, 의학 및 연구 분야에서 DNA 합성 반응이 제조 및 분석 목적에 널리 사용되고 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR(polymerase chain reaction)은 DNA 서열이 신속하게 그리고 기하급수적으로 증폭될 수 있는 DNA 합성 반응의 일 유형이다. 다른 사이클 합성 반응과 같이, 이것은 사이클 방식으로 표적 서열을 반복적으로 복제하는 것을 포함한다. 통상적인 PCR 실행은 증폭시키고자 하는 서열의 말단에 상보성인 프라이머, 적합한 완충제, 마그네슘염, 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및 호열성 DNA 폴리머라제를 제공하는 것을 포함한다. 예를 들면, 게놈 DNA 샘플 내에 포함된 주형 또는 표적 DNA를 수용액 중에 이들 성분들에 노출시킨다. 이 혼합물을 주형의 변성, 주형에 대한 프라이머의 어닐링 및 이후 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장, 더 많은 생성물의 생성을 촉진하는 여러 온도에서의 단계에 걸쳐 순환시킨다. 각 사이클의 생성물이 후속 반응에서 주형으로서 이용가능하므로, (초기 과량 존재하는) 다른 반응 성분이 고갈될 때까지 생성물의 양은 거의 기하급수적으로 증가한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,683,202호; 문헌[M. J. McPherson & S. G. Moller, PCR: Basics (2nd Ed., Taylor & Francis) (2006)]을 참조한다.
PCR은, 다른 유형의 사이클 핵산 합성 반응과 함께, 분자 생물학, 생명공학 및, 점점더, 의약에서 표준 도구이다. PCR 및 관련 기술의 중요한 이점은 신속성, 저비용, 민감성, 고속 분석에 대한 적응성 및 융통성이다. 증폭은 단지 몇 시간 또는 그 이하를 요하고, 작은 개별 반응은 시약에 미국 1 달러보다 훨씬 적게 소모할 수 있고, 필요한 주형의 양은 통상적으로 나노그램 범위이고, 자동화는 로봇마다 1일 수천 가지의 반응을 실행할 수 있게 하고, 거의 모든 서열을 증폭하도록 프라이머를 설계할 수 있다.
PCR 및 관련 기법은 분석 및 제조 분야 둘 다에 널리 채택되고 있다. 통상적인 PCR 제조 분야는 서열을 증폭하여 이것이 이종 벡터에서 클로닝될 수 있게 하는 것이다. 중요한 PCR 분석 분야는 병증의 진단 또는 크기 다형성을 갖는 유전자좌를 포함하는 유전자형의 결정을 포함한다.
의학적으로 관련 있는 크기 다형성을 나타내는 유전자좌의 예는 X 염색체 상 인간 FMR1 유전자의 5' 비번역 영역(UTR; untranslated region)이다. 정상인 개체는 통상적으로 이 영역 내에 5∼44개의 CGG 반복부를 갖는다. 반대로, 200개 내지 2000개 또는 그 이상의 CGG 반복부를 포함하는 이 유전자좌의 대립유전자는 취약 X 염색체 증후군(FXS; Fragile X syndrome)을 시사한다. 이 대립유전자를 완전 돌연변이 대립유전자라 칭한다. 이 대립유전자는 유전적으로 불안정하다. FXS를 갖는 개체는 실조증, 조기 난소 부전증, 학습 장애 및 다른 인지/행동 장애, 예컨대 자폐증 유사 증후군과 같은 다양한 증후군 조합을 가질 수 있다.
PCR의 다능성에 대한 한가지 불운한 예외는 FMR1 5'UTR의 완전 돌연변이 대립유전자를 비롯하여 긴 고도 GC 풍부 서열의 증폭의 어려움에 있다. FMR1 PCR을 최적화하기 위한 시도는 종래 PCR 분석 조건을 변경하는 것을 포함한다. 문헌[Genome Res. 6(7):633-8 (1996); Nucleic Acids Res. 25(19):3957-8 (1997); J. Mol. Diagn 8:544-550 (2006); Am. J. Med. Genet. 51(4):527-34 (1994)]을 참조한다. FMR1 PCR 분석 개발 15년 훨씬 후에, 최근 2008년(Genet. Med. 10(10):714-9 (2008))에 신생아에서 취약 X 염색체를 검출하기 위한 공개된 선도적 스크리닝 연구는 "암컷에서 FMR1 반복부 수를 결정하기 위한 인-하우스 검정 과정에서 사용된 … 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석의 2가지 방법이 신뢰할 만하고 재현 가능한 결과를 생성하지 못했다(two methods of quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis … used in the in-house validation process to determine the FMR1 repeat number in females failed to produce reliable and reproducible results)"(강조 부가)고 보고하고 있으며, 추가로, "제1 또는 제2 단리 중 어느 하나로부터의 제2 [PCR] 실패는 비정상 FMR1 CGG 반복부 크기를 고도로 시사한다(a second [PCR] failure from either the first or secondary isolation was highly suggestive of an abnormal FMR1 CGG repeat size)"고 보고하고 있다. 따라서, 당해 분야의 당업자는 완전 돌연변이 취약 X 염색체 대립유전자의 재현 가능한 PCR 증폭을 여전히 미해결 문제점으로 보고 있다.
PCR에 의한 약 100개 이상의 반복부를 포함하는 CGG 3중 반복부 영역의 검출은 반복부 수가 증가하면서 계속해서 약해지는 것으로 관찰되었다. J. Mol. Diagn. 7:605-12 (2005). 이러한 어려움은, FXS 증후군의 이종 성질과 조합되어, 완전 돌연변이 대립유전자를 검출하기 위한 사우던 블로팅과 같은 절차의 이용의 원인이 되었다. Id. 사우던 블로팅은 일반적으로 PCR보다 더 시간 소모적이고, 고비용이며, 고속 실행에 훨씬 덜 적응 가능하다.
Tassone 등에 의한 최근 간행물(J. Mol. Diagn. 10:43-49 (2008); "Tassone 2008")에는 대립유전자의 완전 길이 증폭 없이 더 긴 CGG 대립유전자의 존재를 시험하기 위한 분석이 기재되어 있다. 또한 WO 제2008/011170호 참조. 상기 방법은 연장된 CGG 영역 내 위치에 하이브리드화하는 키메라 PCR 프라이머를 이용하여, 넓게 퍼진 모양의 PCR 생성물의 존재는 연장된 대립유전자에 대한 긍정적인 결과를 나타낸다. Id [46에서].
무작위 하이브리드화 전략은 비특이적 증폭 및 분해능 부족을 발생시킬 수 있다. 이 문서에서 이용되는 기본 PCR 조건은 많은 상이한 실험실에서 널리 시험되고 있으며, 성공적으로 증폭될 수 있는 CGG 반복부의 최대 수는 약 350개의 CGG 반복부인 것으로 보인다. 예를 들면, 문헌[Saluto et al., J. Mol. Diagn. 7:605-612 (2005)]을 참조한다. 비특이적 증폭은 Tassone 2008 문헌에서 명백하다. Tassone 2008 문헌에서 도 1로 도시된 아가로스 겔 상의 퍼진 모양은 350개의 반복부 함유 앰플리콘의 예상된 최대 길이보다 긴 생성물을 포함하는 것으로 보이고, 따라서 퍼진 모양의 대부분이 CGG 반복부 특이적 생성물을 나타내지 않을 수 있다(Tassone 2008 문헌의 도 1 참조; 5 레인에서의 퍼진 모양은 로딩 웰 부근으로 연장되는 것으로 보인다). Tassone 등은 도 3 범례에서 그들이 분자량 마커로서 하이-로우 래더(High-Low ladder)(Bionexus, Oakland, CA)를 사용하였다고 명시하였고, 도 1에서의 마커는 도 3에서와 동일한 것으로 보인다. 하이-로우 래더의 가장 큰 밴드는 대략 10 kb이고, 도 1에서의 퍼진 모양은 그 밴드 위로 연장된다. 이 길이는 또한 분석에 사용된 샘플의 예상된 완전 길이 생성물보다 더 길다. 가장 긴 대립유전자 크기는 615개의 CGG 반복부로서 기재되어 있다. 따라서, 완전 길이 생성물은 약 2 kb인 것으로 예상되고, 이것은 약 200번째의 플랭킹 서열을 1845번째의 반복부에 첨가함으로써 추산된다. 비특이적 생성물은 취약 X 염색체 연관 대립유전자 상태와 관련하여 증폭 기반 결정의 정확성 및 신뢰성 둘 다를 감소시킬 수 있다.
추가로, 순전히 유전자 특이적 프라이머 설계에 기초하는 취약 X 염색체의 검출을 위한 몇몇 종래 PCR 분석은 제한을 갖는다. 예를 들면, 이러한 분석은 PCR 앰플리콘의 이동도에 기초하는 CGG 반복부 수의 추산치를 제공한다. 정확한 반복부 수 정량화가 가능하도록, 앰플리콘 이동도는 일반적으로 크기 표준물질의 적절한 세트와 같은 외부 캘리브레이터에 대해 측정한다. 외부 캘리브레이터에 의존하지 않고 정확한 CGG 정량화가 가능한 것이 바람직하다.
더욱이, FMR1 대립유전자는, 통상 반복부 분절의 5' 영역 내에, CGG 반복부 중에 배치되는 AGG 서열을 포함할 수 있다. AGG 서열 요소의 지식은 일 관점에서 대립유전자를 규명한다. AGG 서열 요소는 임상 결정에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 자식에서 완전 돌연변이 대립유전자로의 모계의 FMR1 대립유전자의 연장의 경우는 겨우 59개의 반복부만을 갖는 대립유전자에 대해 언급되며, 이 대립유전자는 임의의 AGG 요소를 결여하고 있는 것으로 알려져 있다. 문헌[Nolin et al., Am. J. Hum. Genet. 72:454-464 (2003)]을 참조한다. 사실, 설사 처음 20개의 CGG 반복부 뒤에 AGG 요소를 포함하는 것으로 보일지라도 완전 돌연변이는 드물고, 생물물리학 연구는 CGG 반복부 분절 중에 AGG "인터럽터(interruptor)" 서열을 갖는 주형이 더 많은 종래 DNA 구조를 채택하고 더 안정적이고 정확한 복제에 더 적용 가능할 것이라고 제시하고 있다. 예를 들면, 문헌[Weisman-Shomer et al., Nucleic Acids Res. 28:1535-41 (2000); Zhong et al., Am. J. Med. Genet. 64:261-5 (1996); Larsen et al., Am. J. Med. Genet. 93:99-106 (2000); Dombrowski et al., Hum. Mol. Genet. 11:371-78 (2002)]을 참조한다. 따라서, FMR1 유전자 내에 AGG 요소와 같은 인터럽터 요소를 맵핑하는 기법에 대한 수요가 존재한다. 따라서, 인터럽터 요소의 맵핑은 취약 X 염색체 증후군 및 또한 다른 반복부 연관 질환과 관련된 연구 및 진단 적용을 갖는다.
기존의 AGG 요소 맵핑 방법은 서열분석 및 제한 맵핑을 포함한다. DNA 서열분석의 기법은 특히 (실험실내 또는 인실리코이든지 간에) 관심 있는 서열의 농축 또는 분리를 일반적으로 요하고, 취약 X 염색체 진단 시험에서 통상 수행되지 않는다는 점에서 비교적 힘들다. 제한 맵핑 기반 분석은 GAGG 서열을 인식하고 그 서열에 7개의 염기쌍 5'를 절단하는 효소인 MnlI를 사용하여 FMR1 5' UTR의 CGG 반복부 영역을 포함하는 절단된 PCR 생성물의 얻어진 단편의 크기에 기초하여 AGG 위치를 부여한다. 예를 들면, 문헌[Eichler et al., Nat. Genet. 8:88-94 (1994); Zhong et al., Am. J. Hum. Genet. 57:351-361 (1995)]을 참조한다. Eichler 등의 분석은 반복부 영역의 PCR 증폭, 생성물의 정제, 밤샘 절단, 7 시간 동안의 전기영동 및 사우던 블로팅을 포함한다. Zhong 등의 분석에서, "PCR 생성물은 페놀/클로로포름으로 1회 추출하고, 에탄올 침전시키고, 50∼70 분 동안 37℃에서 5 단위 MnlI로 10 리터 중에 부분 절단한다". Id [353에서]. 이것에 전기영동 및 사우던 블로팅이 후행한다. 따라서, 상기 분석 둘 다 PCR 및 전기영동 이외에 정제/클린업, 제한 절단 및 사우던 블로팅을 포함하는 다단계를 포함한다.
본원은 CGG 반복부를 정량화하고, FMR1 및 FMR2 유전자의 5' UTR 내에 인터럽터 서열의 서열 관계를 확인하고 정량화하고 밝혀내는 방법을 제공한다. 본 발명의 잠재적 생성물 적용은 취약 X 염색체 시험에 대한 임상 적용을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은
(a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 제1 프라이머, 및 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머를 포함하는 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 1 이상의 CGG 풍부 영역을 포함하는 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션(representation)을 얻는 단계; 및
(d) 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은
(a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하는 제1 프라이머, CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머 및 제1 프라이머의 5' 플랩에 포함되는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함하는 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
(b) 3개 이상의 상이한 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는, 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하며, 제3 프라이머가 제1 프라이머의 5' 플랩의 동일한 서열을 갖는, 3개의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
(b) 3개의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 44 및 서열 번호 45로부터 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 다 오직 예시적이고 서술적이며 청구된 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 CGG 반복부 영역의 전부 또는 일부를 증폭하는 증폭 반응에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, CGG 반복부 영역을 FMR1의 5' UTR 또는 FMR2의 5' UTR에 포함된다.
본 발명은 CGG 반복부 영역 외부에 어닐링하는 프라이머 및 CGG 반복부 서열, 서열 순열 또는 그 서열의 역상보(GCG, CCG, CGC, GCC 또는 GGC)에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 증폭 반응에 관한 것이다. CGG 반복부 영역 외부(상류 또는 하류)에 어닐랑할 수 있는 프라이머는 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 프라이머는 CGG 반복부 영역을 플랭킹하는 서열에 어닐링할 수 있다. 상기 정방향 프라이머의 예로는 CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C(서열 번호 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T(서열 번호 2), CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G(서열 번호 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC(서열 번호 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG(서열 번호 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG(서열 번호 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA(서열 번호 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G(서열 번호 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A(서열 번호 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G(서열 번호 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA(서열 번호 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG(서열 번호 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC(서열 번호 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A(서열 번호 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA(서열 번호 15), TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C(서열 번호 16) 및 TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACG GCG GCG GCG GCG GA(서열 번호 44)를 들 수 있다. 상기 역방향 프라이머의 예로는 CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A(서열 번호 17), GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(서열 번호 18), GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT(서열 번호 19), CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC AT(서열 번호 20), CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG(서열 번호 21), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT(서열 번호 22), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(서열 번호 23), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG(서열 번호 24), GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT(서열 번호 25), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T(서열 번호 26), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A(서열 번호 27), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A(서열 번호 28), AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C(서열 번호 29), CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C(서열 번호 30), TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A(서열 번호 31), AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C(서열 번호 32), GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T(서열 번호 33), CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G(서열 번호 34), CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA TCT(서열 번호 35), TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC(서열 번호 36), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC(서열 번호 37), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CG(서열 번호 43) 및 AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CT(서열 번호 45)를 들 수 있다.
본 발명은 추가로 프라이머 TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT(서열 번호 38), AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG(서열 번호 39), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A(서열 번호 40) 및 TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA CGGCGGCGGCGGCGG(서열 번호 41)의 용도 및 이의 제공을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 CGG 반복부 또는 이의 순열 및 역상보가 3' 말단에 매달린 서열 번호 1-38 또는 서열 번호 40 중 어느 하나의 서열을 포함하는 프라이머에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열 CGG의 다수의 트리뉴클레오타이드 반복부 또는 이의 순열 및 역상보를 포함하는 프라이머의 용도 및 이의 제공을 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머 내 CGG 반복부 수는 4개 또는 5개이다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머는 트리뉴클레오타이드 반복부 서열의 12∼15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머는 3개 내지 10개 범위의 반복부 수를 포함한다. 프라이머는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 반복부 및 임의로 1개 또는 2개의 C 및/또는 G 잔기의 추가의 부분 반복부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 다형성 위치에서의 결합을 보장하기 위해 또는 내부 표준 물질로서 제공하기 위해 알려진 크기의 영역을 증폭하기 위해, 추가의 프라이머를 제공할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, CGG 반복부 서열에 어닐링하는 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는다. CGG 반복부 서열에 어닐링하는 프라이머의 인터럽터 요소를 포함하는 1 이상의 위치에 대한 우선적 결합은, 상기 기재된 바대로, 예를 들면 PCR 반응에서 상기 프라이머를 CGG 풍부 영역의 외부에 결합하는 반대 방향인 제2 프라이머와 함께 사용함으로써, 인터럽터 요소를 포함하는 1종 이상의 생성물의 선택적 증폭을 발생시킬 수 있다. 우선적 결합 활성은 예를 들면 CGG 및 AGG 요소, 또는 이의 순열 및/또는 역상보를 포함하는 위치에, 예컨대 (1) 1개의 AGG 요소 또는 A를 포함하는 AGG 요소의 일부 및 (2) 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CGG 요소 및 임의로 추가의 부분 CGG 요소를 포함하는 위치에 특이적일 수 있다.
상기 프라이머를 CGG 풍부 영역의 외부에 결합하는 반대 방향인 제2 프라이머와 함께 사용함으로써 증폭 반응으로부터 배경 생성물에 대한 선택적으로 증폭되는 생성물의 풍부도 비의 면으로 표현되는, 우선적 결합 정도는, 적어도 3배, 4배, 5배 또는 6배일 수 있거나, 또는 3배 내지 12배, 3배 내지 10배, 3배 내지 8배, 4배 내지 12배, 4배 내지 10배, 4배 내지 8배, 3배 내지 7배, 4배 내지 7배, 3배 내지 6배 또는 4배 내지 6배 범위일 수 있다. 1종 이상의 선택적으로 증폭되는 생성물은 일반적으로 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 우선적으로 결합할 때의 제1 프라이머의 5' 말단으로부터 CGG 풍부 영역의 외부의 이의 위치에 결합할 때의 제2 프라이머의 5' 말단까지의 주형에 따른 거리에 해당하는 길이를 갖는다.
몇몇 실시양태에서, CGG 반복부 서열에 어닐랑하고 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치 또는 위치들에 우선적으로 결합하는 프라이머는 CGG 반복부 서열에 어닐링하는 프라이머의 일부 내 또는 이의 말단에 또는 즉, CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 내 또는 이의 말단에 A, T 또는 U 잔기를 포함할 수 있고; 예를 들면, 상기 서열 번호 44 및 서열 번호 45를 참조한다. A, T 또는 U 잔기가 프라이머의 3' 말단에 존재할 수 있다. A, T 또는 U 잔기가 CGG, CCG, GCG, CGC 또는 GCC, GGC 반복부의 말단에 존재할 때, 부분 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부가 A, T 또는 U 잔기 사이에 그리고 마지막 완전 CGG, CCG, GCG, CGC, GGC 또는 GGC 반복부가 존재하거나, 존재하지 않을 수 있다. A, T 또는 U 잔기에 대해, 하기 더욱 자세히 기재된 바대로, 다른 천연 뉴클레오타이드 잔기에 비해 T/U 또는 A 잔기와 우선적으로 염기쌍을 형성하는 비천연 뉴클레오타이드 잔기를 치환할 수 있다. 마찬가지로, 또한 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 구성하는 1개 이상의 G 및/또는 C 잔기에 대해 다른 천연 뉴클레오타이드 잔기에 비해 C 또는 G 잔기와 우선적으로 염기쌍을 형성하는 1개 이상의 비천연 뉴클레오타이드 잔기를 치환할 수 있다. 달리 (임의로 A, T, U 또는 상기 기재된 상응하는 비천연 잔기와 함께) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부로 이루어지는 서열 내에 1개 이상의 이러한 비천연 잔기의 존재는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 서열로서 본 공개내용 내에서 상기 서열의 정체성을 부인하지 않는다.
비고정 분석(non-anchored assay)에서, CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 제1 프라이머를 제공한다. 비고정 분석의 결과에서 합성이 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 결합된 제1 프라이머의 연장을 포함하는 비교적 낮은 수준의 생성물에 의해 인터럽터 요소의 존재가 신호화될 수 있다. 이러한 낮은 수준은 전기영동도에서 높은 피크에 둘러싸인 더 낮은 피크의 갭 또는 세트로 나타날 수 있다.
고정 분석(anchored assay)에서, CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 제1 프라이머를 제공한다. 1개 이상의 주형이 0개, 1개 또는 복수의 인터럽터 요소를 포함하는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 포함하는 반응에서 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 프라이머를 제공할 수 있고, "CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성"을 갖는 프라이머란 언급은 예를 들면 CGG 풍부 영역이 반드시 복수의 인터럽터 요소를 포함한다는 것을 의미하지는 않는다는 것에 유의해야 한다. 고정 분석에서 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 결합된 제1 프라이머의 연장을 포함하는 비교적 높은 수준의 생성물에 의해 인터럽터 요소의 존재가 신호화될 수 있다. 이러한 높은 수준은 전기영동도에서 낮은 피크 및/또는 기준선 신호에 의해 둘러싸인 더 높은 급등으로 나타날 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 고정 분석에서 사용되는 제1 프라이머는 CGG 반복부 내 또는 이의 3' 말단에 A, T 또는 U 잔기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 고정 분석에서 사용되는 제1 프라이머는 다른 천연 뉴클레오타이드 잔기에 비해 A 또는 T/U 잔기와 우선적으로 염기쌍을 형성하는 비천연 뉴클레오타이드 잔기를 포함한다. 비천연 뉴클레오타이드 잔기는 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신 및 우라실(각각 A, T, G, C 및 U)이 아닌 핵염기를 포함하는 뉴클레오타이드 잔기이다. A 또는 T/U 잔기와 우선적으로 염기쌍을 형성하는 비천연 뉴클레오타이드 잔기의 예로는 다른 천연 잔기(예를 들면, 5 치환 우라실 유사체)에 비해 A 또는 T/U 잔기와 우선적으로 염기쌍을 형성하는 T, U 또는 A 잔기의 부가물; 및 슈도우라실(pseudouracil) 및 디아미노퓨린 등과 같은 핵염기를 포함하는 잔기를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
2개의 프라이머는 이중 가닥 핵산 주형의 반대 가닥에 결합할 때 반대 방향인 것으로 생각된다.
본원에 사용되는 서열은 CGG 반복부를 포함하는 가닥을 따라 CGG 풍부 영역의 5'에 존재할 때 CGG 풍부 영역의 "상류"에 있다. 본원에 사용되는 서열은 CGG 반복부를 포함하는 가닥을 따라 CGG 풍부 영역의 3'에 존재할 때 CGG 풍부 영역의 "하류"에 있다.
본 발명의 방법은 2개 이상 또는 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 것을 포함하는 증폭 반응에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하고 프라이머 중 1개는 다른 프라이머의 부분서열이다. 몇몇 실시양태에서, 1개의 프라이머는 CGG 반복부 및 5' 플랩 서열을 포함하는 키메라 프라이머이고, 다른 프라이머는 키메라 프라이머의 5' 플랩 서열의 서열을 갖는다. 키메라 프라이머의 5' 플랩 서열의 서열을 갖는 프라이머가, 반드시 그러한 것은 아니지만, 키메라 프라이머의 전체 비반복부 서열을 가질 수 있다는 것에 유의해야 한다. 즉, 1개의 프라이머의 일부 또는 전부의 서열은 다른 프라이머의 서열에 포함될 수 있고; 예를 들면, 키메라 프라이머가 5' 플랩 서열을 포함하고, 다른 프라이머가 5' 플랩의 일부 또는 전부의 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머는 CGG 반복부 서열의 12∼15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 5' 플랩 서열은 CGG 반복부 영역에 인접한 또는 근접한 서열에 해당할 수 있거나, 이것은 CGG 반복부 영역 내 또는 그 주위의 서열과 연관되지 않을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 키메라 프라이머의 길이는 대략 35번째, 40번째, 45번째, 50번째 또는 55번째일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프라이머 중 1개 이상은 Tm이 60℃ 내지 75℃ 범위, 예를 들면 대략 60℃, 65℃, 70℃ 또는 75℃이다.
몇몇 실시양태에서, 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하고 1개 프라이머를 다른 프라이머의 농도보다 낮은 농도로 제공한다. 예를 들면, 키메라 프라이머를 임의로 키메라 프라이머의 5' 플랩 서열의 서열을 갖는 프라이머보다 낮은 농도로 제공한다. 배수 차이로 표현되는 농도 비는 2배 내지 10,000배 또는 그 이상의 범위, 예를 들면 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배, 2,000배, 5,000배 또는 10,000배일 수 있다. 상기 실시양태에서, 더 낮은 농도로 존재하는 프라이머가 증폭 반응의 초기 라운드에서 고갈될 수 있어서, 일반적으로 전부 또는 거의 전부가 (초기에 비교적 더 높은 농도로 존재하는) 여전히 존재하는 프라이머로부터 연장된다.
본 발명은 핵산을 증폭하는 반응에 관한 것이다. 증폭 반응의 예로는 PCR, NASBA(핵산 서열 기반 증폭) 및 SDA(가닥 대체 증폭)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 미국 특허 제4,683,202호(PCR); 미국 특허 제6,326,173호; 및 문헌[J. of Virol. Methods 151:283-293 (2008)(NASBA); 및 미국 특허 제5,648,211호(SDA)을 참조한다. 상기 모두 본원에 참조문헌으로 포함된다. 당업자는 어떠한 시약이 제공에 적절한지를 이해할 것이다. 상기 방법은 각각 DNA 합성을 포함하고, 그러므로 DNA 중합반응에 알맞고 주형이 존재하는 용액 중에 DNA 폴리머라제, 뉴클레오타이드 및 (염으로서 제공되는) 2가 양이온, 특히 마그네슘의 이용을 포함한다. 상기 방법은 추가의 촉매 활성의 제공, 열 순환 또는 등온 배양의 이용, 및 프라이머의 이용 및 구조의 면에서 달라진다. 또한, 적합한 pH, 예컨대 7 내지 8, 6.5 내지 8.5, 6 내지 9 또는 약 7.4 또는 7.5의 완충제를 통상적으로 제공한다.
본 발명에 따른 PCR에서, 반대 가닥 상의 표적 영역 내 또는 이의 각 말단에 결합하는 적어도 한 쌍의 프라이머가 제공되어, 이들은 각각 다른 프라이머에 대한 합성을 점화한다. 높은 온도 단계에서의 기질의 변성, 더 낮은 온도 단계에서의 프라이머의 어닐링 및 어닐링 단계의 온도보다 높을 수 있지만 반드시 높지 않은 온도에서의 연장을 구동하도록 반응은 열 순환된다. 1회 사이클의 생성물이 차회 사이클에서 주형으로서 작용할 수 있으므로 증폭이 발생한다.
NASBA에서, DNA 폴리머라제 이외에 역전사효소(RT; reverse transcriptase)(예를 들면, RNA 또는 DNA 주형 중 어느 하나를 사용하여 DNA 합성을 촉매할 수 있는 효소)일 수도 있는 RNA 폴리머라제(RNAP)를 제공한다. RNAP에 의해 인식되는 프로모터 서열을 추가로 포함한다는 것을 제외하고는 PCR에서 사용되는 프라이머와 유사한 프라이머가 제공된다. 따라서, RT의 생성물은 RNAP에 대한 주형으로서 작용하여, RT에 대한 주형으로서 작용하는 RNA를 합성함으로써 증폭을 발생시킨다. NASBA의 몇몇 형태에서, RT에 의한 RNA-DNA 하이브리드 합성 후 단일 가닥 DNA를 제조하도록 RNase H가 제공된다. 증폭은 반복 열 변성의 부재 하에 RT 및 RNAP의 작용 조합을 통해 발생한다.
SDA는 DNA가 등온의 비동기식 방식으로 증폭되는 기술이고, 이것은 가닥을 분리하기 위해 사이클 열 변성이 이용되지 않고; 대신, 가닥 대체가 DNA 합성 그 자체를 통해 발생하고, 여기서 3' OH의 연장이 하류 가닥의 대체를 발생시킨다는 것을 의미한다. 초기에 외부 프라이머에 의해 그리고 이후 절목 반응(nicking reaction)에 의해 3' OH가 공급된다. 2개의 쌍의 프라이머가 제공된다. 하나의 '내부' 쌍은 주변 앰플리콘에 결합하고 제한 위치를 포함하는 5' 플랩을 추가로 포함한다. 다른 '외부' 쌍은 원위에, 즉 표적 영역으로부터 멀리 위치한다. 내부 프라이머는 주형에 결합할 수 있고, 연장될 수 있고, 이후 상응하는 외부 프라이머로부터 합성에 의해 대체될 수 있다. 이후, 대체된 DNA는 예를 들면 제2 가닥 합성에 의해 이중 가닥으로 제조된다. 다음 단계는 이중 가닥 분자의 1개의 가닥을 절목하는 것이고, 이것은 절단 위치가 변형 뉴클레오타이드에 의해 1개의 가닥(나머지 가닥은 아님) 상에 불활성화되는 제한 위치 및 변형 뉴클레오타이드를 사용하여 수행할 수 있다. 이 위치에 해당하는 제한 효소가 이 반응에 제공되어 절목을 발생시킨다. 이후, 얻어진 절목에서의 3' OH는 DNA 폴리머라제에 의해 연장되어, 1개의 가닥(다시 주형[몇몇 대체 가닥이 초기에 전체 길이가 아니지만 절목의 결과로서 내부 프라이머 플랩의 원위 부분의 보수가 결여될 수 있다. 이것은 프라이머 결합을 손상시키지 않고(프라이머의 비플랩 부분이 안정하게 어닐링하는 충분한 길이를 갖는다는 것을 상기한다), 프라이머 결합시, 폴리머라제가 채워질 수 있는 5' 오버행이 발생한다]으로서 작용할 수 있음)을 대체하고, 재생된 이중 가닥 분자는 다시 절목과 이후의 연장 및 대체에 대한 기질이어서, 증폭을 발생시킨다. 반복 열 변성이 필요한 것은 아니다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 dNTP를 1보다 큰 GC/AT 비로, 그리고 GC 풍부 주형을 사용하여 DNA의 합성에 알맞은 전체 dNTP 농도로 제공하는 것을 포함한다. 미국 출원 12/371,306을 참조한다. GC/AT 비는 약 1.1, 1.2, 1.4, 1.6, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 또는 그 이상일 수 있다. GC/AT 비는 1.1 내지 20, 1.1 내지 15, 1.1 내지 10, 1.1 내지 8, 1.1 내지 15, 1.1 내지 7, 1.1 내지 6, 1.1 내지 5, 1.2 내지 25, 1.4 내지 25, 1.6 내지 25, 2 내지 25, 3 내지 25, 4 내지 25, 5 내지 25, 2 내지 15, 2.5 내지 10 또는 4 내지 10일 수 있다. 전체 dNTP 농도는 약 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2, 1.5, 2 또는 3 mM일 수 있다. dNTP 농도는 0.4 내지 3 mM, 0.5 내지 3 mM, 0.6 내지 3 mM, 0.7 내지 3 mM, 0.8 내지 3 mM, 0.9 내지 3 mM, 1 내지 3 mM, 0.4 내지 2 mM, 0.4 내지 1.5 mM, 0.4 내지 1.2 mM, 0.4 내지 1 mM, 0.4 내지 0.9 mM, 0.4 내지 0.8 mM, 0.4 내지 0.7 mM, 0.5 내지 2 mM, 0.5 내지 1 mM 또는 0.6 내지 0.9 mM일 수 있다. "GC/AT 비"는 소정의 용액 또는 혼합물 중에 dCTP, dGTP 및 이의 모든 뉴클레오타이드 유사체의 합의 농도에 대한 dATP, dTTP, dUTP 및 이의 모든 뉴클레오타이드 유사체의 합의 농도의 비를 의미한다. "dNTP"는 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 나타내고 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP 및 이의 유사체를 의미한다. "뉴클레오타이드 유사체"는 천연 염기 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 또는 우라실(U) 이외의 염기 잔기, 데옥시리보스와 동일한 또는 유사한 당 잔기, 및 적어도 1개의 포스페이트 또는 다수의 포스페이트(예를 들면, 디포스페이트 또는 트리포스페이트) 잔기를 포함하는 분자 또는 이온이다. 뉴클레오타이드 유사체는 이것이 트리포스페이트 및 당 잔기(이들 둘 다의 구조 및 배치는 폴리머라제에 의한 핵산 이중 나선으로의 도입에 적합함) 및 염기(핵산 이중 나선에서의 염기쌍 형성 특성 및 핵산 이중 나선에서의 DNA 폴리머라제에 의한 도입의 유전자좌는 5개의 상기 기재된 뉴클레오타이드 중 1개와 가장 유사함)를 포함할 때, dTTP의 유사체가 일반적으로 또한 dUTP의 유사체이고 그 반대인 경우를 제외하고는, 특정한 뉴클레오타이드, 특히 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 또는 dUTP의 유사체이다. "유사체"란 용어가 "뉴클레오사이드", "염기", "핵염기" 또는 "잔기"(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 용어와 함께 사용될 때 "뉴클레오타이드"와 함께 사용되는 것처럼 동일한 방식으로 해석되어야 한다.
몇몇 실시양태에서, 인핸서(enhancer)를 제공할 수 있다. 인핸서는 GC 풍부 생성물을 발생시키는 반응의 성공에 기여한다. 각종의 인핸서는 수율, 특이성 및 일관성을 증가시키기 위해 PCR 반응에 포함될 수 있고 주형 DNA의 Tm을 낮추어 작용할 수 있다. 인핸서는 나선 불안정화, 반응 억제제의 중화 또는 다른 메커니즘, 예컨대 비공지 메커니즘을 통해 작용할 수 있다. 인핸서로는 베타인, 베타인 유사체, 글리세롤, 소 혈청 알부민(BSA), 폴리에틸렌 글리콜, 테트라메틸암모늄 클로라이드, 7-데아자-GTP, 천연 세제, 디메틸설폭사이드(DMSO), 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 포름아미드, 아세톤, 아세트아미드, N-메틸포름아미드, N,N-디메틸포름아미드, 아세톤, 아세트이미드, N-메틸아세트이미드, N,N-디메틸아세트이미드, 2-피롤리돈, N-메틸피롤리돈, 프로피온아미드 및 이소부티르아미드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 중성 세제로는 TWEEN-20, β-옥틸-글루코사이드, 옥틸-β-티오-글루코피라노사이드, Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween-80, Pluronic F-68, Pluronic F-127, Deoxy Big CHAP, CHAPS, CHES, 노닐 페녹실폴리에톡실에탄올(Tergitol형 NP-40) 및 옥틸 페녹실폴리에톡실에탄올(Igepal CA-630)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 베타인 유사체로는 호모디아놀 베타인, 디아놀 베타인, 프로피오 베타인, 호모글리세롤 베타인, 디에탄올 호모베타인, 트리에탄올 호모베타인, 하이드록시프로필 호모베타인, N-메틸-N-(2-카르복시에틸)모르폴리늄 내염, N-메틸-N-(2-카르복시에틸)피페리듐 내염, N-메틸-N-(2-카르복시에틸)피롤리디늄 내염, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)-N-(2-설포에틸)암모늄 내염, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)-N-(3-설포프로필)암모늄 내염, N,N-디하이드록시에틸-N-메틸-N-(3-설포프로필)암모늄 내염, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)-N-(4-설포부틸)암모늄 내염, N-메틸-N-(3-설포프로필)모르폴리늄 내염 및 N-메틸-N-(3-설포프로필)피페리듐 내염을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
베타인, 베타인 유사체 및/또는 다른 인핸서는 0.01 내지 5 M, 0.01 내지 4 M, 0.01 내지 3 M, 0.01 내지 2.5 M, 0.02 내지 5 M, 0.03 내지 5 M, 0.04 내지 5 M, 0.05 내지 5 M, 0.07 내지 5 M, 0.1 내지 5 M, 0.2 내지 5 M, 0.3 내지 5 M, 0.4 내지 5 M, 0.5 내지 5 M, 0.7 내지 5 M, 1 내지 5 M, 1.5 내지 5 M, 0.1 내지 4 M, 0.5 내지 3 M, 1 내지 2.5 M 또는 1.5 내지 2.5 M, 예를 들면 약 0.01 M, 0.02 M, 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.5 M, 0.75 M, 1 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 2.0 M, 2.1 M, 2.2 M, 2.3 M, 2.4 M, 2.5 M, 3 M, 3.5 M, 4 M, 4.5 M 또는 5 M의 몰 농도로 제공될 수 있다. 대안적으로, 인핸서는 0.1 내지 50 용적%, 0.2 내지 50 용적%, 0.5 내지 50 용적%, 1 내지 50 용적%, 2 내지 50 용적%, 5 내지 50 용적%, 0.1 내지 40 용적%, 0.1 내지 30 용적%, 0.1 내지 20 용적%, 0.5 내지 40 용적%, 1 내지 30 용적% 또는 2 내지 20 용적%, 예를 들면 약 0.1 용적%, 0.2 용적%, 0.5 용적%, 1 용적%, 2 용적%, 5 용적%, 10 용적%, 15 용적%, 20 용적%, 25 용적%, 30 용적%, 35 용적%, 40 용적%, 45 용적% 또는 50 용적%의 w/v 또는 v/v 백분율 농도로 제공될 수 있다. 중성 세제는 0.0001 내지 10 용적%, 0.0002 내지 10 용적%, 0.0005 내지 10 용적%, 0.001 내지 10 용적%, 0.002 내지 10 용적%, 0.005 내지 10 용적%, 0.01 내지 10 용적%, 0.02 내지 10 용적%, 0.05 내지 10 용적%, 0.0001 내지 5 용적%, 0.0001 내지 2 용적%, 0.0001 내지 1 용적%, 0.0005 내지 1 용적% 또는 0.001 내지 1 용적%, 예를 들면 약 0.0001 용적%, 0.0002 용적%, 0.0003 용적%, 0.0004 용적%, 0.0005 용적%, 0.0006 용적%, 0.0007 용적%, 0.0008 용적%, 0.0009 용적%, 0.001 용적%, 0.002 용적%, 0.003 용적%, 0.004 용적%, 0.005 용적%, 0.006 용적%, 0.007 용적%, 0.008 용적%, 0.009 용적%, 0.01 용적%, 0.02 용적%, 0.03 용적%, 0.04 용적%, 0.05 용적%, 0.06 용적%, 0.07 용적%, 0.08 용적%, 0.09 용적%, 0.1 용적%, 0.2 용적%, 0.3 용적%, 0.4 용적%, 0.5 용적%, 0.6 용적%, 0.7 용적%, 0.8 용적%, 0.9 용적%, 1 용적%, 2 용적%, 3 용적%, 4 용적%, 5 용적%, 6 용적%, 7 용적%, 8 용적%, 9 용적% 또는 10 용적%로 제공될 수 있다. 당업자는 다양한 인핸서에 대해 적절한 농도를 인지할 것이다.
본 발명은 증폭 반응에 대한 완충제를 제공하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 완충제로는 예를 들면 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스), 비스-트리스 프로판, 비카르보네이트, 포스페이트, 글리신, 히스티딘, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS) 및 다양한 짝염기/짝산 및 이의 염을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명은 주형 의존 방식으로 dNTP로부터 DNA를 합성하기 위해 1개 이상의 DNA 폴리머라제를 제공하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. DNA 폴리머라제로는 야생형, 변형, 호열성, 키메라, 조작 폴리머라제 및/또는 1개 이상의 폴리머라제의 혼합물을 들 수 있다. DNA 폴리머라제로는 Exact Polymerase(5 PRIME GmbH), AccuSure™ DNA Polymerase(Bioline), Phusion™ AccuPrime™ Pfx(Invitrogen), Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen), Phire™ Hot Start DNA Polymerase(New England Biolabs), Phusion® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs), JumpStart™ REDTaq™ DNA Polymerase(Sigma-Aldrich), PfuUltra™ Hotstart DNA Polymerase(Stratagene), PfuTurbo® Cx Hotstart DNA Polymerase(Stratagene), PrimeSTAR™ HS DNA Polymerase(Takara), Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme(ABgene), ACCUZYME™ DNA Polymerase(Bioline), SAHARA™ DNA Polymerase(Bioline), VELOCITY DNA Polymerase(Bioline), GeneChoice® AccuPOL™ DNA Polymerase(GeneChoice, Inc.), GeneChoice® UniPOL™ DNA Polymerase(GeneChoice, Inc.), Elongase Enzyme Mix(Invitrogen), Pfx50™ DNA Polymerase(Invitrogen), Phusion DNA Polymerase(New England Biolabs), KOD HiFi DNA Polymerase(Novagen), KOD XL DNA Polymerase(Novagen), Expand 20 kb PLUS Thermostable DNA 폴리머라제 혼합물(Roche Applied Science), Expand High Fidelity PLUS Thermostable DNA 폴리머라제 혼합물(Roche Applied Science), Expand High Fidelity Thermostable DNA 폴리머라제 혼합물(Roche Applied Science), Expand Long Template Thermostable DNA 폴리머라제 혼합물(Roche Applied Science), Easy-A™ High-Fidelity PCR Cloning Enzyme(Stratagene), EXL™ DNA Polymerase(Stratagene), Herculase® Enhanced DNA Polymerase(Stratagene), Herculase® II Fusion DNA Polymerase(Stratagene), Kapa LongRange™ DNA Polymerase(Kapa Biosystems), Kapa HiFi™ DNA Polymerase(Kapa Biosystems), Kapa2G™ Robust DNA Polymerase(Kapa Biosystems), Kapa2G™ Robust HotStart DNA Polymerase(Kapa Biosystems), Kapa2G™ Fast DNA Polymerase(Kapa Biosystems), Kapa2G™ Fast HotStart DNA Polymerase(Kapa Biosystems), LA TAQ DNA Polymerase(Takara), Optimase DNA Polymerase(Transgenomic, Inc.), Exo-Pfu DNA Polymerase(Stratagene), HotMaster Taq DNA Polymerase(5 PRIME GmbH), HotTaq DNA Polymerase(Abnova Corporation), AmpliTaq Gold® DNA Polymerase(Applied Biosystems), Bst DNA Polymerase Lg Frag(New England Biolabs), MasterAmp™ Tfl DNA Polymerase(EPICENTRE Biotechnologies), Red Hot DNA Polymerase(ABgene), Thermoprime Plus DNA Polymerase(ABgene), Taq-red DNA Polymerase(AppliChem GmbH), BIO-X-ACT™ Long DNA Polymerase(Bioline), BIO-X-ACT™ Short DNA Polymerase(Bioline), Bioline HybriPol™ DNA Polymerase(Bioline), BioTherm Taq DNA Polymerase(eEnzyme LLC), EU-Taq DNA Polymerase(eEnzyme LLC), Synergy Taq DNA Polymerase(eEnzyme LLC), GeneChoice® RedPOL™ DNA Polymerase(GeneChoice, Inc.), AccuPrime™ GC-Rich DNA Polymerase(Invitrogen), PyroPhage® 3173 DNA Polymerase, Exo Minus(Lucigen), 9 Degrees North (Modified) DNA Polymerase(New England Biolabs), Therminator DNA Polymerase(New England Biolabs), Pwo DNA Polymerase(Roche Applied Science), Paq5000™ DNA Polymerase(Stratagene), YieldAce™ DNA Polymerase(Stratagene), e2TAK™ DNA Polymerase(Takara), 또는 P. 코다카라엔시스(P. kodakaraensis), P. 푸리오수스(P. furiosus), T. 고르고나리우스(T. gorgonarius), T. 질리기(T. zilligii), T. 리토랄리스(T. litoralis) "Vent™", P. GB-D "Deep Vent", T. 9N-7, T. 아그레간스(T. aggregans), T. 바로시(T. barossii), T. 푸미콜란스(T. fumicolans), T. 셀레르(T. celer), 피로코커스 종(Pyrococcus sp .) 균주 ST700, T. 파시피쿠스(T. pacificus), P. 아비시(P. abysii), T. 프로푼두스(T. profundus), T. 시쿨리(T. siculi), T. 하이드로써말리스(T. hydrothermalis), 써모코커스 종(Thermococcus sp .) 균주 GE8, T. 티오레두센스(T. thioreducens), P. 호리코시(P. horikoshii) 또는 T. 온누리네우스(T. onnurineus) NA1, 써모코커스 종 9°-7, 써모코커스 종 GI-J, 써모코커스 종 MAR-13, 써모코커스 종 GB-C, 써모코커스 종 GI-H, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 칼도필루스(Thermus caldophilus), 써무스 필리포르미스(Thermus filiformis), 써무스 플라부스(Thermus flavus), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) 또는 바실루스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)로부터 얻은 천연 DNA 폴리머라제를 들 수 있다.
본 발명을 통해 얻은 데이터, 예를 들면 시험 결과를 병증 또는 질환의 존재 또는 부재를 진단하는 과정에 이용할 수 있다. 본 발명의 이용을 통해 얻은 데이터를 개체의 유전자형의 결정에 이용할 수 있다. 본 발명을 통해 얻은 데이터를 취약 X 염색체 증후군, 취약 X 염색체 관련 진전/운동실조 증후군 및 취약 X 염색체 관련 원발성 난소 부족과 관련된 유전자형을 검출하는 데 이용할 수 있다. 이러한 병증과 관련된 유전자좌는 당해 분야에 공지되어 있고 FMR1, FMR2, FMR1의 5' UTR, FMR2의 5' UTR, FMR1의 5' UTR 내 CGG 반복부 및 FMR2의 5' UTR 내 CGG 반복부를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가의 실시양태에서, 본 발명을 통해 얻은 데이터를 GC 풍부 트리뉴클레오타이드 반복부 장애 및/또는 인터럽터 요소와 관련된 유전자형, 예컨대 X 염색체 증후군, 취약 X 염색체 관련 진전/운동실조 증후군 및 취약 X 염색체 관련 원발성 난소 부족, 근긴장성 이영양증, 헌팅턴병, 척추 인경 근위축증, 치아적핵창백핵루이체 위축증 및/또는 척수소뇌성 운동실조를 검출하는 데 이용할 수 있다. 인터럽터 요소는, 명칭이 제시하는 바대로, 일련의 반복부를 차단한다. CGG 풍부 영역은 인터럽터 요소(들)을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 따라서, CGG 풍부 영역은 트리뉴클레오타이드 반복부 세트 및 세트 사이의 1개 이상의 인터럽터 요소를 포함할 수 있다. 이러한 병증과 관련된 유전자좌는 당해 분야에 공지되어 있고, FMR1, FMR2, DMPK, ZNF9, HTT, AR, ATN1, ATXN1-3, ATXN7, ATXN10, CACNA1A, SCA8, PPP2R2B 및 TBP를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 문헌[Nat. Genet. 13(1):105-8 (1996); Nat. Genet. 13(1):109-13 (1996)]을 참조한다.
상기 방법은 샘플에 포함되는 1개 이상의 대립유전자에 포함되는 CGG 풍부 영역의 어느 한쪽 말단 근처에, 예를 들면, 어느 한쪽 말단의 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 또는 300 bp 내에 인터럽터 요소의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다. 샘플에 포함되는 1개 이상의 대립유전자에 포함되는 CGG 풍부 영역의 어느 한쪽 말단의 소정 거리 내에 인터럽터 요소의 존재 또는 부재의 결정은 전체 CGG 풍부 영역이 어느 한쪽 말단의 소정 거리 내에 있게 하는 크기를 갖는 CGG 풍부 영역에 걸쳐 인터럽터 존재 또는 부재의 결정을 포함하는 것으로 이해된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 하여, 사우던 블로팅, 제한 절단 또는 서열분석, 예를 들면 Sanger 서열분석, Maxam-Gilbert 서열분석, 결찰 서열분석 및 합성에 의한 단일 분자 서열 분석(2세대 서열분석으로도 알려짐)(리버시블 터미네이터 시퀀싱(reversible terminator sequencing) 및 피로시퀀싱(pyrosequencing) 포함)과 같은 절차를 포함하는 보조 또는 반사 분석의 독립적으로 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 것을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 1 이상의 CGG 풍부 영역에 대한 정보, 예컨대 길이 및/또는 본원에 기재된 인터럽터 요소 함량 또는 위치의 결정을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 증폭 반응으로부터 고분해능 기술에 의해 생성되는 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션으로부터 1 이상의 CGG 풍부 영역에 대한 정보, 예컨대 길이 및/또는 본원에 기재된 인터럽터 요소 함량 또는 위치의 결정에 필요하고 충분한 정보를 얻는 것을 포함한다.
1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보는 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역이 인터럽터 서열을 포함하는지; 1개 이상의 상이한 주형이 존재하는 경우, 샘플 내의 각 주형이 인터럽터 서열을 포함하는지; 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 존재하는 인터럽터 서열의 수의 최저 추계 값; 및/또는 1개 이상의 인터럽터 요소의 1 이상의 위치(하기 기재된 바대로, 소정 수준의 정확성 내 결정 포함)와 같은 정보를 포함할 수 있다. 상기한 특정 유형의 정보 목록은 당해 분야의 당업자의 지식의 견지에서 명확히 또는 함축적으로 본원에 개시된 본 발명의 발명을 통해 결정될 수 있는 다른 유형의 정보를 포함하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 2 이상의 분석을 수행하는 것을 포함하고, 각 분석은 (a) 2 이상의 분석의 프라이머가 동일하지 않은 프라이머를 제공하는 단계; (b) 증폭 반응을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계; (c) 생성물 세트를 분해하는 단계(생성물 크기 및 풍부도의 2 이상의 리프리젠테이션을 2 이상의 분석으로부터 얻음); 및 (d) 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 얻은 정보는, 예컨대 샘플이 CGG 풍부 영역을 포함하는 2개 이상의 상이한 주형을 포함하고 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 1개 이상의 인터럽터 요소가 존재하는 경우(이의 2 이상의 CGG 풍부 영역이 1개 이상의 인터럽터 요소를 포함함), 오직 1의 분석을 수행한다면 얻을 수 없는 정보를 포함한다. 예를 들면, 이러한 정보가 1의 분석의 결과로부터 불명확할 수 있는 상황이 도 10에 예시되어 있다. 다른 가능한 불명확성 및 이것을 어떻게 해결하는지의 예를 하기 기재하였다.
몇몇 실시양태에서, 2 이상의 분석은 고정 분석 및 비고정 분석을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 2 이상의 분석은 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 반대 방향인 프라이머를 사용한다. 즉, 제1 분석은 상류로 향하는 반복부를 포함하는 프라이머를 포함하는 프라이머들을 제공하는 것을 포함할 수 있고, 제2 분석은 하류로 향하는 또는 그 반대인 반복부를 포함하는 프라이머를 포함하는 프라이머들을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 2 이상의 비고정 분석 및 1 이상의 고정 분석 또는 그 반대를 포함하는 3 이상의 분석을 포함한다. 2 이상의 비고정(또는 고정) 분석은 이전 문단에 기재된 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 반대 방향인 프라이머를 사용할 수 있다.
몇몇 상황에서, "생성물 세트"가 예컨대 기껏해야 1개의 인터럽터를 포함하는 기껏해야 1의 CGG 풍부 영역을 포함하는 샘플에 의한 고정 분석에서 복수의 주요한 또는 검출 가능한 생성물을 포함하지 않을 수 있다는 것에 유의해야 한다. 분석 중 하나에서 사용되는 프라이머 중 1개 이상이 다른 분석에서 사용되는 프라이머와 상이한 경우, 프라이머가 분석 간에 "비동일"한 것으로 생각된다; 즉, 프라이머 중 몇몇은 동일할 수 있다.
상기 방법은 증폭 반응이 비동일한 프라이머 세트를 사용하는, 상기 기재된 바와 같은, 2 이상의 분석을 수행함으로써 이형접합성, 이수체 또는 모자이크 유전자형의 1 이상의 상세사항을 결정하는 것을 포함할 수 있고, 2 이상의 증폭 반응의 결과를 비교함으로써 1 이상의 상세사항을 결정한다.
샘플의 유전자형은 샘플이 얻어지는 공급원의 유전자형을 의미하고; 이 용어는 혼합 샘플의 경우에 다수의 각자의 유전자형을 포함할 수 있다.
이형접합성 유전자형을 갖는 샘플은 CGG 풍부 영역을 포함하는 유전자좌의 2개의 대립유전자를 포함하는 세포로부터 얻은 유전자 물질을 포함한다.
모자이크 유전자형을 갖는 샘플은 CGG 풍부 영역을 포함하는 유전자좌의 2개 이상의 대립유전자를 포함하고, 샘플이 얻어진 세포가 CGG 풍부 영역을 포함하는 유전자좌의 1개 이상의 대립유전자에서 유전적으로 상이하다. 모자이크 유전자형을 갖는 샘플에 포함되는 2개 이상의 대립유전자를 이의 풍부도에 따라 주대립유전자(major allele) 또는 부대립유전자(minor allele)로 분류할 수 있다. 풍부도가 가장 큰 대립유전자를 주대립유전자로 간주하고 풍부도가 가장 작은 대립유전자를 부대립유전자로 간주하며; 2개 이상의 대립유전자가 존재할 때, 백분율로서 표현되는 이의 상대 풍부도가 산술적으로 가장 높은 또는 가장 낮은 풍부도를 갖는 대립유전자에 더 가까운지에 기초하여 대립유전자를 주대립유전자 또는 부대립유전자로 분류한다. 예를 들면, 각각 60%, 31% 및 9%의 상대 풍부도를 갖는 제1, 제2 및 제3 대립유전자를 갖는 샘플에서, 제2 대립유전자는 부대립유전자로 간주한다. 예를 들면, 게놈이 CGG 풍부 영역의 3개 카피를 포함하는 경우(이 중 2개가 동일하고(주대립유전자), 1개가 상이하다(부대립유전자)), 이수체로부터 주대립유전자 및 부대립유전자의 존재가 또한 생길 수 있다. 이수체는 하기 자세히 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 샘플이 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% 또는 25%의 상대 풍부도를 갖는 부대립유전자를 포함하는지를 검출하는 것을 포함한다. 부대립유전자의 CGG 풍부 영역은 주대립유전자의 CGG 풍부 영역과 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 부대립유전자는 상이한 반복부 수 및/또는 상이한 AGG 요소 분포를 갖는 CGG 풍부 영역을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 샘플이 인터럽터 요소를 포함하는 부대립유전자를 포함하는지를 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 하기 기재된 바대로 일정 수준의 정확성 내에 있을 수 있는, 부대립유전자 내 인터럽터 요소의 위치를 검출하는 것을 포함한다.
이수체 유전자형을 갖는 샘플은 정배수체 수가 아닌 CGG 풍부 영역을 포함하는 유전자좌의 다수의 대립유전자를 포함한다. 정배수체 수는, 환원성 감수 분열을 겪은 수컷 생식세포 및 수컷 생식선 세포에서의 성 염색체 유전자좌(여기서, 이것은 개별 세포의 경우 0 또는 1일 수 있고, 이의 집단의 경우 평균 약 0.5임(존재하는 X 및 Y 염색체 보유 세포의 수에 따라 변동))를 제외하고, 환원성 감수 분열을 겪은 생식세포 및 생식선 세포에서 체세포 염색체 유전자좌에 대한 것이다. 정배수체 수는 또한 수컷 체세포 및 환원성 감수 분열을 아직 겪지 않은 수컷 생식선 세포에서 X 염색체 유전자좌에 대한 것이다. 정배수체 수는 체세포 및 환원성 감수 분열을 아직 겪지 않은 생식선 세포에서 체세포 염색체 상의 유전자좌, 및 암컷 체세포 및 환원성 감수 분열을 아직 겪지 않은 암컷 생식선 세포에서 X 염색체 유전자좌에 대해 2이다. 샘플이 이형접합성, 이수성 및 모자이크 상태 중 1 이상을 가질 수 있다.
예를 들면, 상이한 전구 세포(접합체, 할구, 줄기 세포 등)로부터 유도된 세포를 포함하는 개체, 또는 체세포 돌연변이, 예를 들면 반복부 수 변경, 예컨대 반복부 확장으로 인해 유전적으로 상이한 세포를 포함하는 개체로부터 얻은 샘플에서 모자이크 유전자형이 발생할 수 있다. 이수성은 예를 들면 다운 증후군, 터너 증후군 및 클라인펠터 증후군과 같은 특정 증후군에서 존재하고, 또한 체세포에서 염색체 비분리 사건을 통해 발생할 수 있고; 이 사건은 이형접합성일 수 있거나 또한 이형접합성이 아닐 수 있는 모자이크 이수체 샘플을 제공할 수 있는 개체를 발생시킬 수 있다.
(유전자좌에 대한 이형접합성, 이수체 또는 모자이크 중 1 이상인 것으로 인해) CGG 풍부 영역을 포함하는 유전자좌의 2개 이상의 상이한 대립유전자를 포함하는 샘플을 그 유전자형과 관련한 1 이상의 상세사항을 결정하기 위해 분석할 수 있다.
1 이상의 상세사항은 2개 이상의 상이한 대립유전자 중 1개, 2개, 0개 또는(가능한 경우) 2개 이상이 1개 이상의 인터럽터 요소를 포함하는지를 포함할 수 있다.
1 이상의 상세사항은 2개 이상의 상이한 대립유전자 중 1개 이상에 포함되는 인터럽터 요소의 최소 수를 포함할 수 있다. 예를 들면, 1개의 대립유전자가 1개 이상의 인터럽터 요소를 포함하는 것을 결정할 수 있다. 1 이상의 상세사항은 추가로 다른 대립유전자가 예를 들면 2개 이상의 인터럽터 요소를 포함하는 것을 포함한다.
1 이상의 상세사항은 대립유전자 중 1개 내 1개 이상의 인터럽터 요소의 위치를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 1 이상의 상세사항은 단일 분석의 결과로부터 이형접합성, 이수성 및/또는 모자이크 샘플의 유전자형에 대해 분명하게 결정할 수 없는 1 이상의 상세사항을 포함한다. 다음은 단일 분석의 결과로부터 불명확할 수 있는 상세사항의 비배타적인 목록이다:
1. 단일 분석 결과는 1개 이상의 인터럽터 요소가 존재한다는 것을 나타낼 수 있지만, 상기 결과는 어떠한 대립유전자가 1개 이상의 인터럽터 요소를 포함하는지에 대해서는 불명확할 수 있다.
2. 단일 분석 결과는 2개 이상의 인터럽터 요소가 존재한다는 것을 나타낼 수 있지만, 상기 결과는 인터럽터 요소가 동일한 대립유전자 또는 상이한 대립유전자에 포함되는지에 대해서는 불명확할 수 있다.
3. 단일 분석 결과는 3개 이상의 인터럽터 요소가 존재한다는 것을 나타낼 수 있지만, 상기 결과는 3개 이상의 인터럽터 요소가 2개 이상의 상이한 대립유전자 사이에 어떻게 분포하는지에 대해서는 불명확할 수 있다.
4. 단일 분석 결과는 인터럽터 요소가 제2 대립유전자에 해당하는 큰 피크와 같은 신호에 의한 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션에서 모호한 제1 대립유전자 내의 위치에 존재하는지에 대해 불명확할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비특이적으로 증폭되는 물질의 실제 비율을 포함하지 않거나, 이것이 없는 생성물을 합성시킨다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 주형이 하기 실시예 1-3에 기재된 샘플 중 하나일 때, 비특이적으로 증폭되는 물질의 실제 비율을 포함하지 않거나, 이것이 없는 생성물을 합성시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 예상 크기보다 큰 비특이적으로 증폭되는 물질의 실제 비율을 포함하지 않거나, 이것이 없는 생성물을 합성시키고, 상기 예상 크기는 제2 프라이머가 어닐링하는 위치에 기초한 조정에 CGG 풍부 영역의 길이를 첨가하여 계산한다. 몇몇 실시양태에서, 생성물은 선행 문장에 기재된 예상 크기보다 큰 물질을, 밀도측정 또는 생성물 크기 및 양의 리프리젠테이션으로부터 얻은 신호 통합에 의해 결정될 때, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 이하 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 리프리젠테이션은 전기영동도이다. 본원에 정의된 바대로, 생성물은 예상 크기보다 큰 물질을, 상기에 의해 결정될 때, 약 10% 이하 포함할 때 비특이적으로 증폭되는 물질을 "실질적으로 포함하지 않는다".
본 발명은 예를 들면 CGG 또는 CCG 트리뉴클레오타이드와 같은 GC 풍부 반복부 서열을 포함하는 주형을 분석하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 분석은 증폭 반응을 수행하는 것 및 생성물을 고분해능으로 분해하는 것을 포함할 수 있다. 고분해능은 예를 들면 20개 대 21개 또는 20개 대 22개, 20개 대 23개, 20개 대 24개 또는 20개 대 25개의 트리뉴클레오타이드 반복부를 포함하는 생성물, 또는 몇몇 실시양태에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍만큼 길이가 다른 생성물을 구별하는 데 충분한 분해능일 수 있다. 이러한 분해 단계를 달성하기 위해 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 기술의 예로는 모세관 전기영동 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE; PAGE의 몇몇 실시양태는 통상 당해 분야에서 "시퀀싱 겔의 작업"이라 칭함) 또는 "랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)" 유형 미세유체역학/전기영동 시스템을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 모세관 전기영동을 수행하기 위한 장치는 예를 들면 Applied Biosystems (ABI), Beckman, Agilent 및 Qiagen과 같은 판매상으로부터 얻을 수 있고, 적합한 장치로는 ABI 310, 3100, 3130/3130xl 또는 3730/3730xl; Beckman P/ACE MDQ; Agilent 2100 Bioanalyzer; 및 Qiagen QIAxcel을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 전기영동으로 생성물을 분해하는 과정은 예를 들면 POP-7, POP-6, POP-5 또는 POP-4(이들 모두 Applied Biosystems가 판매)를 포함하는 액체 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 생성물을 분해하는 데에 크기에 따라 대략 250개, 300개, 350개, 400개 또는 그 이상의 트리뉴클레오타이드 반복부를 정확하게 포함하는 생성물을 분해할 수 있는 중합체, 예를 들면 POP-4를 사용한다. 예를 들면, 전압 공급원(예를 들면, DC 전력 공급)을 포함하는 기계, 압력 공급원(예를 들면, 펌프)을 포함하는 기계 및 화학 분리를 수행하는 데 적합한 칼럼 또는 모세관을 포함하는 기계로부터 선택된 기계를 사용하여 생성물 세트의 고분해능의 분해를 수행할 수 있다. 기계는 물론 상기 부품 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
생성물의 고분해능의 분해는 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 생성시킨다. 이 리프리젠테이션은 반응 생성물의 크기(들) 및 양(들)을 이해하기 위해 예를 들면 적절한 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 또는 농도계와 같은 장치의 도움으로 또는 육안으로 당업자가 해석할 수 있는 영상 또는 그래프일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이 리프리젠테이션은 전기영동도, 사진, 그래프, 플롯 또는 오오토라디오그램(autoradiogram)이다. 이 리프리젠테이션은 생성물 또는 생성물에 결합된 염료 분자에 의해 방출되는 광자 또는 베타 입자로부터 얻거나 기록할 수 있고; 이것을 예를 들면 사진으로 또는 전기적으로 검출하고, 처리 또는 현상하여 이 리프리젠테이션을 생성시킬 수 있다.
본 발명은 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보(즉, 얼마나 많은 CGG 반복부 또는 트리뉴클레오타이드 반복부가 일반적으로 주형에 포함되는가)를 얻는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 정보 획득은 이 리프리젠테이션에서 관찰 가능한 종의 수를 계수하여 (예를 들면, 4개 또는 5개일 수 있는 가장 작은 생성물에 포함되는 반복부 수로부터 출발하여) 반복부 수를 결정하는 것 또는 이 리프리젠테이션에서 관찰 가능한 가장 긴 생성물의 위치에 기초하여 반복부 수를 예상하는 것을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, CGG 풍부 영역이 FMR1의 5' UTR 또는 FMR2의 5' UTR에 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 요소가 존재하는지를 결정하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 인터럽터 요소는 AGG 트리뉴클레오타이드이다. 이것이 존재하는지를 검출하는 것은, 예를 들면, 제1 프라이머의 결합이 실질적으로 감소하는 주형 내 위치를 결정하여 또는 이웃 길이와 비교하여 생성물의 양이 실질적으로 감소하는 길이의 세트를 결정하여 성취할 수 있다. 예를 들면, 10번째의 트리뉴클레오타이드가 14개 이상의 전체 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 영역 내 AGG이고 4개의 CGG 반복부를 포함하는 프라이머의 사용을 포함하는 증폭 반응을 수행할 경우, 10개, 11개, 12개 및 13개의 CGG 반복부를 갖는 생성물은 9개 및 14개의 반복부를 갖는 이웃 생성물에 비해 실질적으로 감소한 양으로 존재하는 것으로 예상된다. 그 양이 감소하는 정도는 25% 내지 95% 또는 그 이상, 예를 들면, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 범위일 수 있다. 감소 정도는 일반적으로 샘플의 접합자에 따라 달라지고; 예를 들면, CGG 풍부 영역이 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자 또는 특이적 AGG 반복부에 대해 이형접합성인 개체로부터 얻은 샘플은 25% 내지 75% 범위의 해당하는 생성물의 양의 감소를 보여줄 수 있다. CGG 풍부 영역이 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자 또는 특이적 AGG 반복부에 대해 반접합성 또는 동형접합성인 개체로부터 얻은 샘플은 50% 내지 95% 또는 그 이상 범위의 해당하는 생성물의 양의 감소를 보여줄 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면 기준 표준 물질 또는 분자 래더와 같은 외부 표준 물질 또는 캘리브레이터의 사용을 요하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 1개 트리뉴클레오타이드 반복부만큼 길이가 다른 생성물에 해당하는 피크를 사용하여 가장 큰 생성물의 크기까지 계수할 수 있으므로(여기서, 계수는 (프라이머에 포함되는 반복부 수에 따라 임의의 필요한 조정이 된) 주형 내의 반복부 수를 나타낼 수 있음)) 이러한 비의존성을 성취할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들면 외삽법에 의해 가장 큰 생성물의 크기를 예상하기 위해 생성물 크기 및 양의 리프리젠테이션의 일부에서 피크 간 간격을 사용할 수 있고; 가장 큰 반복부 수에 해당하는 피크의 분해능이 가장 큰 생성물의 피크를 포함하여 그 피크까지 모든 피크를 계수하기에 불충분할 때 이것은 유용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 CGG 풍부 영역 내의 반복부 수를 100개, 50개, 20개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 반복부 내까지 결정할 수 있다. "0개 단위 내"의 분량의 결정은 이의 정확한 값이 결정된다는 것을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 CGG 풍부 영역 내의 반복부 수를 100개, 50개, 20개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 반복부 내까지 결정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 70개 미만의 CGG 반복부를 포함하는 CGG 풍부 영역 내의 반복부 수를 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 반복부 내까지 결정하는 것; 70개 내지 120개의 CGG 반복부를 포함하는 CGG 풍부 영역 내의 반복부 수를 10개, 5개, 4개 또는 3개의 반복부 내까지 결정하는 것; 또는 120개 초과의 CGG 반복부, 약 200개 미만의 CGG 반복부를 포함하는 CGG 풍부 영역 내의 반복부 수를 20개, 10개 또는 5개의 반복부 내까지 결정하는 것을 포함할 수 있다. 심지어 더 큰 CGG 반복부 영역에 대한 정확성 수준의 결정은 신뢰할만한 공지된 표준 물질의 부족으로 인해 어려울 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 60개, 45개, 30개, 15개, 12개, 9개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 뉴클레오타이드 내까지 인터럽터 요소의 위치를 결정할 수 있다. 인터럽토 요소의 위치를 예를 들면 CGG 풍부 영역의 어느 한쪽 말단에 대한 거리의 면에서 결정할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 프라이머 중 1개 이상은 방사선적 방법으로 또는 전자기적 방법으로 검출 가능한 부분을 포함한다. 방사선적 방법으로 검출 가능한 부분은 검출 가능한 입자, 예컨대 베타 또는 감마 입자를 방출하는 방사선 동위원소, 예를 들면, 14C, 3H, 32P, 33P, 35S 및 125I를 포함한다. 전자기적 방법으로 검출 가능한 부분은 검출 가능한 방식으로 전자기적 방사선과 상호작용(흡수, 방출 또는 둘 다를 포함)하는 화학 물질, 예컨대 발색단 및 형광단, 예를 들면, 플루오레세인, FAM, 시아닌 염료, 로다민 염료 등을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 일부 하기 설명에 기재되어 있고, 일부는 그 설명으로부터 명확하거나, 본 발명의 실행에 의해 학습될 수 있다. 본 발명의 양태는 특히 특허청구범위에 기재된 요소 및 조합에 의해 실현되고 획득될 것이다.
[도면의 간단한 설명]
본 명세서의 일부에 통합되고 이를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 몇몇 실시양태를 예시하고 있고 설명과 함께 본 발명의 원칙을 설명하도록 제공된다.
도 1은 AGG 트리뉴클레오타이드를 포함하는 CGG 풍부 주형의 증폭을 기재한 것이다. 프라이머 서열은 다음과 같다.
Figure pct00001
(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9(서열 번호 42)를 포함하는 주형을 도시하였다. 이것은 FMR1의 5' UTR 내의 가능한 CGG 반복부 영역을 나타낸다. 프라이머 Tag-(GCC)4는 내부적으로 반복부 영역 내에 여러 위치에 결합할 수 있고; CGG 반복부 영역의 상류에 어닐링하는 FAM 표지 정방향 프라이머(FAM-FX-F)에 의해, 이것은 복수의 PCR 생성물을 증폭할 수 있다. 가장 짧은 CGG 앰플리콘은 4개의 CGG 반복부를 갖고, 가장 긴 CGG 앰플리콘은 서열 번호 40의 완전 길이를 포함한다. 완전 길이 생성물보다 상당히 긴 임의의 생성물은 비특이적 생성물로 간주한다.
도 2a 및 도 2b는 5개의 임상 샘플(도 2a 및 도 2b의 상부 왼쪽 패널에서 플롯부에 표시된 AFM104, AFB107, ABB001, AFB011 및 AMB12) 및 3개의 Coriell 표준 물질(상부 왼쪽이 아닌 도 2b의 플롯부에 표시된 31/46 CGG, 31/54 CGG 및 30/75 CGG)으로부터 얻은 PCR의 전기영동도를 보여준다. 임상 샘플의 경우, 서열분석에 의해 결정되는 CGG 풍부 영역의 서열을 플롯부에 기재하였다. Coriell 표준 물질의 경우, 전기영동도에 의해 표시된 샘플 내에 존재하는 2개의 FMR1 5' UTR 대립유전자의 CGG 반복부 함량을 "확인된"으로 기재하였다. 선택된 피크를 피크에 해당하는 생성물에 포함되는 CGG 트리뉴클레오타이드 수로 표지한다. 수직 축에서의 단위는 형광 강도를 나타내고 임의적이다. 수평 축에서의 단위는 예상 뉴클레오타이드 크기를 나타낸다. CE 장치의 (보유 시간과 관련된) 스캔 수에 기초하여 이 예산 크기를 결정한다.
도 3a 및 도 3b는 8개의 Coriell 표준 물질로부터 얻은 PCR 결과의 전기영동도를 보여준다. 각각에서, CGG 트리뉴클레오타이드의 최대 검출 수에 해당하는 피크는 이것이 분해 가능할 때 표시된다. 트리뉴클레오타이드 수가 Coriell 표기와 다른 경우 또는 AGG 트리뉴클레오타이드가 검출되는 경우, 전기영동도로부터 추측된 서열을 플롯부에 나타냈다. 도 3b의 상부 오른쪽 패널에서, 각각의 생성물 종에 해당하는 모든 피크가 분해될 수 있는 것은 아니지만, 가장 오른쪽 피크의 위치가 122개의 CGG 트리뉴클레오타이드의 예상 함량에 해당하였다. 2개의 바닥 패널에서, 더 긴 대립유전자의 완전 길이 근처의 생성물의 증폭은 검출되지 않았다. 수평 및 수직 축 표시는 도 2a에서와 같다.
도 4는 3개의 프라이머를 사용한 분석을 나타낸다. 생성물 검출에 사용하기 위해 FMR1R-FAM은 CGG 반복부 영역의 하류에 어닐링하고 FAM 형광단을 포함한다. 키메라 프라이머는 CGG 반복부 및 또한 제3 프라이머, 이 경우 표시된 원래 주형에 어닐링하지만 또한 키메라 프라이머 서열을 포함하는 생성물에 어닐링하는 FMR1-F의 서열에 일치하는 5' 플랩을 포함한다. 키메라 프라이머는 더 낮은 농도로 제공되어 사이클마다 생성물 크기의 점진적인 감소를 제한하도록 신속히 소모된다.
도 5는 각 플롯부에 표시된 이종접합성 Coriell 표준 물질의 3개의 프라이머 분석으로부터 얻은 PCR 결과의 전기영동도를 보여준다. 수평 축 및 수직 축 표시는 도 2a에서와 같다. 각 패널에서, 가장 높은 피크는 샘플 내에 존재하는 2개의 대립유전자 중 더 짧은 것에 해당하고, 이 분석에 의해 결정된 CGG 반복부 수에 따라 표시된다. 피크를 삽입 확대로 보이는 190번째 피크까지 계수하였다.
도 6은 5개의 게놈 DNA 샘플(패널 A, 패널 B, 패널 C, 패널 D 및 패널 E)로부터 얻은 PCR 결과의 전기영동도를 보여준다. 패널 A, 패널 B 및 패널 C는 수컷 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 것이다. 패널 D 및 패널 E는 암컷 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 것이다. 선택된 피크를 피크에 해당하는 생성물이 포함하는 CGG 트리뉴클레오타이드 수로 표지한다. 예측된 게놈 대립유전자 서열을 플랫 영역에 나타냈다. 수직 축에서의 단위는 형광 강도를 나타내고 임의적이다. 수평 축에서의 단위는 예상 뉴클레오타이드 크기를 나타낸다. 실시예에 기재된 바대로, 패널 A-E의 프로파일을 생성하기 위해 사용된 샘플은 하기 서열을 갖는 CGG 반복부 영역을 갖는 것으로 결정되었다. 패널 A: 5'-(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3'(서열 번호 46). 패널 B: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)27-3'(서열 번호 47). 패널 C: 5'-(CGG)61-3'(서열 번호 48). 패널 D: 5'-(CGG)20-3'(서열 번호 49) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)10-3'(서열 번호 50). 패널 E: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 51) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3'(서열 번호 46).
도 7은 상이한 대립유전자(상부 패널, 5'-(CGG)9AGG(CGG)10-3'(서열 번호 53) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)20-3'(서열 번호 54); 바닥 패널, 5'-(CGG)20-3'(서열 번호 49) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)10-3'(서열 번호 50))에 대한 2개의 상이한 AGG 반복부 배정에 대해 예측된 CE 전기영동도(상부 및 바닥 왼쪽 패널), 및 대립유전자 둘 다의 증폭 생성물에 대한 모의 CE 전기영동도(바닥 오른쪽 패널)를 보여준다. 관찰된 CE 전기영동도를 상부 오른쪽 패널에 나타냈다.
도 8은 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 8의 증폭 분석을 나타낸다. FMR1_F는 CGG 반복부 영역의 상류에 어닐링한다. FMR1_R은 CGG 반복부 영역의 하류에 어닐링한다. 생성물의 검출에 사용하기 위해 FMR1_F_FAM 및 FMR1_R_FAM은 각각 동일한 2개의 프라이머에 해당하지만, FAM 형광단을 포함한다. FMR1_F_(CGG)n은 표시된 원래 주형에 어닐링하고 또한 키메라 프라이머 서열을 포함하는 생성물에 어닐링하는 FMR1_F의 서열에 일치하는 5' 플랩 및 CGG 반복부를 포함하는 키메라 프라이머이다. 키메라 프라이머는 더 낮은 농도로 제공되어 사이클마다 생성물 크기의 점진적인 감소를 제한하도록 신속히 소모된다. FMR1_R_(CCG)n은 표시된 원래 주형에 어닐링하고 또한 키메라 프라이머 서열을 포함하는 생성물에 어닐링하는 FMR1_R의 서열에 일치하는 5' 플랩 및 CCG 반복부를 포함하는 키메라 프라이머이다. FMR1_F_(CGG)nA는 FMR1_F_(CGG)n에 상응하지만 또한 3' 말단 dA를 갖는 키메라 프라이머이다. 3' 말단 dA는 몇몇 CGG 반복부 영역 내에 존재하는 AGG 서열에 대한 상보성 영역 내에 DNA 가닥 상 T에 어닐링한다. FMR1_R_(CCG)nCCT는 FMR1_R_(CCG)n과 동일한 서열이지만 또한 3' 말단 dCdCdT를 갖는 키메라 프라이머이다. 말단 dCdCdT는 몇몇 CGG 반복부 영역 내에 상보성 DNA 가닥 상에 존재하는 AGG 서열에 어닐링한다. 이 분석에 사용된 프라이머 서열은 예를 들면 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00002
나타낸 FMR_F 및 FMR_R 서열은 각각 CGG 반복부를 플랭킹하는 5' 및 3' 영역으로부터 임의의 다른 적합한 프라이머 서열에 의해 치환될 수 있다.
도 9는 도 8에 도시된 PCR 식에 따른 AGG 트리뉴클레오타이드를 포함하는 CGG 풍부 주형의 증폭을 도시한 것이다. 이 도면의 상부 및 바닥 부분은 도 6d에 실제 CE 전기영동도를 도시한 게놈 DNA 샘플 내에 존재하는 2개의 가능한 대립유전자 배치를 나타낸다. 상부 부분은 10번째 CGG 반복부 후 존재하는 AGG 서열을 갖는 31개의 반복부 대립유전자(5'-(CGG)10AGG(CGG)203'(서열 번호 54)) 및 9번째 CGG 반복부 후 존재하는 AGG를 갖는 20개의 반복부 대립유전자(5'-(CGG)9AGG(CGG)10-3'(서열 번호 53))를 포함하는 2개의 대립유전자의 증폭을 도시한 것이다. 바닥 부분은 CGG 반복부 내 AGG 서열을 갖지 않는 20개의 반복부 대립유전자(5'-(CGG)20-3'(서열 번호 49)) 및 11번 반복부 위치에 존재하는 AGG 및 21번 반복부 위치에 존재하는 AGG를 갖는 31개의 반복부 대립유전자(5'-(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)10-3'(서열 번호 50))를 포함하는 2개의 대립유전자의 증폭을 도시한 것이다. 오른쪽 패널은 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 증폭 생성물의 실제 CE 전기영동도를 보여주는 것으로, 이 도면의 바닥 부분에서의 대립유전자 배치를 나타내는 증폭 생성물의 존재를 입증한다.
도 10은 도 6e에 실제 CE 전기영동도가 도시되고 46개 및 97개의 CGG 반복부를 갖는 대립유전자를 포함하는 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 도 8b에 도시된 PCR 식에 의해 생성되는 대립유전자 증폭 생성물의 모의 CE 전기영동도를 보여준다. 도 8b에서의 PCR 식에 따른 증폭시, 2개의 가능한 대립유전자 배치(왼쪽 패널, 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 51) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3'(서열 번호 52); 오른쪽 패널, 5'-(CGG)46-3'(서열 번호 55) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 56))는 왼쪽 및 오른쪽 바닥 패널 및 도 6e에 도시된 것과 동일한 CE 전기영동도를 생성시킨다.
도 11은 도 6e에 실제 CE 전기영동도가 도시되고 46개 및 97개의 CGG 반복부를 갖는 대립유전자를 포함하는 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 도 8d에 도시된 PCR 식에 의해 생성되는 대립유전자 증폭 생성물의 모의 CE 전기영동도를 보여준다. 이 도면은 2개의 가능한 대립유전자 배치(왼쪽 패널, 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 51) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3'(서열 번호 52); 오른쪽 패널, 5'-(CGG)46-3'(서열 번호 55) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 56))로부터 도 8d에 도시된 PCR 분석 식에 의한 증폭(여기서, 반복부 프라이머(FMR_R_(CCG)n)의 방향성이 역전됨) 이후 얻은 증폭 생성물을 모의한 것이다. 2개의 대립유전자 시나리오는 상이한 CE 프로파일(도 11, 바닥 패널)을 생성시킨다.
도 12는 (46/97개의 CGG 반복부 대립유전자를 포함하는) 상기 도 10 및 도 11의 설명에 기재된 동일한 게놈 DNA 샘플로부터 얻은 대립유전자 증폭 생성물의 실제 CE 전기영동도를 보여준다. 도 8b(상부 패널) 또는 도 8f(바닥 패널)에서의 PCR 분석 식에 따라 증폭된 샘플로부터 CE 전기영동도를 생성시킨다.
도 13은 (46/97개의 CGG 반복부 대립유전자를 포함하는) 상기 도 10, 도 11 및 도 12의 설명에 기재된 동일한 게놈 DNA 샘플로부터 도 8f에 도시된 PCR 분석 식에 의한 증폭 이후 얻은 예상된 증폭 생성물(5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 51), 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3'(서열 번호 52), 5'-(CGG)46-3'(서열 번호 55) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 56))을 도식으로 보여준다.
도 14는 2개의 상이한 대립유전자 시나리오(도면의 상부 부분: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 51) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3'(서열 번호 52); 도면의 바닥 부분: 5'-(CGG)46-3'(서열 번호 55) 및 5'-(CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3'(서열 번호 56))에 의한 (상기 도 10 내지 도 13의 설명에 기재되고 46/97개의 CGG 반복부 대립유전자를 포함하는) 게놈 DNA 증폭 이후 도 8h의 PCR 분석 식을 이용하여 예상된 증폭 생성물을 도식으로 보여준다. 도 8h의 PCR 분석은 역방향 고정된 dT 프라이머(FMR1_R_(CCG)nCCT)(도 8h)를 이용한다. 이 분석은 46개의 반복부 대립유전자가 2개의 AGG를 갖고 97개의 반복부 대립유전자가 1개의 AGG를 갖는 도면의 상부 부분에 나타낸 대립유전자 시나리오에 대해 14개, 15개 및 24개의 CGG 크기 등가물의 피크를 갖는 CE 전기영동도를 생성해야 하거나, 또는 이 분석은 46개의 반복부 대립유전자가 AGG를 갖지 않고 97개의 반복부 대립유전자가 모든 3개의 AGG를 갖는 도면의 바닥 부분에 나타낸 대립유전자 시나리오에 대해 15개, 65개 및 75개의 CGG 크기 등가물의 피크를 갖는 CE 전기영동도를 생성해야 한다. 이 도면은 또한 이 게놈 DNA 샘플의 증폭 이후 실제 CE 전기영동도(도면의 상부 오른쪽 부분)를 보여준다. 전기영동도는 이 도면의 상부 왼쪽 부분에 도시된 대립유전자 시나리오와 일치한다.
도 15는, 도 8c에 도시된 본 발명의 분석 방법에 따른, 게놈 DNA 샘플 및 혼합 게놈 DNA 샘플의 증폭 이후 CE 전기영동도를 도시한 것이다. 1개가 30개의 CGG 반복부 대립유전자(패널 A)를 갖고 다른 1개가 645개의 CGG 반복부 대립유전자(패널 B)를 갖는 2개의 상이한 DNA 샘플을 분리하여 분석한다. 이 2개의 샘플(패널 C)로부터 얻은 염색체 DNA의 인공 조합을 또한 분석하여 상기 방법이 AGG 트리뉴클레오타이드 삽입부를 갖는 짧은 대립유전자의 존재 하에 더 긴 CGG 반복부의 5' 말단 근처에 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 맵핑할 수 있다는 것을 입증한다.
도 16은 샘플 20으로부터 얻은 염색체 DNA 증폭 이후 CE 전기영동도(표 4)를 보여준다. 샘플은 1개가 완전 돌연변이 대립유전자인 2개의 주대립유전자 및 2개의 부대립유전자를 갖는다. 대립유전자 배치는 샘플 내 세포의 모자이크 집단으로부터 얻은 것으로 생각된다. 패널 A, 도 8a에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 패널 B, 도 8h에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 패널 C, 도 8d에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 데이터는, 분석의 AGG/CGG 맵핑 능력을 입증하는 것 이외에, 또한 완전 돌연변이 대립유전자 내에 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재를 입증한다.
도 17은 샘플 27로부터 얻은 염색체 DNA 증폭 이후 CE 전기영동도(표 4)를 보여준다. 패널 A, 도 8a에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 패널 B, 도 8h에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 패널 C, 도 8d에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 증폭 생성물. 패널 C를 패널 A보다 밀접한 비율로 나타내어, 완전 길이 피크가 나타나는 영역이 보이지 않는다는 것에 유의한다.
도 18은 샘플 6 및 샘플 20으로부터 얻은 염색체 DNA 증폭 이후 CE 전기영동도(표 4)를 보여준다. 패널 A 및 패널 B는 도 8f에 도시된 식에 의한 PCR 증폭 이후 각각 샘플 6 및 샘플 20으로부터 얻은 증폭 생성물을 보여준다. 실시예에 기재된 바대로, 패널 A 및 패널 B의 프로파일을 생성하도록 사용되는 샘플은 다음의 CGG 반복부 서열로 이루어지는 모자이크 CGG 반복부 영역을 갖는 것으로 결정되었다. 패널 A: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3'(서열 번호 57), 5'-(CGG)9AGG(CGG)7AGG(CGG)24-3'(서열 번호 58)(부대립유전자) 및 5'-(CGG)9AGG(CGG)7AGG(CGG)42-3'(서열 번호 59). 패널 B: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3'(서열 번호 57), 5'-(CGG)9AGG(CGG)44-3'(서열 번호 60) 및 5'-(CGG)9AGG(CGG)60-3'(서열 번호 61).
도 19는 FMR1 및 FMR2 유전자의 5' 비번역 영역 내에 CGG 반복부 내 AGG 트리뉴클레오타이드를 맵핑하기 위한 작업 흐름을 나타낸다. A 분석, C 분석, G 분석 및 F 분석은 도 8에 도시된 상응하는 PCR 분석을 말한다.
예시적인 실시양태의 목록
1. (a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 제1 프라이머, 및 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머를 포함하는 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 1 이상의 CGG 풍부 영역을 포함하는 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
(d) 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
2. (a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하는 제1 프라이머, CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머 및 제1 프라이머의 5' 플랩에 포함되는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함하는 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
(b) 3개 이상의 상이한 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지에 대한 정보를 얻는 것을 포함하는 방법.
4. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것을 포함하는 방법.
5. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 인터럽터 서열이 AGG 요소인 방법.
6. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 것을 추가로 포함하는 방법.
7. 실시양태 6에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역이 200개 초과 또는 미만의 CGG 반복부를 포함하는지를 결정하는 것인 방법.
8. 실시양태 6에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역 내에 존재하는 CGG 반복부 수를 결정하는 것인 방법.
9. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 데 있어서 외부 표준 또는 캘리브레이터를 사용하지 않는 것을 조건으로 하는 것인 방법.
10. 실시양태 1 또는 2에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR1의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
11. 실시양태 1 또는 2에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR2의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
12. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 고분해능 기법은 3개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍만큼 길이가 다른 생성물을 분해할 수 있는 것인 방법.
13. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 고분해능 기법은 모세관 전기영동인 방법.
14. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 고분해능 기법은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동인 방법.
15. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 전기영동도인 방법.
16. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 PCR 생성물 또는 생성물에 결합하는 염료 분자에 의해 방출되는 광자 또는 베타 입자로부터 기록되는 이미지 또는 그래프인 방법.
17. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 제1 프라이머의 결합이 실질적으로 감소된 위치를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
18. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 실질적으로 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
19. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 50% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
20. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 90% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
21. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 25% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하고, CGG 풍부 영역은 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자에 대해 이형접합성인 개체 유래인 것인 방법.
22. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 제1 프라이머는 4개 또는 5개의 CGG 또는 CCG 반복부를 포함하는 것인 방법.
23. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 제2 프라이머는 서열 번호 1-38로부터 선택되는 것인 방법.
24. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 방사선적 방법으로 또는 전자기적 방법으로 검출 가능한 부분을 포함하는 것인 방법.
25. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 형광단을 포함하는 것인 방법.
26. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 고정 분석인 방법.
27. 실시양태 26에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 내 또는 이의 3' 말단에 A, T, AG, CT, AGG 및 CCT로부터 선택되는 부분서열을 포함하는 것인 방법.
28. 실시양태 27에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 A를 포함하는 것인 방법.
29. 실시양태 27에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 CCT를 포함하는 것인 방법.
30. 실시양태 26에 있어서, 1 이상의 CGG 풍부 영역에 포함되는 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
31. 실시양태 30에 있어서, 샘플이 다르게 위치하는 인터럽터 요소를 갖는 주대립유전자 및 부대립유전자를 포함하는지를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
32. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 비고정 분석인 방법.
33. 실시양태 2에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 100배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
34. 실시양태 2에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 500배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
35. 실시양태 2에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 900배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
36. 실시양태 2에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하는 것인 방법.
37. 실시양태 2에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하는 것인 방법.
38. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 제1 추가 프라이머 및 임의로 제2 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제1 추가 프라이머, 단계(a)의 제2 프라이머 및 제2 추가 프라이머로부터 선택된 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제2 PCR을 수행하여 제2 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제2 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제2 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
단계(a)의 제1 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖고, 제1 추가 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 A를 포함하는 것인 방법.
40. 실시양태 38에 있어서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 T를 포함하는 것인 방법.
41. 실시양태 38에 있어서, 1 이상의 CGG 풍부 영역의 1 이상의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 실시양태 41에 있어서, 샘플은 CGG 영역에 대해 2 이상의 배수성을 갖는 세포로부터의 유전자 물질을 포함하고, 이 방법은 2 이상의 CGG 풍부 영역의 2 이상의 길이를 결정하는 것을 포함하는 방법.
43. 실시양태 41에 있어서, 샘플은 100개 이상의 CGG 반복부를 포함하는 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자를 포함하는 것인 방법.
44. 실시양태 38에 있어서, 샘플이 다르게 위치하는 인터럽터 요소를 갖는 주대립유전자 및 부대립유전자를 포함하는지를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
45. 실시양태 38에 있어서, 제1 추가 프라이머는 제1 프라이머에 대하여 반대 방향인 방법.
46. 실시양태 45에 있어서, 제1 프라이머는 3' 말단이 하류로 향하도록 CGG 풍부 영역에 결합하고, 제1 추가 프라이머는 3' 말단이 상류로 향하도록 CGG 풍부 영역에 결합하는 것인 방법.
47. 실시양태 46에 있어서, 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것 및 1 이상의 인터럽터 요소를 포함하는 CGG 풍부 영역의 크기를 결정하는 것을 포함하는 방법.
48. 실시양태 47에 있어서, 샘플은 적어도 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자를 포함하고, 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자는 길이가 다른 CGG 풍부 영역을 포함하는 것인 방법.
49. 실시양태 38에 있어서, 적어도 제3 추가 프라이머 및 임의로 제4 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제3 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제3 추가 프라이머, 제2 추가 프라이머 및 제4 추가 프라이머로부터 선택된 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제3 PCR을 수행하여 제3 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제3 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제3 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
제3 추가 프라이머는 단계(a)의 제1 프라이머에 대하여 반대 방향이고 제1 추가 프라이머와 상이한 것인 방법.
50. 실시양태 49에 있어서, 샘플에 포함되는 1개 이상의 대립유전자의 어느 한쪽 말단의 150 bp 내에서의 인터럽터 요소의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
51. 실시양태 50에 있어서, 1개 이상의 대립유전자에 포함되는 1 이상의 인터럽터 요소의 1 이상의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
52. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 적어도 제1 추가 프라이머 및 제2 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제1 추가 프라이머 및 제2 추가 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제2 PCR을 수행하여 제2 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제2 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제2 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
제1 추가 프라이머는 단계(a)의 제1 프라이머에 대하여 반대 방향인 방법.
53. 실시양태 52에 있어서, 제1 프라이머 및 제1 추가 프라이머 중 1개 이상은 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
54. 실시양태 53에 있어서, 제1 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖고, 제1 추가 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
55. 실시양태 54에 있어서, 샘플은 길이가 다른 CGG 풍부 영역을 포함하는 2개 이상의 대립유전자를 포함하고, 이 방법은 2개 이상의 대립유전자의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
56. 실시양태 55에 있어서, 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것 및 1 이상의 인터럽터 요소가 포함되는 대립유전자의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
57. (a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는, 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계로서, 3개 뉴클레오타이드만큼 길이가 다른 생성물이 분해되는 것인 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
58. (a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하며, 제3 프라이머가 제1 프라이머의 5' 플랩의 동일한 서열을 갖는, 3개의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
(b) 3개의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
(c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계로서, 3개 뉴클레오타이드만큼 길이가 다른 생성물이 분해되는 것인 단계; 및
(d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
59. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역이 200개 초과 또는 미만의 CGG 반복부를 포함하는지를 결정하는 것인 방법
60. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 상기 정보는 CGG 풍부 영역 내에 존재하는 CGG 반복부 수를 결정하는 것인 방법.
61. 실시양태 57 또는 58에 있어서, CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 데 있어서 외부 표준 또는 캘리브레이터를 사용하지 않는 것을 조건으로 하는 것인 방법.
62. 실시양태 57 또는 58에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR1의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
63. 실시양태 57 또는 58에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR2의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
64. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 고분해능 기법은 3개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍만큼 길이가 다른 생성물을 분해할 수 있는 것인 방법.
65. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 고분해능 기법은 모세관 전기영동인 방법.
66. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 고분해능 기법은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동인 방법.
67. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 전기영동도인 방법.
68. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 PCR 생성물 또는 생성물에 결합하는 염료 분자에 의해 방출되는 광자 또는 베타 입자로부터 기록되는 이미지 또는 그래프인 방법.
69. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 제1 프라이머는 4개 또는 5개의 CGG 또는 CCG 반복부를 포함하는 것인 방법.
70. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 제2 프라이머는 서열 번호 1-38로부터 선택되는 것인 방법.
71. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 방사선적 방법으로 또는 전자기적 방법으로 검출 가능한 부분을 포함하는 것인 방법.
72. 실시양태 57 또는 58에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 형광단을 포함하는 것인 방법.
73. 실시양태 58에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 100배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
74. 실시양태 58에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 500배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
75. 실시양태 58에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 900배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
76. 실시양태 58에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하는 것인 방법.
77. 실시양태 58에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하는 것인 방법.
78. 서열 번호 44 및 서열 번호 45로부터 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
[실시예]
본 발명의 실시양태에 참조문헌이 자세히 이루어졌고, 이의 양태 및 결과는 도면에 예시되어 있다. 명확성 및 연속성 목적으로, 특정 실시예의 방법 및 결과의 논의 및 해석의 몇몇 부분은 이후 바로 제공되며; 실시예의 제시는 이 부분 후 재개된다.
실시예 1: 반복부 프라이밍 PCR 분석 및 고분해능 모세관 전기영동에 의한 정상 및 낮은 전돌연변이 대립유전자에 대한 FMR1 프로모터 내의 CGG 반복부 수 및 AGG 위치의 결정
CGG 반복부의 정상 내지 낮은 전돌연변이 수를 포함하는 8개의 게놈 DNA 샘플(5개의 임상 샘플: AFM104, AFB107, ABB001, AFB011 및 AMB12; 및 3개의 Coriell 표준 물질: 31/46 CGG, 31/54 CGG 및 30/75 CGG)을 다음과 같이 평가하였다. 사용되는 프라이머는 서열 번호 38-39이었다. 사용되는 PCR 반응 조건은 공개 프로토콜(Saluto et al., J. Mol. Diagn. 7: 605-12 (2005))에 기초하고 약간 변경하였다. 반응 용적 15 ㎕ 중에 Roche Expand Long Template PCR 완충제 2(로슈 카탈로그 11681834001호) + 2.2 M 베타인(시그마 카탈로그 B0300-1VL호), 각 dNTP(로슈, GMP 등급 카탈로그 G 04631129103호, C 04631072103호, A 04631056103호, T 04631137103호) 250 μM, 각 프라이머 1.5 μM 및 로슈 GMA 재조합 Taq DNA 폴리머라제(로슈, 카탈로그 03734935001호) 1.25 U를 포함하는 반응 완충제 중에 게놈 DNA 15 내지 20 ng을 증폭시켰다. PCR 사이클 조건은 사이클마다 20 초 자동 연장되면서 5 분 동안 95℃; 이후 35 초 동안 97℃ - 35 초 동안 62℃ - 4 분 동안 68℃의 10회 사이클; 이후 35 초 동안 97℃ - 35 초 동안 62℃ - 4 분 동안 68℃의 20 사이클이었다. PCR 생성물 1 ㎕를 12 ㎕ Hi-Di™ 포름아미드(Applied Biosystems (ABI) 부품 4311320호) 중의 (문헌[DeWoody et al., Bio기술 37:348, 350, 352(2004)]에 따라 제조된) ROX 1007 래더 2 ㎕와 혼합하고 2 분 동안 95℃에서 열 변성시키고 이후 POP7 액체 중합체(ABI 부품 4352759호)를 사용하여 모세관 길이가 36 ㎝인 ABI 3130xl 장치에서 모세관 전기영동하였다. 도 2a 및 도 2b에 얻은 전기영동도를 도시하였다.
전기영동도에서의 피크를 최소 가능한 생성물 CGG 함량인 4로 시작하여 번호 매겼다. 피크 n에서 n+1로의, 예를 들면 피크 10에서 11로의 피크 강도의 상당한 감소는 피크 n+1에 해당하는 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재를 시사한다. 1개의 트리뉴클레오타이드는 4개의 낮은 강도 피크를 생성시켰고, 이것은 AGG 트리뉴클레오타이드가 그 트리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 4개의 결합 위치에 대한 CGG 함유 프라이머 친화도를 감소시키기 때문인 것으로 생각된다(프라이머는 서열 번호 39의 서열로 4개의 CGG 반복부를 포함한다는 것을 상기한다). 상기 기재한 바대로 처음에 4로 번호 매기면서 피크의 전체 수를 계수하여 트리뉴클레오타이드의 전체 수를 결정하였다. 도 2a의 각 패널의 오른쪽 및 도 2b의 상부 왼쪽 패널에서의 작은 피크는 프라이머의 오직 3개의 CGG 반복부 및 주형이 어닐링되는 어닐링 사건으로 발생하는 것으로 생각되고, 그러므로 실제 주형 길이를 반영하지 않는다. 표준 기법에 의해 5개의 임상 샘플을 서열분석하여(표 1 참조) 전체 반복부 함량 및 AGG 트리뉴클레오타이드 반복부 위치를 확인하였다. 모든 5개의 임상 샘플의 경우, 개시된 방법을 통해 얻은 결과는 서열분석을 통해 얻은 결과와 일치하였다.
Figure pct00003
실시예 2: 2개의 프라이머 반복부 프라이밍 PCR 분석에 의한 암컷 샘플로부터 얻은 몇몇 긴 대립유전자에서 반복부 수 및 위치의 결정에서의 어려움
정상 내지 완전 돌연변이 범위의 CGG 반복부를 포함하는 샘플로 이 분석을 평가하기 위해, 다른 8개의 샘플 세트, 즉 2개의 전체 혈액 임상 샘플(69개의 CGG 및 87개의 CGG로 표지한 도 3의 패널에 해당하는 샘플 00100호 및 00065호) 및 6개의 Coriell 세포주 게놈 DNA 샘플(56, 76, 96, 118, 20/183-193 및 28/336 CGG를 나타내는 Coriell 표기를 가짐)을 시험하였다. 실시예 1에 기재된 바대로 PCR 반응을 수행하였다. 도 3a 및 도 3b에 얻은 전기영동도를 도시하였다. 이러한 전기영동도에서, 육안 검사에 의해 계수하고자 하는 최종 피크를 결정하였다. 수컷으로부터 얻은 모든 6개의 샘플의 경우(도 3a의 모든 패널 및 도 3b의 상부 2개의 패널), 이러한 분석은 AGG 트리뉴클레오타이드의 크기(반복부 수) 및 위치 둘 다를 결정할 수 있었다(표 2 참조). 반복부 수는 Coriell 표기 또는 4% 내까지 서열분석을 통해 얻은 수와 일치하였다. 분석은 암컷 샘플의 더 긴 대립유전자에 존재하는 반복부의 완전 수를 검출할 수 없었다(도 3b의 바닥 패널).
Figure pct00004
실시예 3: 반복부 프라이밍 PCR 에 대한 변형 3개의 프라이머 시스템을 사용하는 높은 전돌연변이 및 완전 돌연변이 대립유전자에서 CGG 반복부 수 및 AGG 위치의 결정
검출될 수 있는 반복부 수를 증가시키기 위해, 도 4에 도시된 바대로 절차를 변형하였다. 3개의 프라이머를 사용하였다. 제1 프라이머는 3' 말단에서 5개의 CGG 반복부를 포함하고 서열 번호 41의 서열을 갖는 키메라 프라이머이었다. 제2 프라이머는 제1 프라이머에 대한 역방향 프라이머이고; 이 제2 프라이머는 서열 번호 37의 서열을 가졌다. 제3 프라이머는 키메라 프라이머에 대해 정방향이었고 5개의 CGG 반복부가 없다는 것을 제외하고는 키메라 프라이머와 동일한 서열을 가졌다. 키메라 프라이머는 제2 프라이머 및 제3 프라이머의 농도보다 대략 1000 배 낮은 1.5 nM 농도로 (각각 1.5 μM으로) 제공되어, 키메라 프라이머는 몇몇 제1 PCR 사이클 내에서 고갈될 것이다. 다른 조건은 실시예 1에서와 같았다. 이 절차를, 도 5에 기재된 주형으로 수행하여, 상부 패널로 나타낸 실험에서 대략 196∼199개까지의 반복부를 갖는 생성물을 얻었다. 이 값은 183∼193개의 CGG 반복부의 Coriell 표기에 가깝지만, 이것보다 약간 높았다. 바닥 패널로 나타낸 실험에서, Coriell 표기에 따라 336 CGG 반복부 표지된 전기영동도의 오른쪽에서 멀리 피크가 관찰되었다. 명확한 반복부 수는 250∼300개의 반복부이었지만, 이 생성물의 크기가 POP-7 중합체 기반 CE가 크기에 따라 정확하게 생성물을 포함하는 CGG 반복부를 분해할 수 있는 범위 내에 있는 것으로 생각되지 않으므로 이 명확한 크기가 정확한 것으로 생각되지 않는다. POP-7 중합체 기반 CE에 의해, 약 200개 초과의 CGG 반복부를 포함하는 생성물은 인공적으로 단축된 명확한 크기를 갖는 경향이 있었다. 따라서, 이 결과는 피크가 250개 이상의 반복부 수를 갖는 생성물을 나타낸다는 것을 제시하였다. 패널 둘 다에서, Coriell 표기에 기재된 더 짧은 대립유전자로 나타낸 반복부 수를 갖는 생성물에 대해 정확한 예상 위치에서 피크가 관찰되었고, 이 표기는 상부 패널의 경우 20개이고, 바닥 패널의 경우 28개이었다(이 패널에 나타난 큰 피크는 29개의 반복부 수에 해당함). 각각의 패널에서, 더 긴 대립유전자에 해당하는 피크(Coriell 표기 반복부 수 183-193개 및 336개)는 각각의 반복부 수 함유 생성물에 대한 피크보다 넓었다. 도 5의 상부 패널에서의 183∼193개의 CGG 피크의 폭은 대략 5∼10개의 CGG 반복부 또는 15∼30 bp인 것으로 보였다. 도 5의 각각의 전기영동도에서의 가장 왼쪽 피크는 5개의 CGG 반복부를 포함하는 키메라 프라이머로 인해 5개의 CGG에 해당한다는 것에 유의한다.
실시예 4: 반복부 프라이밍 PCR 에 대해 변형 3개의 프라이머 시스템에 의한 수컷 대립유전자에서 FMR1 프로모터의 CGG 반복부 내 AGG 위치의 결정
정상 내지 낮은 전돌연변이 범위에서 CGG 반복부 수를 갖는 대립유전자를 포함하는 5개의 게놈 DNA 샘플(30 CGG, 47 CGG, 61 CGG, 20/31 CGG 및 46/97 CGG)을 평가하였다. 간단히 말하면, 기재된 CGG 반복부 수는 트리뉴클레오타이드의 전체 수, 즉 CGG 트리뉴클레오타이드의 수 및 차단 AGG 트리뉴클레오타이드의 수의 합을 반영한다. Asuragen Inc.(Austin, TX, USA)로부터 구입한 GC 풍부 AMP 완충제(Asuragen 카탈로그 49387호) 11.45 ㎕, FAM 표지 FMR1 프라이머(Asuragen 카탈로그 49386호; FMR1_F(서열 번호 14) 1.5 ㎕, FMR1_R_FAM(5'FAM을 갖는 서열 번호 37)), FMR1_F_(CGG)n(서열 번호 41)(Asuragen 카탈로그 49393호) 0.5 ㎕, 뉴클레아제 비함유 물 0.5 ㎕ 및 GC 풍부 Polymerase Mix(Asuragen 카탈로그 49388호) 0.05 ㎕를 포함하는 마스터 믹스를 제조하여 샘플을 PCR 증폭시켰다. 미량적정 플레이트(96웰 또는 384웰 플레이트, Phenix Research Products, Candler, NC, USA)에 분배하기 전에 PCR 마스터 믹스를 와류시켰다. FMR_F 및 FMR_R_FAM의 최종 반응 농도는 1.3 μM이고, FMR1_F_(CGG)n의 최종 반응 농도는 1.3 nM이었다. 게놈 DNA 샘플 분액, 통상적으로 20 ng/㎕에서의 1 ㎕를 미량적정 플레이트의 각 웰에 옮겼다. AB유전자 알루미늄 필름 시트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 플레이트를 밀봉하였다. 밀봉 플레이트를 와류시키고, 원심분리하고, 써멀 사이클러(thermal cycler)(GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems™, Foster City, CA, USA)에 옮겼다. 각 사이클마다 20 초 자동 연장되면서 5 분 동안 95℃의 초기 열 변성 단계, 이어서 35 초 동안 97℃, 35 초 동안 62℃, 4 분 동안 68℃의 10회 사이클 및 이후 35 초 동안 97℃, 35 초 동안 62℃ 및 4 분 동안 68℃의 20 사이클이었다. 최종 연장 단계는 10 분 동안 72℃이었다. CGG 반복부를 평가하기 위한 이 3개의 프라이머 시스템을 도 4 및 도 8a에 도식으로 도시하였다.
PCR 후, 샘플을 -15 내지 -30℃에서 저장(분석 전 광으로부터 보호)하거나 모세관 전기영동(CE)에 의한 증폭 생성물 분석에 즉시 사용하였다. CE의 경우, PCR 생성물(1 ㎕)을 Hi-Di™ 포름아미드(Applied Biosystemss™ 부품 4311320호) 12 ㎕ 중에 (문헌[DeWoody et al., Biotechniques 37:348, 350, 352 (2004)]에 따라 제조된) ROX 1007 래더 2 ㎕와 혼합하고 2 분 동안 95℃에서 열 변성한 후 POP7 액체 중합체(Applied Biosystemss™ 부품 4352759호)를 사용하여 모세관 길이가 36 ㎝인 Applied Biosystemss™ 3130xl 장치에서 모세관 전기영동하였다. 도 6에 얻은 전기영동도를 나타냈다.
전기영동도에서의 피크를 키메라 프라이머 설계에 기초하여 PCR 생성물의 최소 가능한 CGG 반복부 함량인 5로 시작하여 번호 매겼다. 피크 n에서 n+1로의(예를 들면, 도 6 패널 A에서 피크 9에서 10으로의) 피크 강도의 상당한 감소는 피크 n+1에 해당하는 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재를 시사한다. 1개의 AGG 트리뉴클레오타이드는 5개의 낮은 강도 피크를 생성시켰고, 이것은 AGG 트리뉴클레오타이드가 그 트리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 5개의 결합 위치에 대한 CGG 함유 프라이머의 결합 친화도를 감소시키기 때문인 것으로 생각된다(프라이머는 서열 번호 41의 서열로 5개의 CGG 반복부를 포함한다는 것을 상기한다). 상기 기재한 바대로 처음에 5로 번호 매기면서 피크의 전체 수를 계수하여 CGG/AGG 트리뉴클레오타이드의 전체 수를 결정하였다. 예를 들면, 도 6 패널 A에서의 전기영동도는 30개의 CGG/AGG 반복부를 갖는 반접합성 주형인 정상 수컷으로부터 증폭된 생성물의 프로파일을 작성하였다. 잘 정의된 피크의 3개 세트는 CGG 반복부 프라이머의 생성물에 해당하는 자취의 왼쪽에서 명확하다. 가장 왼쪽 피크는 키메라 프라이머가 5개의 상보성 CGG 반복부로 구성되므로 5개의 CGG를 갖는 생성물에 해당하였다. 처음 5개의 피크와 다음의 5개의 가장 강한 피크의 세트 사이의 간격은 개재 AGG 서열에 의한 차단을 반영하였다. 이 간격은 하이브리드화에 각각의 가능한 위치에 정보를 얻으면서 5개의 CGG 반복부, 즉 키메라 프라이머의 간격에 일치하였다(즉, CGG 프라이머 반복부의 "C"와 AGG 인터럽터 서열의 역상보(CCT) 내 "T" 사이의 미스매치에 의한 프라이머 내 각각의 반복부 단위에서 절충됨). 다음 5개의 피크의 세트는 키메라 프라이머가 개재 AGG 서열 뒤의 위치에 결합하면서 현저한 신호 강도 증가를 반영하였다. 이후, 제2 AGG 요소가 마주치고, CGG 서열의 마지막 세트에 걸친 프라이머 연장 후, CGG 생성물 신호가 완전히 소실되었다. CE 데이터는 이 대립유전자에서 30개의 CGG/AGG 반복부의 존재를 나타내었다. 반복부 앰플리콘 후, 전기영동도에서의 간격을 관찰하고, 가장 오른쪽 피크는 30개의 CGG/AGG 자취를 포함하는 FMR1-F 및 FMR1R-FAM 프라이머로부터 생성된 완전 길이 앰플리콘에 해당하는 매우 강한 생성물 밴드였다. 이 CE 프로파일은 5'-(CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3'(서열 번호 46) 서열에 해당하였다.
PCR 생성물 프로파일의 4개의 추가의 예를 FMR1 대립유전자(도 6, 패널 B-E)로부터 얻었다. 수컷으로부터 얻은 샘플을 패널 B 및 패널 C에 나타냈고, 암컷으로부터 얻은 샘플을 패널 D 및 패널 E에 나타냈다. 각각의 경우에, 유전자 특이적 피크를 DNA 표준 물질(즉, ROX 래더)과 비교하여 크기 표시하였다. 이 크기 표시는 상기 기재된 CGG 생성물 피크 계수의 검정 비함유 방법과 일치하였다. 이러한 접근법을 이용한 CGG 정량화의 정확성은 또한 공개된 취약 X 염색체 공통 물질을 사용하는 Wilson 등(J Mol Diagn 10:2-12, 2008)의 결과와 매우 상관되었다. 동일한 분석 전략을 이용하여, 샘플 B 및 샘플 C를 각각 (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)27(서열 번호 47) 및 (CGG)61(서열 번호 48)(AGG 없음)로 해독하였다.
도 6d 및 도 6e에서의 결과의 가능한 해석의 논의, 및 이들을 구별하기 위한 반사 분석
암컷으로부터 얻은 게놈 DNA 샘플에 의한 결과는 해석되기에 더 복잡할 수 있다. 예를 들면, 도 6 패널 D 및 E에 제시된 샘플 결과는 중간 및 높은 강도 피크의 조합을 나타냈다. 이 생성물 패턴은 각각의 대립유전자로부터 1개인 CGG 반복부 생성물의 2개의 집단의 중첩을 반영하였다. AGG 위치를 이형접합성 프로파일에서 2개의 신호 "딥(dip)"(즉, 피크 신호 강도에서의 감소)의 위치로부터 결정할 수 있었다. 수컷 반접합성 대립유전자의 프로파일로부터의 유일한 차이점은 이 경우 2개의 암컷 대립유전자가 앰플리콘의 3' 말단에 대해 동일한 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖지 않으므로 "딥"에서의 신호 강도가 암컷 샘플에서의 기준선 근처로 결코 감소하지 않는다는 것이다. 패널 D에 도시된 샘플(20/31 CGG 대립유전자)의 경우, 오직 1개의 대립유전자가 그 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖고, 다른 대립유전자가 CGG 트리뉴클레오타이드를 가지므로, 피크 10과 피크 16 사이의 제1 AGG 신호 강도 "딥"은 기준선으로 결코 감소하지 않았다. 반대로, 20번 위치에서의 20개의 CGG 대립유전자 말단 및 전기영동도에서 하류 CGG 피크를 따른 제2 AGG 딥이 오직 31개의 CGG 대립유전자에 속하므로, 제2 신호 딥은 기준선으로 돌아갔다. 여기서 유일한 불명확성은 2개의 대립유전자 중 어느 것이 제1 신호 딥으로 확인된 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖는가이다. 공지된 AGG 단상형의 발생 정도에 기초하여, 가장 가능한 경우는 매우 짧은 대립유전자(20개의 CGG)가 AGG를 포함하지 않고 31개의 CGG 대립유전자가 (패널 D에서 서열로 나타낸 바대로) 2개의 AGG를 갖는다는 것이다. 그러나, 표준인 3개의 프라이머 CGG 반복부 프라이밍 분석은 단독으로 어떠한 대립유전자가 제1 AGG 딥에 기여하는지 분명히 보고할 수 없다.
다음 샘플(도 6, 패널 E)의 분석은 더 복잡하였다. CE 자취는 3개의 명확한 AGG 딥(라벨 붙이지 않은 화살표)을 나타냈다. 단상형 통계에 기초한 가장 가능한 시나리오를 이용하여, CE 자취의 왼쪽 상의 2개의 AGG 딥은 46개의 반복부 대립유전자로 배정될 것이고, 제3 AGG 딥(가장 오른쪽 라벨 붙이지 않은 화살표)은 97개의 반복부 대립유전자로 배정될 것이다. 그 결과, 대립유전자 서열은 (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26 및 (CGG)10AGG(CGG)86일 것이다. 그러나, 이 서열에서 2가지의 불명확성이 존재하였다. 우선, 이론상 신호 딥에 의해 확인된 각각의 AGG 트리뉴클레오타이드는 2개의 대립유전자 중 어느 하나로 배정될 수 있다. 모든 3개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 97개의 반복부 대립유전자에 존재하고, 46개의 CGG 반복부 대립유전자에 존재하지 않는 경우, 전기영동도 자취로부터 추정되는 서열은 (CGG)46 및 (CGG)9AGG(CGG)60AGG(CGG)9AGG(CGG)26일 것이다. 이 서열 조합은 상기 기재된 것과 동일한 CE 프로파일을 생성시킬 것이다. 둘째로, 46개의 반복부 대립유전자의 완전 길이 유전자 특이적 피크(CE 자취의 중앙 근처의 매우 높은 강도 피크)는 97개의 반복부 대립유전자에서의 임의의 AGG 딥과 중첩되고 이것을 불명확하게 할 수 있다. 따라서, CE 전기영동도 상에 완전 길이 유전자 특이적 46개의 대립유전자와 동일한 위치에서 이동하는 97개의 반복부 대립유전자 내에 추가의 AGG 신호 딥이 존재할 수 있다.
실시예 4에 도시된 20/31 CGG 및 46/97 CGG 대립유전자(도 6 패널 D 및 E)에 대한 특이적 AGG 맵핑 가능성을 구별하기 위한 추가의 방법을 개발하였다. 하기 실시예 5는 이러한 불명확성을 정확히 해결하기 위한 본 발명의 방법의 이용성을 제시한다.
20/31 대립유전자 샘플(도 6 패널 D)의 경우, 20개 및 31개의 반복부 대립유전자에 대한 2가지 가능한 AGG 배정을 도 7에 도시하였다(왼쪽 패널). 시나리오 둘 다 PCR 증폭 생성물이 CE에 의해 분리될 때(도 7에서 모의, 바닥 오른쪽 패널) 동일한 CE 전기영동도를 발생시키는 것으로 예견되었다. 2개의 가능한 대립유전자 배치의 모의 CE 프로파일(도 7, 바닥 오른쪽 패널)은 실증적 CE 결과(도 7, 상부 오른쪽 패널)와 일치하였다.
표준 3개의 프라이머 CGG 반복부 프라이밍 분석(도 4, 도 8a)이 2개의 대립유전자의 AGG 상태를 구별할 수 없었더라도, 도 9에 도시된 2개의 가능한 대립유전자 시나리오 사이를 구별할 수 있는, 도 8h에 도식으로 나타낸 반사 분석을 개발하였다. 도 8h에 도시된 PCR 분석을 이용하여, 제1 대립유전자 시나리오에 대한 CE 전기영동도(즉, 각각의 대립유전자는 1개의 AGG를 가짐; 도 9, 상부)는 14개의 CGG 및 15개의 CGG 크기 등가물을 갖는 2개의 인접한 피크를 생성시킬 것이다. 더 짧은 20개의 반복부 대립유전자가 CGG를 갖지 않고 31개의 반복부 대립유전자가 2개의 AGG를 갖는 제2 대립유전자 시나리오에 대한 CE 전기영동도(도 9, 바닥)는 15개의 CGG 및 25개의 CGG 크기 등가물을 갖는 피크를 생성시킬 것이다. 다른 실시예(도 6, 패널 E)에서, 견본은 46개 및 97개의 CGG 반복부를 갖는 2개의 대립유전자를 포함하였다. 상기 기재된 바대로, 표준 3개의 프라이머 CGG 반복부 프라이밍 분석(도 4, 도 8a)은 특이적 대립유전자의 AGG 함량을 구별할 수 없었다. 이 샘플에 대한 대립유전자 증폭 생성물의 모의 CE 전기영동도를 도 10에 도시하였다. 도 10의 왼쪽 및 오른쪽 바닥 패널은 3개의 프라이머 CGG 반복부 프라이밍 PCR 분석이 2개의 가능한 대립유전자 배치를 분해할 수 없다는 것을 나타낸다. 그러나, 반복부 프라이머의 방향성이 역방향(FMR1_R_(CCG)n; 서열 번호 43)인 PCR 분석(도 8c)을 사용할 때, 2개의 대립유전자 시나리오는 도 11, 바닥 패널에 도시된 바와 상이한 CE 프로파일을 생성시키는 것으로 예견되었다.
실시예 5: 복잡한 암컷 대립유전자에서 FMR1 프로모터의 CGG 반복부 내에 AGG 위치를 결정하기 위한 PCR 분석
상이한 프라이머가 사용된다는 것을 제외하고는 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 도 6d의 20/31 CGG 샘플의 반사 분석에서 PCR 및 CE 조건을 이용하였다. 정방향 프라이머 서열은 FMR1_F_FAM(서열 번호 14)이고, 역방향 프라이머는 3' 말단 dT를 갖는 고정 프라이머(도 8h, FMR_R_(CCG)nCCT, 여기서 n=4; 서열 번호 45)이었다. 샘플에 대한 실제 CE 프로파일은 15개 및 25개의 CGG 피크(도 9, CE 자취)를 포함하여 2개의 대립유전자 서열이 (CGG)20(서열 번호 49) 및 (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)10(서열 번호 50)이라는 것을 확인시켜 주었다.
도 8b에 도식으로 나타낸 2개의 프라이머 반복부 프라이밍 설계로 도 6e의 46/97 CGG 샘플에서 PCR 분석을 수행할 때, 오직 3개의 AGG 딥이 CE 프로파일에 존재하였다(도 12, 상부 패널 B, 라벨 붙이지 않은 화살표). 이 데이터는 46개의 반복부 대립유전자의 유전자 특이적 피크에 의해 중첩되는 4번째 AGG 딥의 가능성을 배제하였다(도 6e). 또한, 도 8f에 도식으로 나타낸 고정 PCR 분석을 수행할 때, 32개, 42개 및 92개의 CGG 반복부 위치에서의 3개의 명확한 CGG 대립유전자 피크가 관찰되었다(도 12, 바닥 패널 F). 이 결과는 명확히 오직 3개의 AGG가 2개의 대립유전자에 존재한다는 것을 확인시켜 주었다.
논의
그러나, 이 가지 분석 중 어느 것(도 8b, 도 8f)도 각각의 대립유전자에 존재하는 AGG 요소의 수를 명확히 배정하지 않았다. 도 13은 이것이 왜 그러한지 설명하고 - 도 8f 및 도 13에 도시된 고정 A 프라이머 분석(FMR1_F_(CGG)nA; 서열 번호 44)이 46개의 반복부 대립유전자가 2개의 AGG를 갖고 97개의 반복부 대립유전자가 1개의 AGG를 갖는 대립유전자 시나리오(1)(도 13, 상부 도식), 및 46개의 반복부 대립유전자가 AGG를 갖지 않고 97개의 반복부 대립유전자가 모든 3개의 AGG를 갖는 대립유전자 시나리오(2)(도 13, 바닥 도식)에 대해 동일한 CE를 생성시켰다. 그러나, 각각의 AGG는 CGG 프라이머의 방향성이 역방향인 분석을 이용하여 적절한 대립유전자에 정확히 배정될 수 있었다. 도 14에 도시된 바대로, 역방향인, 고정 dT 프라이머(FMR1_R_(CCG)nCCT; 서열 번호 45)(도 8h, 도 14)을 이용하는 PCR 분석은 대립유전자 시나리오(1)에 대한 14개, 24개 및 15개의 CGG 크기 등가물의 피크를 갖는 CE 전기영동도 또는 대립유전자 시나리오(2)에 대한 15개, 65개 및 75개의 CGG 크기 등가물의 피크를 갖는 CE 전기영동도를 생성시켜야 한다. 표 3은 이 고정 dT 프라이밍 분석으로부터 PCR 증폭 생성물의 CE 분리 후 예상된 CGG 피크 크기와 함께 2개의 대립유전자에서 모든 가능한 AGG 분포를 수록한 것이다(도 8h).
Figure pct00005
실시예 6: 반대 방향된 CGG 프라이머에 의한 고정 분석을 이용한 AGG 분포의 결정
고정 dT 프라이머(FMR1_R_(CCG)nCCT; 서열 번호 45)에 의해 도 6e의 46/97 CGG 샘플 상에서 도 8h에 도시된 PCR 분석을 수행하였다. 얻은 CE 프로파일(도 14)은 46개의 반복부 CGG 대립유전자가 10번 및 20번 반복 위치에서 2개의 AGG를 갖고; 97개의 CGG 반복부 대립유전자가 11번 반복 위치에서 1개의 AGG를 갖는다(문헌 협약에 따라 제1 CGG로부터 5'에서 3'로 계수)는 것을 확인시켜 주었다. 따라서, 본 발명의 맵핑 분석을 염색체 FMR 유전자에서의 복잡한 CGG/AGG 대립유전자 반복부 패턴을 분해하기 위해 이용할 수 있었다.
실시예 7: 역방향인 CCG 반복부 프라이밍 PCR 분석을 이용한 암컷 샘플로부터 얻은 정상 및 완전 돌연변이 대립유전자에서 CGG 반복부 수 및 AGG 위치의 결정
CGG 반복부 수 및 AGG 트리뉴클레오타이드 존재 및 위치를 3개의 프라이머 CGG 반복부 프라이밍 PCR 분석(도 8a) 및 고정 dT 역방향 PCR 분석(도 8h)을 이용하여 29개의 임상 염색체 DNA 샘플에 대해 분석하였다. PCR 방법은 적절한 프라이머가 사용된다는 것을 제외하고는 실시예 4 및 실시예 5에 기재된 바와 같았다. 결과를 표 4에 도시하였다. AGG 위치 수는 번호 매김에 대한 문헌 협약에 따른다. NA는 그 대립유전자에서 AGG 트리뉴클레오타이드가 검출되지 않는다는 것을 나타낸다. 1개 이상의 대립유전자를 갖는 수컷 샘플(1, 4, 17, 19, 25 및 26) 및 2개 이상의 대립유전자를 갖는 암컷 샘플(6 및 20)은 샘플 내에 세포의 모자이크 집단으로부터 유도되는 것으로 생각되었다.
Figure pct00006
이러한 2가지 분석(도 8a, 도 8h)에 의한 PCR 증폭 및 CE 분석 후, 대립유전자의 CGG 반복부 수 및 AGG 상태를 29개 중 26개의 샘플에 대해 긍정적으로 결정하였다. 이러한 2가지 분석 포맷은 이 군으로부터 얻은 오직 5개의 대립유전자에 대한 AGG 상태를 긍정적으로 결정할 수 없다. 이 대립유전자를 표 4에서 "**"로 지정하였다(샘플 6 내의 42개의 CGG 대립유전자; 샘플 20 내의 54개의 CGG, 90개의 CGG 및 200개 초과의 CGG 대립유전자; 샘플 27 내의 200개 초과의 CGG 대립유전자). 이 대립유전자에 대한 CGG 반복부 수 및 AGG 상태를 분해하기 위해 본 발명의 추가 분석 방법(도 8)을 이용하였다.
PCR 생성물의 CE 분석은 2개의 샘플(20 및 27)이 정상 대립유전자 중 1개에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖는다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 샘플 20에서, AGG 트리뉴클레오타이드는 29개의 CGG 대립유전자에서 10번 및 20번 위치에 존재하였다. 3' 말단으로부터 먼 약 100개 초과의 뉴클레오타이드인 AGG 딥은 낮은 피크 강도로 인해 검출하기 어려울 수 있으므로, 동일한 정확한 위치(10번, 20번)에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖는 다른 대립유전자(예를 들면, 200개 초과의 CGG)가 CGG 반복부 프라이밍 분석(도 4, 8A)에 의해 검출되지 않을 수 있다. 또한, 이러한 상황에서, CGG 반복부 영역의 5' 말단에 대한 AGG 위치가 대립유전자 둘 다에서 동일한 경우, 고정 dT 분석(도 8h)은 더 짧은 대립유전자에 대한 피크와 동일한 피크를 생성시킬 것이다. 샘플 27은 30개의 CGG 대립유전자에 대해 AGG 트리뉴클레오타이드가 11번 및 21번 위치에서 확인되지만, 200개 초과의 CGG 대립유전자에서의 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재가 명확하게 결정될 수 없는 유사한 상황을 나타낸다.
이러한 논점을 해결하기 위해, 다른 반사 분석(도 8c)을 설계하였다. 원칙 실험의 증거로서, 30개의 CGG 반복부(NA07174), 645개의 CGG 반복부(NA04025) 및 30/645개의 CGG 반복부(50% NA07174 및 50% NA04025)를 갖는 3개의 인공 게놈 DNA 주형(Coriell Institute for Medical Research; Camden, NJ, USA)을 분석하였다. CCG 반복부 프라이밍 분석(도 8c)을 프라이머 FMR1_F_FAM, FMR1_R_(CCG)5 및 FMR1_R(서열 번호 14, 43, 37)에 의해 역방향으로 수행하였다. 도 15 패널 A는 30개의 CGG 대립유전자(NA07174)로부터 얻은 CE 전기영동도를 보여준다. 10번 위치에서 1개 및 20번 위치에서 1개인 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 관찰되었다. 도 15 패널 B는 645개의 CGG 대립유전자(NA04025)에서 AGG 트리뉴클레오타이드가 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 30/645개의 대립유전자 암컷 샘플을 모방하도록 이 2개의 대립유전자를 갖는 염색체 샘플을 조합할 때, 2개의 AGG 딥이 관찰되었지만 신호가 기준선으로 감소되지 않았다(도 15, 패널 C). 이 결과는 30개의 CGG 대립유전자가 10번 및 20번 위치에서 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖지만, 645개의 CGG 대립유전자가 이 위치에서 어떠한 AGG 인터럽터도 포함하지 않는다는 것을 확인시켜 주었다. 따라서, 이 PCR 분석은 긴 반복부, 예컨대 645개의 CGG 대립유전자의 5' 말단의 정보를 얻어, AGG 인터럽터의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
이 분석을 이용하여 200개 초과의 CGG 반복부를 포함하는 완전 돌연변이 대립유전자를 갖는 임상 샘플 20 및 27을 분석하였다(표 4). 도 16은 샘플 20에 대한 결과를 보여준다. 도 16 패널 A는 정방향인 반복부 프라이머에 의한 표준 CGG 프라이밍 분석(도 8a)에 의한 증폭 후 PCR 생성물의 CE 전기영동도를 보여준다. 2개의 AGG가 (CGG 반복부의 3' 말단으로부터 계수하여) 10번 및 20번 위치에서 관찰되었다. 단상형 발생 정도에 기초하여, AGG는 CGG 반복부 영역의 5' 말단으로부터 계수하여 10번, 11번, 20번 및 21번 위치에 정상적으로 위치하였다. 예를 들면, 문헌[Zhong et al., Am. J. Hum. Genet. 57:351-61 (1995); Kunst et al., Am. J. Hum. Genet. 58:513-22 (1996); Eichler et al., Hum. Mol. Genet. 4:2199-208 (1995)]을 참조한다. 따라서, 단상형 발생 정도는 AGG 인터럽터가 29개의 CGG 대립유전자 내에 존재한다는 것을 제시한다. 도 16 패널 B는 역방향인 2개의 프라이머 고정 dT 분석을 이용하는 동일한 샘플의 증폭 후 PCR 생성물의 CE 전기영동도를 보여준다(도 8h). 이 결과는 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 CGG 반복부 영역의 5' 말단으로부터 계수하여 10번 및 20번 위치에 위치한다는 것을 확인시켜 주었다. 도 16, 패널 A 및 패널 B에서의 결과의 분석은 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 29개의 CGG 대립유전자 내에 위치하지만, 이에 따라 CGG 반복부 영역은 서열 (CGG)9(AGG)(CGG)9AGG(CGG)9(서열 번호 57)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이 샘플에 대해 남은 불확실성은 완전 돌연변이 대립유전자(200개 초과의 CGG)가 5' 말단으로부터 동일한 위치(10번, 20번)에 AGG 트리뉴클레오타이드를 가질 수 있다는 것이다. 만일 그렇다면, 이 AGG 서열은 역방향인 고정 T 분석에 의해 검출할 수 없고 (정방향 프라이머에 대한 전체 거리 및 맵핑 5' 서열 요소에 대해 관찰된 신호 강도에서의 상응하는 감소로 인해) 짧은 대립유전자에서 AGG로부터 구별할 수 없다. 따라서, 역방향으로 CCG 반복부 프라이머를 갖는 3개의 프라이머 PCR 분석인 도 8d에 도시된 PCR 분석을 이용하여 이러한 논점을 해결하였다. 분석 결과(도 16 패널 C)는 신호가 CGG 반복부의 5' 말단으로부터 10번 위치에서 기준선으로 거의 완전히 떨어지므로 200개 초과의 CGG 대립유전자가 그 위치에 1개의 AGG를 갖는다는 것을 확인시켜 주었다. 따라서, 29개의 CGG 대립유전자 및 200개의 CGG 대립유전자 둘 다 10번 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖는다. 그 위치에서의 신호가 기준선 근처로 감소되지 않으므로(도 16 패널 C) 완전 돌연변이 대립유전자(200개 초과의 CGG)의 20번 위치에서 AGG가 존재하지 않았다.
논의
이러한 분석은 완전 돌연변이 대립유전자 내에 AGG 트리뉴클레오타이드의 존재를 입증한다. 이것이 AGG 인터럽터가 완전 돌연변이 대립유전자 내에 존재하지 않는 분야에서 다수의 전문가의 확립된 위치와 반대된다고 생각된다. 또한, 본 발명의 방법 및 분석은 CGG 반복부 영역의 5' 말단 근처의 AGG 트리뉴클레오타이드 인터럽터를 검출할 수 있다.
실시예 8: 샘플 27에서의 인터럽터 요소의 맵핑
도 17은 AGG 맵핑 결과가 샘플 27에서 얻어진다는 것을 보여준다(표 4). 도 17 패널 A는 정방향에서의 표준 CGG 프라이밍 분석에 의한 증폭 후 CE 전기영동도(도 8a)를 보여주고, 이것은 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 존재한다는 것을 입증한다. CGG 피크 패턴은 (CGG 반복부의 3' 말단으로부터) 10번 위치에서 1개 및 20번 위치에서 1개인 2개의 AGG를 나타냈다. 통상의 단상형의 지식에 기초하여, CGG 반복부의 AGG 차단은 CGG 반복부의 5' 말단으로부터 계수하여 10번, 11번, 20번 및/또는 21번 위치에 특징적으로 위치하고, 이것은 AGG 반복부가 이 샘플에서 30개의 CGG 대립유전자 내에 존재한다는 것을 제시한다. 도 17 패널 B은 역방향인 2개의 프라이머, 고정 dT PCR 분석의 결과를 제시한다(도 8h). 이 분석은 2개의 AGG 트리뉴클레오타이드가 CGG 반복부의 5' 말단으로부터 계수하여 11번 및 21번 위치에 존재한다는 것을 확인시켜 주었다 - (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9(서열 번호 46). 이 샘플에서 남은 불확실성은 완전 돌연변이 대립유전자(200개 초과의 CGG)가 30개의 CGG 반복부 대립유전자 내에서와 동일한 위치에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 가질 수 있다는 것이다. 도 17 패널 C는 역방향인 3개의 프라이머 CCG 프라이밍 PCR 분석의 결과를 제시한다(도 8d). 이 분석은 AGG 딥이 11번 또는 21번의 2의 위치에서 기준선 근처로 감소되지 않으므로 200개 초과의 CGG 대립유전자가 11번 또는 21번의 어떤 위치에서도 AGG를 갖지 않는다는 것을 확인시켜 주었다.
실시예 9: 정방향 고정 A PCR 분석을 이용한 모자이크 샘플에서의 낮은 풍부도 대립유전자에 대한 AGG 위치의 분해
표 4에서의 몇몇 샘플로부터 얻은 염색체 DNA의 분석은 샘플 6 및 샘플 20에서 낮은 풍부도 대립유전자의 존재를 나타낸다. 이것은 이 샘플 내에 존재하는 세포의 모자이크 집단으로부터 유도되는 대립유전자인 것으로 생각된다. 본 발명의 정방향 dA PCR 분석(도 8f)은 이 부대립유전자의 서열에서 AGG 트리뉴클레오타이드를 검출하는 데 충분히 민감하다. 샘플 6 및 샘플 20에 대한 2개의 프라이머 고정 dA 분석에 대한 결과를 도 18에 도시하였다. 도 8f에 도시된 PCR 분석을 이용한 샘플 6으로부터의 염색체 DNA의 증폭 및 PCR 생성물의 후속 CE 분석은 15개, 25개, 48개 및 56의개 CGG 반복부의 길이를 갖는 4개의 메이저 피크 및 30개 및 38개의 CGG 반복부의 길이를 갖는 2개의 마이너 피크를 나타냈다(도 18 패널 A). 이 길이는 프라이머 내의 5개의 CGG 반복부, AGG 인터럽터 및 AGG 인터럽터 사이의 반복부 수 및 CGG 반복부 영역의 3' 말단을 포함하였다. 4개의 메이저 피크는 2개의 주대립유전자에 대한 AGG 위치를 확인시켜 주었다(29개의 CGG 대립유전자에 대해 10번 및 20번 위치 및 60개의 CGG 대립유전자에 대해 10번 및 18번 위치 - 모두 CGG 반복부의 5' 말단으로부터 계수). 2개의 마이너 피크는 부대립유전자(42개의 CGG)가 (CGG 반복부의 5' 말단으로부터) 10번 위치에 1개 및 18번 위치에 1개인 2개의 AGG를 갖는다를 것을 확인시켜 주었다. 42개의 CGG 및 60개의 CGG 대립유전자 둘 다 5' 말단으로부터 10번 및 18번 위치 AGG 트리뉴클레오타이드를 갖지만, 고정 dA 분석이 정방향으로 위치하므로, 존재할 수 있는 임의의 AGG(예를 들면, 42개의 대립유전자에 대해 24개 및 60개의 CGG 대립유전자에 대해 42개)에 대해 3' 말단으로부터 계수된 CGG 반복부의 수에 의해 고정 dA 프라이머 PCR 앰플리콘의 크기를 결정하였다. 이 PCR 생성물은 CE(30개, 38개 대 48개, 56개 반복부 단위)에 의해 훌륭히 분리되었다.
도 8f에 도시된 PCR 분석을 이용한 샘플 20으로부터 얻은 염색체 DNA의 증폭 및 PCR 생성물의 후속 CE 분석은 (도 16에 도시된 데이터에 기초하여 29개의 CGG 대립유전자로 이미 배정된) 주대립유전자에 대한 2개의 1차 피크(도 18B)를 나타냈다. 그러나, 이 분석은 또한 50번 CGG 및 86번 CGG 위치에서의 2개의 부대립유전자 피크를 나타냈고, 이것은 이 2개의 부대립유전자 내에 2개의 AGG가 5' 말단으로부터 계수할 때 둘 다 10번 위치(즉, 3' 말단으로부터 계수한다면 45번 및 81번 위치)에 있다는 것을 나타낸다.
결론으로, 상기 기재된 4개의 분석의 적절한 조합은 표 4에 도시된 29개의 임상 샘플의 각각의 대립유전자의 CGG 반복부 영역 내의 AGG 트리뉴클레오타이드 인터럽터의 맵핑이 가능하게 한다.
실시예 10: 샘플 작업 흐름
본 발명의 방법을 이용한 AGG 맵핑 및 CGG 계수 작업 흐름의 한 예는 도 19에 도시되어 있고, 도 8에 도시된 분석 포맷 중 몇몇을 조합한다. 본원에 도시된 작업 흐름은 단지 하나의 예이다. 분석이란 단어 지칭은 도 8a 내지 도 8h에 도시된 것을 의미한다. 이러한 작업 흐름에서 이용되는 몇몇 분석은 샘플 목적을 성취하기 위한 다른 분석 포맷으로 대체할 수 있다.
명세서 내의 실시양태는 본 발명의 실시양태의 예시를 제공하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 용이하게 많은 다른 실시양태가 본 발명에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 본 공개내용에서 인용된 모든 공보 및 특허는 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 참조문헌으로 포함된 자료가 본 명세서와 모순 또는 불일치되는 정도에서, 명세서는 어떠한 이러한 자료에 대신한다. 본원에서의 어떠한 참조문헌의 인용은 그 참조문헌이 본 발명에 대한 선행 기술이라는 인정이 아니다.
달리 기재되지 않은 한, 특허청구범위를 비롯하여 명세서에서 사용되는 성분 분량, 반응 조건 및 기타 등등을 나타내는 모든 수는 "약"이란 용어에 의해 모든 경우에 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 기재되지 않은 한, 수 매개변수는 근사치이고 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 최소한으로, 그리고 특허청구범위에 대한 등가물의 원칙의 적용을 제한하고자 하는 시도가 아닌 것으로, 각각의 수 매개변수는 상당한 숫자의 수 및 보통의 일상적인 접근법의 견지에서 해석되어야 한다.
달리 기재되지 않은 한, 요소의 세트의 앞의 "적어도"란 용어는 세트에서의 모든 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정한 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 이를 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 특허청구범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
다수의 증폭(예를 들면, PCR) 반응을 포함하는 방법이 특허청구범위에 기재된 경우, 반응을 "제1", "제2" 등으로 언급하는 것은 반응이 수행되는 시간순을 의미하지 하지 않고, 이 청구항은 기재된 반응이 "제1" 반응 전에, 동일한 시간에 또는 후에 예를 들면 "제2" 반응을 수행하는 것을 포함하여 임의의 순서로 또는 동시에 수행되는 방법을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Latham, Gary J. Chen, Liangjing Sah, Sachin <120> PCR METHODS FOR CHARACTERIZING THE 5' UNTRANSLATED REGION OF THE FMR1 AND FMR2 GENES <130> 10256.0031-00000 <150> US 61/162,977 <151> 2009-03-24 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggtggaggg ccgcctctga gc 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 caggcgctca gctccgtttc ggttt 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagtcaggcg ctcagctccg tttcg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccggtggag ggccgcctct gagc 24 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggttcggcct cagtcaggcg ctcagctccg tttcg 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggttcggcc tcagtcaggc gctcagctcc gtttcg 36 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcgggccggg ggttcggcct cagtca 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cagcgggccg ggggttcggc ctcag 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcagcgggcc gggggttcgg cctca 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gggccggggg ttcggcctca gtcag 25 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggggttcggc ctcagtcagg cgctca 26 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggggttcggc ctcagtcagg cgctcag 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggcgctcagc tccgtttcgg tttcacttcc 30 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcaggcgctc agctccgttt cggtttca 28 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cacttccggt ggagggccgc ctctga 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ttccggtgga gggccgcctc tgagc 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgcacttcca ccaccagctc ctcca 25 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggagcccgcc cccgagaggt g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gggagcccgc ccccgagagg t 21 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgcacttcca ccaccagctc ctccat 26 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgggagcccg cccccgagag gtg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccgggagccc gcccccgaga ggt 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccgggagccc gcccccgaga ggtg 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgccgggagc ccgcccccga gaggtg 26 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcgccgggag cccgcccccg agaggt 26 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cgccgggagc ccgcccccga gaggt 25 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcgccattgg agccccgcac ttccacca 28 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcgccattgg agccccgcac ttcca 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agcgccattg gagccccgca cttcc 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cgccattgga gccccgcact tccac 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ttggagcccc gcacttccac cacca 25 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agccccgcac ttccaccacc agctcctc 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gagccccgca cttccaccac cagctcct 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cattggagcc ccgcacttcc accaccag 28 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 cccgcacttc caccaccagc tcctccatct 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tagaaagcgc cattggagcc ccgcacttcc 30 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aagcgccatt ggagccccgc acttcc 26 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tcaggcgctc agctccgttt cggtttcact tccggt 36 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 agcgtctact gtctcggcac ttgcccgccg ccgccg 36 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tcaggcgctc agctccgttt cggtttca 28 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tcaggcgctc agctccgttt cggtttcacg gcggcggcgg cgg 43 <210> 42 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 90 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 aagcgccatt ggagccccgc acttccccgc cgccgccgcc g 41 <210> 44 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> primer <400> 44 tcaggcgctc agctccgttt cggtttcacg gcggcggcgg cgga 44 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 aagcgccatt ggagccccgc acttccccgc cgccgccgcc t 41 <210> 46 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 90 <210> 47 <211> 141 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg g 141 <210> 48 <211> 183 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cgg 183 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 <210> 50 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cgg 93 <210> 51 <211> 138 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcgg 138 <210> 52 <211> 291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 291 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 <210> 54 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cgg 93 <210> 55 <211> 138 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcgg 138 <210> 56 <211> 291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 291 <210> 57 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcgg 87 <210> 58 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcgg 126 <210> 59 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 <210> 60 <211> 162 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc gg 162 <210> 61 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 270 <210> 62 <211> 111 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gaggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 111 <210> 63 <211> 171 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 171 <210> 64 <211> 234 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcgg 234 <210> 65 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 300 <210> 66 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 300 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 360 cggcgg 366 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 <210> 68 <211> 138 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcgg 138 <210> 69 <211> 291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 291 <210> 70 <211> 138 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggagg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcgg 138 <210> 71 <211> 291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 60 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 120 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 180 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg aggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 240 cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg g 291

Claims (72)

  1. (a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 제1 프라이머, 및 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머를 포함하는 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
    (b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 1 이상의 CGG 풍부 영역을 포함하는 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
    (c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션(representation)을 얻는 단계; 및
    (d) 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열(interruptor sequence)이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
  2. (a) CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하는 제1 프라이머, CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는 제2 프라이머 및 제1 프라이머의 5' 플랩에 포함되는 서열을 갖는 제3 프라이머를 포함하는 3개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
    (b) 3개 이상의 상이한 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
    (c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계; 및
    (d) 상기 리프리젠테이션으로부터 1 이상의 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 1 이상의 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인터럽터 서열이 AGG 요소인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역이 200개 초과 또는 미만의 CGG 반복부를 포함하는지를 결정하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역 내에 존재하는 CGG 반복부 수를 결정하는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 데 있어서 외부 표준 또는 캘리브레이터를 사용하지 않는 것을 조건으로 하는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR1의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR2의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고분해능 기법은 3개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍만큼 길이가 다른 생성물을 분해할 수 있는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고분해능 기법은 모세관 전기영동인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 전기영동도인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 제1 프라이머의 결합이 실질적으로 감소된 위치를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 실질적으로 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 50% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 90% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 풍부 영역 내에 인터럽터 서열이 존재하는지 또는 CGG 풍부 영역 내 어디에 인터럽터 서열이 위치하는지에 대한 정보를 얻는 것은 생성물의 양이 인접한 길이 생성물의 양과 비교하여 25% 이상 감소된 1 이상의 생성물 길이를 결정하는 것을 포함하고, CGG 풍부 영역은 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자에 대해 이형접합성인 개체 유래인 것인 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 프라이머는 4개 또는 5개의 CGG 또는 CCG 반복부를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 프라이머는 서열 번호 1-38로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 방사선적 방법으로 또는 전자기적 방법으로 검출 가능한 부분을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 형광단을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고정 분석(anchored assay)인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 내 또는 이의 3' 말단에 A, T, AG, CT, AGG 및 CCT로부터 선택되는 부분서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 A를 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 제1 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 CCT를 포함하는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 1 이상의 CGG 풍부 영역에 포함되는 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 샘플이 다르게 위치하는 인터럽터 요소를 갖는 주대립유전자(major allele) 및 부대립유전자(minor allele)를 포함하는지를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비고정 분석인 방법.
  30. 제2항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 100배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  31. 제2항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 500배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  32. 제2항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 900배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  33. 제2항에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하는 것인 방법.
  34. 제2항에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하는 것인 방법.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 제1 추가 프라이머 및 임의로 제2 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제1 추가 프라이머, 단계(a)의 제2 프라이머 및 제2 추가 프라이머로부터 선택된 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제2 PCR을 수행하여 제2 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제2 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제2 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
    단계(a)의 제1 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖고, 제1 추가 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 A를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부의 3' 말단에 T를 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 1 이상의 CGG 풍부 영역의 1 이상의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 샘플은 CGG 영역에 대해 2 이상의 배수성을 갖는 세포로부터의 유전자 물질을 포함하고, 이 방법은 2 이상의 CGG 풍부 영역의 2 이상의 길이를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 샘플은 100개 이상의 CGG 반복부를 포함하는 CGG 풍부 영역을 포함하는 대립유전자를 포함하는 것인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 샘플이 다르게 위치하는 인터럽터 요소를 갖는 주대립유전자 및 부대립유전자를 포함하는지를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제35항에 있어서, 제1 추가 프라이머는 제1 프라이머에 대하여 반대 방향인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 제1 프라이머는 3' 말단이 하류로 향하도록 CGG 풍부 영역에 결합하고, 제1 추가 프라이머는 3' 말단이 상류로 향하도록 CGG 풍부 영역에 결합하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것 및 1 이상의 인터럽터 요소를 포함하는 CGG 풍부 영역의 크기를 결정하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 샘플은 적어도 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자를 포함하고, 제1 대립유전자 및 제2 대립유전자는 길이가 다른 CGG 풍부 영역을 포함하는 것인 방법.
  46. 제35항에 있어서, 적어도 제3 추가 프라이머 및 임의로 제4 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제3 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제3 추가 프라이머, 제2 추가 프라이머 및 제4 추가 프라이머로부터 선택된 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제3 PCR을 수행하여 제3 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제3 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제3 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
    제3 추가 프라이머는 단계(a)의 제1 프라이머에 대하여 반대 방향이고 제1 추가 프라이머와 상이한 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 샘플에 포함되는 1개 이상의 대립유전자의 어느 한쪽 말단의 150 bp 내에서의 인터럽터 요소의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 1개 이상의 대립유전자에 포함되는 1 이상의 인터럽터 요소의 1 이상의 위치를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  49. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 제1 추가 프라이머 및 제2 추가 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 추가 프라이머는 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하는 것인 단계; 적어도 제1 추가 프라이머 및 제2 추가 프라이머 및 1개 이상의 주형으로 제2 PCR을 수행하여 제2 생성물 세트를 생성하는 단계; 및 제2 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 제2 리프리젠테이션을 얻는 단계를 추가로 포함하고;
    제1 추가 프라이머는 단계(a)의 제1 프라이머에 대하여 반대 방향인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 제1 프라이머 및 제1 추가 프라이머 중 1개 이상은 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하지 않는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖고, 제1 추가 프라이머는 CGG 풍부 영역 내의 인터럽터 요소를 포함하는 위치에 대해 우선적 결합 활성을 갖는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 샘플은 길이가 다른 CGG 풍부 영역을 포함하는 2개 이상의 대립유전자를 포함하고, 이 방법은 2개 이상의 대립유전자의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 1 이상의 인터럽터 요소를 검출하는 것 및 1 이상의 인터럽터 요소가 포함되는 대립유전자의 길이를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. (a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부를 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하는, 2개 이상의 상이한 프라이머를 제공하는 단계;
    (b) 2개 이상의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
    (c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계로서, 3개 뉴클레오타이드만큼 길이가 다른 생성물이 분해되는 것인 단계; 및
    (d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
  55. (a) 제1 프라이머가 CGG, CCG, GCG, CGC, GCC 또는 GGC 반복부 및 5' 플랩을 포함하고, 제2 프라이머가 CGG 풍부 영역 외부의 위치에 어닐링하며, 제3 프라이머가 제1 프라이머의 5' 플랩의 동일한 서열을 갖는, 3개의 상이한 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머가 제3 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계;
    (b) 3개의 상이한 프라이머 및 CGG 풍부 영역을 포함하는 주형으로 PCR을 수행하여 생성물 세트를 생성하는 단계;
    (c) 생성물 세트를 고분해능 기법으로 분해하여 생성물 크기 및 풍부도의 리프리젠테이션을 얻는 단계로서, 3개 뉴클레오타이드만큼 길이가 다른 생성물이 분해되는 것인 단계; 및
    (d) 상기 리프리젠테이션으로부터 CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 단계
    를 포함하는, 샘플 내의 1개 이상의 주형에 포함되는 1 이상의 CGG 풍부 영역을 분석하는 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 CGG 반복부 수에 대한 정보는 CGG 풍부 영역이 200개 초과 또는 미만의 CGG 반복부를 포함하는지를 결정하는 것인 방법
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 정보는 CGG 풍부 영역 내에 존재하는 CGG 반복부 수를 결정하는 것인 방법.
  58. 제54항 또는 제55항에 있어서, CGG 반복부 수에 대한 정보를 얻는 데 있어서 외부 표준 또는 캘리브레이터를 사용하지 않는 것을 조건으로 하는 것인 방법.
  59. 제54항 또는 제55항에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR1의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
  60. 제54항 또는 제55항에 있어서, CGG 풍부 영역이 FMR2의 5' UTR에 포함되는 것인 방법.
  61. 제54항 또는 제55항에 있어서, 고분해능 기법은 3개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍만큼 길이가 다른 생성물을 분해할 수 있는 것인 방법.
  62. 제54항 또는 제55항에 있어서, 고분해능 기법은 모세관 전기영동인 방법.
  63. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 리프리젠테이션은 전기영동도인 방법.
  64. 제54항 또는 제55항에 있어서, 제1 프라이머는 4개 또는 5개의 CGG 또는 CCG 반복부를 포함하는 것인 방법.
  65. 제54항 또는 제55항에 있어서, 제2 프라이머는 서열 번호 1-38로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제54항 또는 제55항에 있어서, 프라이머 중 1개 이상은 형광단을 포함하는 것인 방법.
  67. 제55항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 100배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  68. 제55항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 500배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  69. 제55항에 있어서, 제3 프라이머가 제1 프라이머보다 몰농도로 900배 이상 풍부한 농도가 되도록 제1 프라이머 및 제3 프라이머를 제공하는 것인 방법.
  70. 제55항에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하는 것인 방법.
  71. 제55항에 있어서, 제2 프라이머는 CGG 풍부 영역의 상류에 어닐링하고, 제3 프라이머는 CGG 풍부 영역의 하류에 어닐링하는 것인 방법.
  72. 서열 번호 44 및 서열 번호 45로부터 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
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