ES2629400T3 - Métodos de PCR para caracterizar la región 5' no traducida de los genes FMR1 y FMR2 - Google Patents

Métodos de PCR para caracterizar la región 5' no traducida de los genes FMR1 y FMR2 Download PDF

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Abstract

Un método para analizar si una secuencia interruptor está presente en al menos una región rica en CGG comprendida por al menos un molde en una muestra, que comprende: a) proporcionar al menos dos iniciadores diferentes, incluyendo un primer iniciador que comprende repeticiones CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC, y un segundo iniciador que se hibrida a una posición fuera de la región rica en CGG; b) realizar la PCR con al menos dos iniciadores diferentes y al menos un molde que comprende al menos una región rica en CGG, en donde la PCR produce un conjunto de productos; c) resolver el conjunto de productos con una técnica de alta resolución para producir una representación del tamaño y la abundancia del producto; y d) derivar la información acerca de si una secuencia de interruptor está presente en al menos una región rica en CGG o dónde al menos dentro de una región rica en CGG se encuentra una secuencia de interruptor a partir de dicha representación.

Description

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DESCRIPCION
Metodos de PCR para caracterizar la region 5' no traducida de los genes FMR1 y FMR2 Campo de la invencion
Esta invencion se encuentra en los campos de la smtesis y analisis de ADN, particularmente, con relacion a los moldes y productos ricos en GC.
Descripcion General
Desde el primer aislamiento de una ADN polimerasa y la determinacion de las condiciones bajo las que el ADN puede sintetizarse in vitro, las reacciones de smtesis de ADN se han usado ampliamente para propositos preparativos y analtticos en aplicaciones biotecnologicas, medicas y de investigacion. La reaccion en cadena de la polimerasa, o PCR, es un tipo de reaccion de smtesis de ADN mediante la cual una secuencia de ADN puede amplificarse rapida y exponencialmente. Al igual que otras reacciones de smtesis en ciclos, implica copiar repetidamente la secuencia objetivo de una manera dclica. Una implementacion tfpica de PCR implica proporcionar iniciadores complementarios a los extremos de la secuencia a amplificar, un regulador adecuado, una sal de magnesio, trifosfatos de desoxinucleotidos (dNTP) y una ADN polimerasa termofflica. El molde o ADN objetivo contenido, por ejemplo, dentro de una muestra de ADN genomico, se expone a estos componentes en solucion acuosa. La mezcla se somete a ciclos a traves de etapas a diferentes temperaturas que favorecen la desnaturalizacion del molde, hibridacion de los iniciadores al molde, y despues la extension de los iniciadores por la polimerasa, creando un producto mayor. Como el producto de cada ciclo esta disponible como molde en las reacciones posteriores, la cantidad de producto aumenta exponencialmente hasta aproximadamente que se agotan otros componentes de la reaccion (inicialmente presentes en exceso). Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos num. 4.683.202; M. J. McPherson & S. G. Moller, PCR: The Basics (2da Ed., Taylor & Francis) (2006).
La PCR, junto con otras formas de reacciones de smtesis de acidos nucleicos en ciclos, es una herramienta estandar en biologfa molecular, biotecnologfa y, cada vez mas, en medicina. Las ventajas claves de la PCR y las tecnicas relacionadas son la rapidez, bajo costo, sensibilidad, facilidad para el analisis de alto rendimiento y versatilidad. Las amplificaciones requieren solo unas pocas horas o menos, pequenas reacciones individuales pueden consumir mucho menos que el valor de un dolar americano en reactivos, la cantidad de molde requerida esta tfpicamente en el intervalo de nanogramos, la automatizacion puede resultar en miles de corridas de reacciones por dfa por robotica, y los iniciadores pueden disenarse para amplificar casi cualquier secuencia.
La PCR y tecnicas relacionadas se adoptan ampliamente tanto para aplicaciones analfticas como preparativas. Una aplicacion preparativa tfpica de PCR es amplificar una secuencia de manera que pueda clonarse en un vector heterologo. Las aplicaciones analfticas notables de la PCR incluyen diagnosticos de afecciones o determinaciones de genotipos que implican los loci geneticos con polimorfismos de tamano.
Un ejemplo de un locus que exhibe un polimorfismo de tamano relevante desde el punto de vista medico es la region 5' no traducida (UTR) del gen FMR1 humano en el cromosoma X. Los individuos normales tfpicamente tienen 5-44 repeticiones de CGG en esta region. Por el contrario, los alelos de este locus que contienen 200 a 2000 o mas repeticiones de CGG son indicativos del smdrome de X fragil (FXS). Tales alelos se denominan alelos de mutacion completa. Estos alelos son geneticamente inestables. Los individuos con FXS pueden tener varias combinaciones de smtomas tales como ataxia, fallo ovarico prematuro, problemas de aprendizaje y otras afecciones cognitivas/conductuales, que incluyen smtomas similares al autismo.
Una desafortunada excepcion a la versatilidad de la PCR se encuentra en la dificultad de amplificar largas corridas de secuencias altamente ricas en GC, que incluyen los alelos de mutacion completa de 5' UTR de FMR1. Los intentos de optimizar la PCR de FMR1 han incluido modificaciones a las condiciones convencionales del ensayo de PCR. Ver Genome Res. 6(7):633-8 (1996); Nucleic Acids Res. 25(19):3957-8 (1997); J. Mol. Diagn 8:544-550 (2006); Am. J. Med. Genet. 5l(4):527-34 (1994). Despues, mas aun de l5 anos del desarrollo del ensayo de PCR de FMR1, un estudio de tamizaje piloto publicado tan solo en 2008 (Genet. Med. 10(10):714-9 (2008)) para detectar X Fragil en los recien nacidos reporto que "dos metodos de analisis de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativo... usados en el proceso interno de validacion para determinar el numero de repeticion de FMR1 en las mujeres fracaso para producir resultados fiables y reproducibles" , (enfasis anadido), y, ademas, que "un segundo fracaso [PCR] ya sea de aislamiento primario o secundario fue altamente sugerente de un FMR1 de tamano anormal de repeticiones de CGG." Asf, los expertos en la tecnica siguen considerando la amplificacion por PCR reproducible de los alelos de X fragil de mutacion completa como un problema no resuelto.
Se ha observado que la deteccion de las regiones de repeticion de tripletes CGG que contienen mas de aproximadamente 100 repeticiones por PCR se hace progresivamente mas debil con el aumento del numero de repeticion. J. Mol. Diagn. 7:605-12 (2005). Esta dificultad, combinada con la naturaleza heterogenea de los smtomas de FXS, ha contribuido al uso de procedimientos tales como la transferencia de Southern para detectar los alelos de
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mutacion completa. Id. La transferencia de Southern es generalmente costosa y lleva mucho tiempo, y es mucho menos facil para implementaciones de alto rendimiento, que la PCR.
Una publicacion reciente de Tassone y otros. (J. Mol. Diagn. 10:43-49 (2008); "Tassone 2008") describe un ensayo para probar la presencia de alelos CGG mas largos sin amplificacion de longitud completa del alelo. Ver ademas el documento de patente num.WO2008/011170. El metodo utiliza un iniciador quimerico de PCR que se hibrida con sitios dentro de la region CGG expandida, de manera que la presencia de una amplia mancha de productos de PCR representa un resultado positivo para un alelo expandido. Id. en 46.
La estrategia de hibridacion aleatoria puede resultar en la amplificacion no espedfica y la perdida de resolucion. Las condiciones basicas de la PCR usadas en este documento se han probado ampliamente en muchos laboratorios diferentes y parece que el numero maximo de repeticiones de CGG que pueden amplificarse con exito es de aproximadamente 350 repeticiones de CGG. Ver, por ejemplo, Saluto y otros, J. Mol. Diagn. 7:605-612 (2005). La amplificacion no espedfica es evidente en Tassone 2008. La mancha en el gel de agarosa que se muestra por Tassone 2008 como la Figura 1 parece que contiene productos mas largos que la longitud maxima esperada de 350 repeticiones que contienen los amplicones y, asf puede ser que muchas de las manchas no representan productos espedficos de repeticiones de CGG (ver Figura 1 de Tassone 2008; la mancha en el carril 5 parece extenderse hasta la proximidad del pocillo de carga). Tassone y otros indican en la leyenda de la Figura 3 que usaron un patron Alto-Bajo (Bionexus, Oakland, CA) como marcador de peso molecular, y el marcador en la Figura 1 parece ser el mismo que en la Figura 3. La banda mas grande del patron Alto-Bajo es de aproximadamente 10 kb, y la mancha de la Figura 1 se extiende por encima de esa banda. Esta longitud es ademas, mas larga que el producto de longitud completa esperado de la muestra usada en el ensayo. El tamano del alelo mas largo se enumera como 615 repeticiones de CGG. Por lo tanto, se espera que los productos de longitud completa sean de aproximadamente 2 kb, estimados mediante la adicion de aproximadamente 200 nt de secuencia flanqueante a 1845 nt de repeticiones. Los productos no espedficos pueden reducir tanto la precision como la confianza de las determinaciones basadas en la amplificacion con respecto al estado del alelo asociado al X fragil.
Ademas, algunos ensayos convencionales de PCR para la deteccion de un X Fragil basado en disenos de iniciadores puramente espedficos a genes, tienen limitaciones. Por ejemplo, tales ensayos proporcionan una estimacion del numero de repeticion CGG basado en la movilidad del amplicon de PCR. Para permitir la cuantificacion exacta del numero de repeticion, la movilidad del amplicon se mide generalmente con relacion a calibradores externos, por ejemplo, un conjunto de controles de tamano adecuado. Es conveniente permitir una cuantificacion precisa de CGG sin depender de calibradores externos.
Ademas, los alelos de FMR1 pueden contener secuencias AGG que se intercalan entre las repeticiones de CGG, normalmente en la region 5' del segmento repetido. El conocimiento de los elementos de la secuencia AGG caracteriza al alelo en un aspecto. Pueden usarse elementos de secuencia AGG en la toma de decisiones clmicas. Por ejemplo, los casos de expansion del alelo FMR1 de una madre a un alelo de mutacion completo en su hijo se han observado para un alelo con tan solo 59 repeticiones, y se conoce que este alelo carece de elementos AGG. Ver Nolin y otros, Am. J. Hum. Genet. 72:454-464 (2003). De hecho, las mutaciones completas rara vez parecen contener elementos AGG mas alla de las primeras 20 repeticiones de CGG, y los estudios bioffsicos han sugerido que los moldes con secuencias AGG "de interrupcion" entre el segmento de repeticion CGG son mas propensas a adoptar estructuras de ADN mas convencionales y son mas estable y mas susceptible de replicacion precisa. Ver, por ejemplo, Weisman-Shomer y otros, Nucleic Acids Res. 28:1535-41 (2000); Zhong y otros, Am. J. Med. Genet. 64:261-5 (1996); Larsen y otros, Am. J. Med. Genet. 93:99-106 (2000); y Dombrowski y otros, Hum. Mol. Genet. 11:371-78 (2002). Asf, existe una necesidad de una tecnologfa para mapear los elementos interruptores, tales como elementos AGG, dentro del gen FMR1. El mapeo de los elementos interruptores tiene por tanto, aplicaciones de investigacion y diagnostico relacionadas con el Smdrome del X Fragil y otras enfermedades de repeticion asociadas.
Los metodos existentes para mapear elementos AGG incluyen la secuenciacion y mapeo de restriccion. La tecnologfa de secuenciacion del ADN es relativamente laboriosa, particularmente porque generalmente requiere enriquecimiento o aislamiento (ya sea in vitro o in silico) de la secuencia de interes, y no se realiza rutinariamente en pruebas de diagnostico de X Fragil. Los ensayos basados en el mapeo de restriccion han usado la enzima Mn/l, que reconoce la secuencia GAGG y corta 7 pares de bases 5' a esa secuencia, para inferir las posiciones AGG, basadas en el tamano de los fragmentos resultantes de los productos de PCR digeridos que comprenden la region de repeticion CGG de la 5' UTR de FMR1. Ver, por ejemplo, Eichler y otros, Nat. Genet. 8:88-94 (1994); Zhong y otros, Am. J. Hum. Genet. 57:351361 (1995). El ensayo de Eichler y otros implico la amplificacion por PCR de la region de repeticion, purificacion de los productos, digestion durante toda la noche, electroforesis durante 7 horas y transferencia de tipo Southern. En el ensayo de Zhong y otros, "el producto de PCR se extrajo una vez con fenol/cloroformo, se precipito con etanol y se digirio parcialmente en 10 litros con 5 unidades de Mn/l a 37°C durante 50-70 min." Id. a 353. Esto se siguio por electroforesis y transferencia de tipo Southern. Ambos ensayos implicaron, multiples etapas que incluyen purificacion/limpieza, digestion por restriccion y transferencia de tipo Southern ademas de PCR y electroforesis. Chiu y otros, Journal of Genetics 87:275-277 (2008) reportan un estudio que evalua las repeticiones de CGG y el patron de interrupcion AGG del locus FMR1 entre la poblacion taiwanesa. Bodega y otros, Human Reproduction 21:952-957 (2006) reportan sobre expansiones de FMR1 en pacientes con manifestacion prematura de fallo ovarico.
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En la presente descripcion se proporcionan metodos para cuantificar las repeticiones de CGG e identificar, cuantificar y revelar el contexto secuencial de las secuencias de interrupcion en la 5' UTR de los genes FMR1 y FMR2. Las aplicaciones de los productos potenciales de la invencion incluyen aplicaciones clmicas para la prueba de X Fragil.
En algunas modalidades, la invencion se refiere a un metodo para analizar en una muestra si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG compuesta por al menos un molde, que comprende:
a) proporcionar al menos dos iniciadores diferentes, incluyendo un primer iniciador que comprende repeticiones CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC, y un segundo iniciador que se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG;
b) realizar la PCR con al menos dos iniciadores diferentes y al menos un molde que comprende al menos una region rica en CGG, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
d) obtener informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG o donde dentro de al menos una region rica en CGG se localiza una secuencia de interrupcion.
En algunas modalidades, la invencion se refiere a un metodo para analizar en una muestra si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG compuesta por al menos un molde, que comprende:
a) proporcionar al menos tres iniciadores diferentes, incluyendo un primer iniciador que comprende repeticiones CGG, CCG, GCG, CGC, GCC, o GGC y una solapa 5', un segundo iniciador que se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG y un tercer iniciador que tiene una secuencia comprendida por la solapa 5' del primer iniciador, en donde el primer iniciador se proporciona a una concentracion menor que el tercer iniciador;
b) realizar la PCR con al menos tres iniciadores diferentes y al menos un molde, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
d) obtener informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG o donde dentro de al menos una region rica en CGG se localiza una secuencia de interrupcion a partir de dicha representacion.
Ademas se describe en la presente descripcion un metodo para analizar en una muestra al menos una region rica en CGG comprendida por al menos un molde, que comprende:
a) proporcionar al menos dos iniciadores diferentes, en donde el primer iniciador comprende repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC y el segundo iniciador se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG;
b) realizar la PCR con al menos dos iniciadores diferentes y un molde que comprende la region rica en CGG, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
d) obtener la informacion acerca del numero de repeticion CGG de dicha representacion.
Ademas se describe en la presente descripcion un metodo para analizar en una muestra al menos una region rica en CGG comprendida por al menos un molde, que comprende:
a) proporcionar tres iniciadores diferentes, en donde el primer iniciador comprende repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC y un solapa 5', el segundo iniciador se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG, el tercer iniciador tiene la misma secuencia de solapa 5' del primer iniciador, y el primer iniciador se proporciona a una concentracion inferior que el tercer iniciador;
b) realizar la PCR con los tres iniciadores diferentes y un molde que comprende la region rica en CGG, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
d) obtener la informacion acerca del numero de repeticion CGG de dicha representacion.
Ademas se describe en la presente descripcion un oligonucleotido que comprende una secuencia seleccionada a partir de la sec. con num. de ident.: 44 y la sec. con num. de ident.: 45.
Se debe entender que la descripcion general anterior y la siguiente descripcion detallada son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invencion, segun se reivindica.
Descripcion detallada
La invencion se refiere a reacciones de amplificacion que amplifican toda o parte de una region de repeticion CGG. En algunas modalidades, la region de repeticion CGG esta compuesta por la 5' UTR de FMR1, o la 5' UTR de FMR2.
La invencion se refiere a reacciones de amplificacion que usan un iniciador que se hibrida fuera de una region de repeticion CGG y un iniciador que se hibrida a las secuencias de repeticion CGG, permutaciones de secuencia o
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complementos inversos de las secuencias (GCG, CCG, CGC, GCC, o GGC). Los iniciadores que pueden hibridar fuera de (corriente arriba o corriente abajo) de la region de repeticion CGG pueden ser iniciadores directos o inversos. Los iniciadores pueden hibridarse a secuencias que flanquean la region de repeticion CGG. Ejemplos de tales iniciadores directos incluyen CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (sec. con num. de ident.: 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (sec. con num. de ident.: 2), CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G (sec. con num. de ident.: 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC (sec. con num. de ident.: 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG (sec. con num. de ident.: 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG (sec. con num. de ident.: 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA (sec. con num. de ident.: 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G (sec. con num. de ident.: 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A (sec. con num. de ident.: 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (sec. con num. de ident.: 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (sec. con num. de ident.: 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (sec. con num. de ident.: 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC (sec. con num. de ident.: 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (sec. con num. de ident.: 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (sec. con num. de ident.: 15), TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (sec. con num. de ident.: 16), and TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACG GCG GCG GCG GCG GA (sec. con num. de ident.: 44). Ejemplos de tales iniciadores inversos incluyen CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A (sec. con num. de ident.: 17), GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (sec. con num. de ident.: 18), GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT (sec. con num. de ident.: 19), CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC AT (sec. con num. de ident.: 20), CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (sec. con num. de ident.: 21), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (sec. con num. de ident.: 22), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (sec. con num. de ident.: 23), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (sec. con num. de ident.: 24), GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (sec. con num. de ident.: 25), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T (sec. con num. de ident.: 26), GCG CCA TtG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A (sec. con num. de ident.: 27), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A (sec. con num. de ident.: 28), AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C (sec. con num. de ident.: 29), CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C (sec. con num. de ident.: 30), TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A (sec. con num. de ident.: 31), AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C (sec. con num. de ident.: 32), GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T (sec. con num. de ident.: 33), CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G (sec. con num. de ident.: 34), CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA TCT (sec. con num. de ident.: 35), TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC (sec. con num. de ident.: 36), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC (sec. con num. de ident.: 37), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CG (sec. con num. de ident.: 43), and AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CT (sec. con num. de ident.: 45).
La invencion se refiere ademas al uso y metodos que comprenden proporcionar los iniciadores TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT (sec. con num. de ident.: 38), AGCGTCTACTGTCTCGGCACT TGCCCGCCGCCGCCG (sec. con num. de ident.: 39), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (sec. con num. de ident.: 40), y TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA CGGCGGCGGCGGCGG (sec. con num. de ident.: 41). La invencion adicionalmente se refiere a iniciadores que comprenden la secuencia de cualquiera de las sec. con nums. de ident.: 1-38 o 40 con repeticiones de CGG o las permutaciones y complementos inversos de estas unidas al extremo 3'. La invencion se refiere ademas, al uso de y metodos que comprenden proporcionar un iniciador que contiene un numero de repeticiones trinucleotfdicas de la secuencia CGG o las permutaciones y complementos inversos de estas. En algunas modalidades, el numero de repeticiones de CGG en el iniciador es de cuatro o cinco. En algunas modalidades, el iniciador contiene 12-15 nucleotidos de secuencia de repeticion trinucleotidica. En algunas modalidades, el iniciador contiene un numero de repeticiones en el intervalo de 3 a 10. El iniciador puede contener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 repeticiones, y opcionalmente una repeticion parcial adicional de 1 o 2 residuos de C y/o G. Pueden proporcionarse iniciadores adicionales, por ejemplo, para asegurar la union en un sitio polimorfico, o para amplificar una region de tamano conocido que sirve como un control interno.
En algunas modalidades, el iniciador que se hibrida con secuencias de repeticion CGG tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica en CGG que comprende un elemento de interrupcion. La union preferencial del iniciador que se hibrida a las secuencias de repeticion CGG con al menos un sitio que comprende un elemento de interrupcion puede resultar en una amplificacion selectiva de al menos un producto que comprende el elemento de interrupcion, por ejemplo, usando el iniciador en una reaccion de PCR con un segundo iniciador de orientacion opuesta que se une fuera de la region rica en CGG, como se describio anteriormente. La actividad de union preferencial puede ser espedfica, por ejemplo, para los sitios que comprenden elementos CGG y AGG, o las permutaciones y/o complementos inversos de estos, tal como un sitio que comprende (1) un elemento AGG o una parte de un elemento AGG que comprende un A, y (2) tres, cuatro, cinco o seis elementos CGG y opcionalmente un elemento CGG parcial adicional.
El grado de union preferencial, expresado en terminos de una relacion de la abundancia de producto amplificado selectivamente a productos de fondo a partir de una reaccion de amplificacion usando el iniciador con un segundo iniciador de orientacion opuesta que se une fuera de la region rica en CGG, puede ser al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces o 6 veces, o puede variar de 3 veces a 12 veces, 3 veces a 10 veces, 3 veces a 8 veces, 4 veces a 12 veces, 4 veces a 10 veces, 4 veces a 8 veces, 3 veces a 7 veces, 4 veces a 7 veces, 3 veces a 6 veces o 4 veces a 6 veces. Al menos un producto amplificado selectivamente tiene generalmente una longitud correspondiente a la distancia a lo largo del molde desde el extremo 5' del primer iniciador, cuando se une preferentemente a un sitio que comprende un
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elemento de interrupcion, hasta el extremo 5' del segundo iniciador, cuando se unen a su sitio fuera de la region rica en CGG.
En algunas modalidades, el iniciador que se hibrida a secuencias de repeticion CGG y se une preferentemente a un sitio o sitios en la region rica en CGG que comprende un elemento de interrupcion puede comprender un residuo A, T o U dentro o al final de la parte del iniciador que se hibrida a secuencias de repeticion CGG, o en otras palabras, entre o en el extremo de las repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC; ver, por ejemplo, las sec. con nums. de ident.: 44 y 45 anteriormente. El residuo A, T o U puede producirse en el extremo 3' del iniciador. Cuando el residuo A, T o U se produce en el extremo de las repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, o GCC, GGC puede o no haber una repeticion parcial CGG, CCG, GCG, CGC, GCC, o GGC entre el residuo A, T o U y la ultima repeticion completa de CgG, CCG, GCG, CGC, GGC, o GGC. Es posible sustituir residuos de nucleotidos no naturales, discutidos detalladamente mas abajo, que preferentemente el par de bases con residuos T/U o A con relacion a otros residuos nucleotfdicos naturales para el residuo A, T o U. Similarmente, ademas es posible sustituir uno o mas residuos de nucleotidos no naturales que preferentemente un par de bases con residuos C o G con relacion a otros residuos nucleotfdicos naturales para uno o mas residuos G y/o C que forman las repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC, o GGC. La presencia de uno o mas de dichos residuos no naturales dentro de una secuencia de cualquier otra forma constituida por repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC, o GGC (opcionalmente con un A, T, U o el residuo no natural correspondiente como se discutio anteriormente) no niega la identidad de dicha secuencia dentro del contexto de la presente descripcion como una secuencia de repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC.
En un ensayo no anclado, se proporciona un primer iniciador que tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica de CGG que no comprenden elementos interruptores. La presencia de un elemento de interrupcion puede senalarse en los resultados de un ensayo no anclado por un nivel relativamente bajo de productos cuya smtesis implica la extension del primer iniciador unido a sitios que comprenden el elemento de interrupcion. Estos niveles bajos pueden aparecer como una interrupcion o conjunto de picos bajos rodeados por picos mas altos en un electroferograma.
En un ensayo de anclaje, se proporciona un primer iniciador que tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica en CgG que comprenden elementos interruptores. Se debe senalar que un iniciador que tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica en CGG que comprende elementos interruptores puede proporcionarse en reacciones en las que al menos un molde comprende al menos una region rica en CgG que comprende cero, uno o una pluralidad de elementos interruptores y la repeticion de un iniciador con "una actividad de union preferente para sitios en la region rica de CGG que comprenden elementos interruptores" no implica, por ejemplo, que la region rica en CGG comprenda necesariamente una pluralidad de elementos interruptores. La presencia de un elemento de interrupcion se senala en un ensayo de anclaje por un nivel relativamente alto de productos cuya smtesis implica la extension del primer iniciador unido a sitios que comprenden el elemento de interrupcion. El nivel alto puede aparecer como un pico rodeado por picos inferiores y/o senal de lmea de base en un electroferograma.
En algunas modalidades, el primer iniciador usado en un ensayo de anclaje comprende un residuo A, T o U entre o en el extremo 3' de las repeticiones de CGG. En algunas modalidades, el primer iniciador usado en un ensayo de anclaje comprende un residuo de nucleotido no natural que preferentemente se basa en pares con residuos A o T/U con relacion a otros residuos nucleotfdicos naturales. Los residuos de nucleotidos no naturales son residuos nucleotfdicos que comprenden una nucleobase distinta de adenina, timina, guanina, citosina y uracilo (A, T, G, C y U, respectivamente). Ejemplos de residuos de nucleotidos no naturales que incluyen preferentemente un par de bases con residuos A o T/U, sin limitacion, aductos de residuos T, U o A que preferentemente un par de bases con residuos A o T/U con relacion a otros residuos naturales (por ejemplo, analogos de uracilo 5-sustituido); y residuos que comprenden nucleobases tales como, por ejemplo, pseudouracilo y diaminopurina.
Dos iniciadores se consideran orientados de manera opuesta cuando se unen a cadenas opuestas de un molde de acido nucleico bicatenario.
Como se usa en la presente descripcion, una secuencia es "corriente arriba" de una region rica en CGG cuando se produce 5' de la region rica en CGG a lo largo de la cadena que comprende repeticiones de CGG. Como se usa en la presente descripcion, una secuencia es "corriente abajo" de una region rica en CGG cuando se produce 3' de la region rica en CGG a lo largo de la cadena que comprende repeticiones de CGG.
Los metodos de la invencion pueden referirse a reacciones de amplificacion que comprenden proporcionar al menos dos o al menos tres iniciadores diferentes. En algunas modalidades, se proporcionan al menos tres iniciadores diferentes y uno de los iniciadores es una subsecuencia de otro iniciador. En algunas modalidades, un iniciador es un iniciador quimerico que comprende repeticiones de CGG y una secuencia solapa 5', y otro iniciador tiene la secuencia de la secuencia solapa 5' del iniciador quimerico. Se debe senalar que el iniciador que tiene la secuencia de la secuencia solapa 5' del iniciador quimerico puede, pero no necesariamente, tener la secuencia entera no repetitiva del iniciador quimerico. En otras palabras, la secuencia de parte o de todo un iniciador puede estar comprendida por la secuencia de otro iniciador; por ejemplo, el iniciador quimerico comprende una secuencia solapa 5', y otro iniciador puede comprender la secuencia de parte o de toda la secuencia solapa 5'. En algunas modalidades, el iniciador contiene 12-15 nucleotidos de secuencia de repeticion CGG. La secuencia solapa 5' puede corresponder a una secuencia adyacente o cercana a la region de repeticion CGG, o puede no estar relacionada con secuencias en y alrededor de la region de repeticion CGG.
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En algunas modalidades, la longitud del iniciador quimerico puede ser de aproximadamente 35, 40, 45, 50 o 55 nt. En algunas modalidades, uno o mas de los iniciadores tiene una Tm en el intervalo de 60°C a 75°C, por ejemplo, aproximadamente 60°C, 65°C, 70°C, o 75°C.
En algunas modalidades, se proporcionan al menos tres iniciadores diferentes y se proporciona un iniciador a una concentracion inferior que la concentracion de otro iniciador. Por ejemplo, el iniciador quimerico se proporciona opcionalmente a una concentracion menor que el iniciador con la secuencia de la secuencia solapa 5' del iniciador quimerico. La relacion de las concentraciones, expresada como diferencia de veces, puede encontrarse en el intervalo de 2 a 10.000 o mas, por ejemplo 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000, o 10.000. En tales modalidades, el iniciador presente a una concentracion inferior puede agotarse en las primeras rondas de la reaccion de amplificacion, de manera que la extension es generalmente toda o casi toda, a partir de los iniciadores todavfa presentes (que estaban inicialmente presentes a concentraciones relativamente superiores).
La invencion se refiere a reacciones que amplifican acidos nucleicos. Ejemplos de reacciones de amplificacion incluyen, sin limitacion, PCR, NASBA (amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos) y SDA (amplificacion de desplazamiento de cadenas). Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 4.683.202 (PCR); Patente de los Estados Unidos 6.326.173; y J. of Virol. Methods 151:283-293 (2008) (NASBA); y la Patente de los Estados Unidos 5.648.211 (SDA). El tecnico con experiencia comprendera que reactivos son apropiados para proporcionar. Cada uno de estos metodos implica la smtesis de ADN y, como tal, implica el uso de aDn polimerasas, nucleotidos y cationes divalentes (suministrados como una sal), particularmente magnesio, en una solucion que conduce a la polimerizacion del ADN y en la que esta presente el molde. Los metodos vanan en terminos de proporcionar actividades cataltticas adicionales, el uso del termociclado o la incubacion isotermica, y el uso y estructura de los iniciadores. Ademas se proporciona tipicamente un regulador a un pH adecuado tales como entre 7 y 8, entre 6,5 y 8,5; entre 6 y 9, o aproximadamente 7,4 o 7,5.
En la PCR de conformidad con la invencion, se proporciona al menos un par de iniciadores que se unen en cada extremo o dentro de una region objetivo, sobre cadenas opuestas, de manera que cada uno inicia la smtesis hacia el otro iniciador. La reaccion se somete a termociclado para conducir la desnaturalizacion del sustrato en una etapa a alta temperatura, hibridacion de los iniciadores a una etapa de temperatura inferior y extension a una temperatura que puede ser pero no necesariamente superior que la de la etapa de hibridacion. La amplificacion se produce porque los productos de un ciclo pueden servir como moldes en el siguiente ciclo.
En NASBA, se proporciona una ARN polimerasa (ARNP) ademas de la ADN polimerasa, que puede ser ademas una transcriptasa inversa (RT) (por ejemplo, una enzima que puede catalizar la smtesis de ADN usando o un molde de ARN o ADN). Se proporcionan iniciadores que son similares a los usados en la PCR excepto que al menos un iniciador comprende adicionalmente una secuencia promotora que se reconoce por la ARNP. Asf, el producto de la RT sirve como molde para la ARNP, que sintetiza el ARN que sirve como molde para la RT, dando lugar a la amplificacion. En algunas formas de NASBA, se proporciona RNasa H para producir el ADN monocatenario despues de la smtesis de un tnbrido de ARN-ADN por RT. La amplificacion se produce por la accion combinada de la RT y ARNP, en ausencia de la desnaturalizacion termica repetida.
SDA es una tecnica en la que el ADN se amplifica de forma isotermica y asincronica, lo que significa que la desnaturalizacion termica dclica no se usa para separar las cadenas; en su lugar, el desplazamiento de la cadena ocurre a traves de la propia smtesis de ADN, en donde la extension de un 3' OH provoca el desplazamiento de la cadena corriente abajo. El 3' OH se proporciona inicialmente por un iniciador exterior y posteriormente por una reaccion de corte. Se proporcionan dos pares de iniciadores. Un par "interior" se une alrededor del amplicon y comprende adicionalmente solapas 5' que contienen un sitio de restriccion. El otro par "exterior" se situa distalmente, es decir, mas alejado de la region objetivo. Un iniciador interior puede unirse al molde, extenderse y despues desplazarse mediante smtesis a partir del correspondiente iniciador exterior. Posteriormente, el ADN desplazado se hace bicatenario, por ejemplo, mediante smtesis de la segunda cadena. La siguiente etapa consiste en cortar una cadena de la molecula bicatenaria, que puede hacerse usando nucleotidos modificados y un sitio de restriccion en donde el sitio de escision se inactiva en una cadena (pero no en la otra) por el nucleotido modificado. La enzima de restriccion correspondiente a este sitio se proporciona en la reaccion y genera el corte. El 3' OH en el corte resultante se extiende despues por la ADN polimerasa, desplazando una cadena (que puede servir de nuevo como molde 1) y la molecula bicatenaria regenerada es de nuevo un sustrato para el corte seguido de extension y desplazamiento, dando lugar a la amplificacion. No es necesaria la desnaturalizacion termica repetida.
En algunas modalidades, los metodos de la invencion comprenden proporcionar los dNTP en una relacion GC/AT mayor que uno, y a una concentracion total de dNTP que conduce a la smtesis de ADN usando moldes ricos en GC. La relacion GC/AT puede ser de aproximadamente 1,1; 1,2; 1,4; 1,6; 2; 2,5; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, o superior. La relacion GC/AT puede estar entre 1,1 y 20, 1,1 y 15, 1,1 y 10, 1,1 y 8, 1 y 15, 1,1 y 7, 1,1 y 6, 1,1 y 5, 1,2 y 25, 1,4 y 25, 1,6 y 25, 2 y 25, 3 y 25, 4 y 25, 5 y 25, 2 y 15, 2,5 y 10, o 4 y 10. La concentracion total de dNTP puede ser de aproximadamente 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1, 1,2; 1,5; 2, o 3 mM. La concentracion de dNTP puede estar entre 0,4 y 3 mM, 0,5 y 3 mM, 0,6 y 3 mM, 0,7 y 3 mM, 0,8 y 3 mM, 0,9 y 3 mM, 1 y 3 mM, 0,4 y 2 mM, 0,4 y 1,5 mM, 0,4 y 1,2 mM, 0,4 y 1 mM, 0,4 y 0,9 mM, 0,4 y 0,8 mM, 0,4 y 0,7 mM, 0,5 y 2 mM, 0,5 y 1 mM, o 0,6 y 0,9 mM. "Relacion GC/AT " significa la relacion de la concentracion de la suma de dCTP, dGTP y todos sus analogos de
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nucleotidos, a la concentracion de la suma de dATP, dTTP, dUTP y todos sus analogos de nucleotidos, en una solucion dada o mezcla. "dNTP" significa desoxinucleotido trifosfato y se refiere a dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP y sus analogos. Los "analogos de nucleotidos" son moleculas o iones que comprenden una porcion base distinta de las bases naturales adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) uracilo (U), una porcion azucar identica o similar a desoxirribosa, y al menos una porcion fosfato o fosfato multiple (por ejemplo, difosfato o trifosfato). El analogo de nucleotidos es un analogo de un nucleotido espedfico, particularmente dATP, dCTP, dGTP, dTTP o dUTP, cuando comprende un trifosfato y una porcion de azucar, cuya estructura y configuracion son adecuadas para la incorporacion en un acido nucleico por una polimerasa y una base cuyas propiedades de apareamiento de bases en un acido nucleico bicatenario y los loci de incorporacion por ADN polimerasas en un acido nucleico bicatenario son mas similares a uno de los cinco nucleotidos enumerados anteriormente, con la excepcion de que los analogos de dTTP seran generalmente ademas analogos de dUTP y viceversa. El termino "analogo" usado junto con los terminos que incluyen pero no se limitan a "nucleosido", "base", "nucleobase", o "residuo" debe interpretarse de la misma manera que si se usaran junto con "nucleotido."
1 Tenga en cuenta que algunas cadenas desplazadas no seran inicialmente de longitud completa, sino que careceran del complemento de la porcion distal de la solapa interior del iniciador, como consecuencia del corte. Esto no perjudica la union del iniciador (recuerde que la porcion sin solapa del iniciador tiene una longitud suficiente para hibridar establemente) y, tras la union del iniciador, se genera un saliente 5' que la polimerasa es capaz de llenar.
En algunas modalidades, se pueden proporcionar potenciadores. Los potenciadores contribuyen al exito de las reacciones que generan productos ricos en GC. Puede incluirse generalmente, una variedad de potenciadores en las reacciones de PCR para aumentar el rendimiento, la especificidad y la consistencia, y pueden operar disminuyendo la Tm del ADN molde. Los potenciadores pueden funcionar mediante la desestabilizacion de la helice, la neutralizacion de los inhibidores de la reaccion u otros mecanismos, que incluyen mecanismos desconocidos. Los potenciadores incluyen, sin limitacion, betama, analogos de betama, glicerol, albumina de suero bovino (BSA), polietilenglicol, cloruro de tetrametilamonio, 7-deaza-GTP, detergentes neutros, dimetilsulfoxido (DMSO), metanol, etanol, isopropanol, formamida, acetona , acetamida, N-metilformamida, N,N-dimetilformamida, acetona, acetimida, N-metilacetimida, N,N- dimetilacetimida, 2-pirrolidona, N-metilpirrolidona, propionamida e isobutiramida. Los detergentes neutros incluyen, sin limitacion, TWEEN-20, p-octil-glucosido, Octil-p-tio-glucopiranosido, Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween-80, Pluronic F-68, Pluronic F-127, Deoxi Big CHAP, CHAPS, CHES, nonil fenoxilpolietoxiletanol (Tergitol-tipo NP-40) y octil fenoxilpolietoxiletanol (Igepal CA-630). Los analogos de betama incluyen, sin limitacion, homodeanol betama, deanol betama, propio betama, homoglicerol betama, dietanol homobetama, trietanol homobetama, hidroxipropil homobetama, sal interna de N-metil-N-(2-carboxietil)morfolinio, sal interna de N-metil-N-(2-
carboxietil)piperidinio, sal interna de N-Metil-N-(2-carboxietil)pirrolidinio, sal interna de N,N dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(2- sulfoetil)amonio, sal interna de N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(3-sulfopropil)amonio, sal interna de N,N-dihidroxietil-N- metil-N-(3-sulfopropil)amonio, sal interna de N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)-N-(4-sulfobutil)amonio, sal interna de N-metil-N- (3-sulfopropil)morfolinio, y sal interna de N-metil-N-(3-sulfopropil)piperidio.
Se pueden proporcionar betama, analogos de betama y/o los otros potenciadores a concentraciones molares entre 0,01 y 5 M, 0,01 y 4 M, 0,01 y 3 M, 0,01 y 2,5 M, 0,02 y 5 M, 0,03 y 5 M, 0,04 y 5 M, 0,05 y 5 M, 0,07 y 5 M, 0,1 y 5 M, 0,2 y 5 M, 0,3 y 5 M, 0,4 y 5 M, 0,5 y 5 M, 0,7 y 5 M, 1 y 5 M, 1,5 y 5 M, 0,1 y 4 M, 0,5 y 3 M, 1 y 2,5 M, o 1,5 y 2,5 M, por ejemplo, aproximadamente 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 3, 3,5; 4, 4,5 o 5 M. Alternativamente, se pueden proporcionar potenciadores a concentraciones en porcentaje de p/v o v/v de entre 0,1 y 50%, 0,2 y 50%, 0,5 y 50%, 1 y 50%, 2 y 50%, 5 y 50%, 0,1 y 40%, 0,1 y 30%, 0,1 y 20%, 0,5 y 40% 1 y 30%, o 2 y 20%, por ejemplo, aproximadamente 0,1; 0,2; 0,5; 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50% en volumen. Los detergentes neutros pueden proporcionarse entre 0,0001 y 10% en volumen, 0,0002 y 10%, 0,0005 y 10%, 0,001 y 10%, 0,002 y 10%, 0,005 y 10%, 0,01 y 10%, 0,02 y 10%, 0,05 y 10%, 0,0001 y 5%, 0,0001 y 2%, 0,0001 y 1%, 0,0005 y 1%, o 0,001 y 1%, por ejemplo, aproximadamente 0,0001; 0,0002; 0,0003; 0,0004; 0,0005; 0,0006; 0,0007; 0,0008; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,003; 0,004; 0,005; 0,006; 0,007; 0,008; 0,009; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10% en volumen. Los expertos en la tecnica reconoceran las concentraciones apropiadas para diversos potenciadores.
La invencion se refiere a los metodos que comprenden proporcionar reguladores para reacciones de amplificacion. Los reguladores pueden comprender, por ejemplo y sin limitacion, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), bis-tris propano, bicarbonato, fosfato, glicina, histidina, acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfonico (HEPES), acido 3-(N- morfolino)propanosulfonico (MOPS) y diversas bases/acidos conjugadas y sus sales.
La invencion se refiere a los metodos que comprenden proporcionar al menos una ADN polimerasa para sintetizar ADN a partir de los dNTP de una manera dependiente del molde. La ADN polimerasa puede comprender una polimerasa silvestre, modificada, termofflica, quimerica, manipulada y/o una mezcla de mas de una. La ADN polimerasa puede comprender Polimerasa Exacta (5 PRIME GmbH), AccuSure™ ADN Polimerasa (Bioline), Phusion™ AccuPrime™ Pfx (Invitrogen), Platinum Taq ADN Polimerasa de Alta Fidelidad (Invitrogen), Phire™ Hot Start ADN Polimerasa (New England Biolabs), Phusion® Hot Start ADN Polimerasa de Alta Fidelidad (New England Biolabs), JumpStart™ REDTaq™ ADN Polimerasa (Sigma-Aldrich), PfuUltra™ Hotstart ADN Polimerasa (Stratagene), PfuTurbo® Cx Hotstart aDn Polimerasa (Stratagene), PrimeSTART™ HS ADN Polimerasa (Takara), PCR Enzima de Alta Fidelidad Extensora (ABgene), ACCUZYME™ADN Polimerasa (Bioline), SAHARA™ ADN Polimerasa (Bioline), VELOCITY ADN Polimerasa
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(Bioline), GeneChoice® ADN Polimerasa AccuPOL™ GeneChoice, Inc.), GeneChoice® UniPOLT™ ADN Polimerasa (GeneChoice, Inc.), Mezcla enzima Elongasa (Invitrogen), Pfx50™ ADN Polimerasa (Invitrogen), Phusion ADN Polimerasa (New England Biolabs), KOD HiFi ADN Polimerasa (Novagen), KOD XL aDn Polimerasa (Novagen), Expand 20 kb PLUS mezcla de ADN Polimerasa Termostable (Roche Applied Science), mezcla de ADN Polimerasa Termostable de alta fidelidad PLUS para expandirse (Roche Applied Science), mezcla de ADN Polimerasa Termostable de alta fidelidad para expandirse(Roche Applied Science), mezcla de ADN Polimerasa Termostable de alta fidelidad de molde largo para expandirse (Roche Applied Science), Easy-A™ Enzima para el clonaje de alta fidelidad (Stratagene), EXL™ ADN Polimerasa (Stratagene), Herculase®Enhanced ADN Polimerasa (Stratagene), Herculase® II Fusion AdN Polimerasa (Stratagene), Kapa LongRange™ ADN Polimerasa (Kapa Biosystems), Kapa HiFi™ ADN Polimerasa (Kapa Biosystems), Kapa2G™ ADN Polimerasa Robusta (Kapa Biosystems), Kapa2G™ HotStart ADN Polimerasa Robusta (Kapa Biosystems), Kapa2G™ ADN Polimerasa rapida (Kapa Biosystems), Kapa2G™ HotStart ADN Polimerasa rapida (Kapa Biosystems), LA TAQ ADN Polimerasa (Takara), Optimasa ADN Polimerasa (Transgenomic, Inc.), Exo- Pfu ADN Polimerasa (Stratagene), HotMaster Taq aDn Polimerasa (5 PRIME GmbH), HotTaq ADN Polimerasa (Abnova Corporation), AmpliTaq Gold® ADN Polimerasa (Applied Biosystems), Bst ADN Polimerasa Lg Frag (New England Biolabs), MasterAmp™ Tfl ADN Polimerasa (ePiCeNTRE Biotechnologies), Red Hot ADN Polimerasa (ABgene), Thermoprime Plus ADN Polimerasa (ABgene), Taq-red ADN Polimerasa (AppliChem GmbH), BIO-X-ACT™ Long AdN Polimerasa (Bioline), BIO-X-ACT™ Short ADN Polimerasa (Bioline), Bioline HybriPol™ AdN Polimerasa (Bioline), BioTherm Taq ADN Polimerasa (eEnzyme LLC), EU-Taq ADN Polimerasa (eEnzyme LLC), Synergy Taq ADN Polimerasa (eEnzyme LLC), GeneChoice® RedPOL™ ADN Polimerasa (GeneChoice, Inc.), AccuPrime™ GC-Rich ADN Polimerasa (Invitrogen), PyroPhage® 3173 ADN Polimerasa, Exo Minus (Lucigen), 9 Degrees North (Modified) ADN Polimerasa (New England Biolabs), Therminator ADN Polimerasa (New England Biolabs), Pwo ADN Polimerasa (Roche Applied Science), Paq5000™ AdN Polimerasa (Stratagene), YieldAce™ ADN Polimerasa (Stratagene), e2TAK™ ADN Polimerasa (Takara), o ADN polimerasas de origen natural de P. kodakaraensis, P. furiosus, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis "VentTM", P. GB-D "Deep Vent", T. 9N-7, T. aggregans, T. barossii, T. fumicolans, T. celer, Pyrococcus sp. cepa ST700, T. pacificus, P. abysii, T. profundus, T. siculi, T. hydrothermalis, Thermococcus sp. cepa GE8, T. thioreducens, P. horikoshii o T. onnurineus NA1, Thermococcus sp. 9°N-7, Thermococcus sp. GI-J, Thermococcus sp. MAR-13, Thermococcus sp. GB-C, Thermococcus sp. GI-H, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermotoga maritima, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus caldotenax.
Los datos obtenidos a traves de la invencion, por ejemplo, los resultados de las pruebas, pueden usarse en el proceso de diagnostico de la presencia o ausencia de una afeccion o enfermedad. Los datos obtenidos a traves del uso de la invencion pueden usarse en la determinacion del genotipo de un individuo. Los datos obtenidos a traves de la invencion pueden usarse para detectar genotipos asociados con smdrome de X fragil, smdrome de ataxia de temblor asociado con X fragil e insuficiencia ovarica primaria asociada con X fragil. Los loci geneticos asociados con estas afecciones son conocidos en la tecnica e incluyen sin limitacion FMR1, FMR2, el 5' UTR de FMR1, el 5' UTR de FMR2, las repeticiones de CGG dentro del 5' UTR de FMR1 y repeticiones de CGG dentro del 5' UTR de FMR2. En una modalidad adicional, los datos obtenidos a traves de la invencion pueden usarse para detectar genotipos asociados con trastornos de repeticion de trinucleotidos ricos en GC y/o con elementos de interrupcion, tales como smdrome de X fragil, smdrome de temblor/ataxia asociado a X fragil y la insuficiencia ovarica primaria asociada a X fragil, distrofia miotonica, enfermedad de Huntington, atrofia muscular espinobulbar, atrofia de atrofia dentato-rubro-palido-luisiana, y/o ataxia espinocerebelosa. Un elemento de interrupcion, como el nombre sugiere, interrumpe una serie de repeticiones. Una region rica en CGG puede comprender o no elementos de interrupcion. Asf, una region rica en CGG puede comprender series de repeticiones trinucleotfdicas y al menos un elemento de interrupcion entre las series. Los loci geneticos asociados con estas afecciones son conocidos en la tecnica e incluyen sin limitacion FMR1, FMR2, DMPK, ZNF9, HTT, AR, ATN1, ATXN1-3, ATXN7, ATXN10, CACNA1A, SCA8, PPP2R2B, y TBP. Ver, por ejemplo, Nat. Genet. 13(1):105-8 (1996); Nat. Genet. 13(1):109-13 (1996).
Los metodos pueden comprender la determinacion de la presencia o ausencia de elementos de interrupcion cerca de cualquiera de los extremos de una region rica en CGG comprendida por al menos un alelo comprendido en la muestra, por ejemplo, dentro de 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 o 300 pb de cada extremo. Determinar la presencia o ausencia de elementos de interrupcion dentro de una distancia dada de cada extremo de una region rica en CGG comprendida por al menos un alelo comprendido por la muestra se entiende que incluye determinar la presencia o ausencia de interrupcion en regiones ricas en CGG con tamanos de manera que toda la region rica en CGG esta dentro de la distancia dada de cada extremo.
En algunas modalidades, los metodos comprenden analizar al menos una region rica en CGG independientemente de los ensayos auxiliares o reflejos que comprenden procedimientos tales como transferencia de Southern, digestion por restriccion o secuenciacion, por ejemplo, secuenciacion de Sanger, secuenciacion de Maxam-Gilbert, secuenciacion por ligacion y secuenciacion por smtesis de una sola molecula (ademas conocida como secuenciacion de segunda generacion), que incluye secuenciacion terminadora reversible y pirosecuenciacion. Sin embargo, los metodos pueden comprender la determinacion de informacion sobre al menos una region rica en CGG tal como el contenido o la posicion del elemento de longitud y/o de interrupcion como se describe en la presente descripcion. En algunas modalidades, los metodos comprenden obtener informacion que es necesaria y suficiente para la determinacion de informacion acerca de al menos una region rica en CGG, tal como el contenido o la posicion del elemento de longitud y/o interrupcion como se describe en la presente descripcion a partir de la representacion del tamano del producto y la abundancia producida por una tecnica de alta resolucion a partir de una reaccion de amplificacion como se describe en la presente descripcion.
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La informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG o donde dentro de al menos una region rica en CGG se localiza una secuencia de interrupcion puede comprender informacion tal como si al menos una region rica en CGG comprendida por al menos un molde en una muestra comprende una secuencia de interrupcion; en los casos donde mas de un molde diferente esta presente, si cada molde en una muestra comprende una secuencia de interrupcion; una estimacion de lfmite inferior del numero de secuencias de interrupcion presentes en al menos una region rica en CGG; y/o al menos una posicion de al menos un elemento de interrupcion (que incluyen la determinacion dentro de un nivel dado de precision, como se discute mas abajo). La lista anterior de tipos espedficos de informacion no incluye otros tipos de informacion que puedan determinarse a traves de los metodos de la invencion descritos explfcita o implfcitamente en la presente descripcion, teniendo en cuenta el conocimiento de un experto en la tecnica.
En algunas modalidades, los metodos comprenden realizar al menos dos ensayos, en donde que cada ensayo comprende (a) proporcionar iniciadores, en donde los iniciadores de al menos dos ensayos no son identicos; (b) realizar una reaccion de amplificacion para producir un conjunto de productos; (c) resolver el conjunto de productos, produciendo al menos dos representaciones del tamano del producto y la abundancia a partir de al menos dos ensayos; y (d) obtener informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en al menos una region rica en CGG o donde dentro de al menos una region rica en CGG se localiza una secuencia de interrupcion. En algunas modalidades, la informacion obtenida comprende informacion que no se pudo obtener si solamente se habfa realizado un ensayo, tal como, en los casos en que la muestra comprende al menos dos moldes diferentes que comprenden regiones ricas en CGG y al menos un elemento de interrupcion esta presente en al menos una de las regiones ricas en CGG, cuyas al menos dos regiones ricas en CGG comprenden al menos un elemento de interrupcion. Por ejemplo, una situacion en la que esta informacion puede ser ambigua a partir de los resultados de un ensayo se ilustra en la Figura 10. Otras posibles ambiguedades, y ejemplos de como resolverlas, se discuten mas abajo.
En algunas modalidades, al menos dos ensayos comprenden un ensayo de anclaje y un ensayo sin anclaje. En algunas modalidades, al menos dos ensayos usan iniciadores orientados opuestamente que comprenden repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC. Es decir, un primer ensayo puede comprender proporcionar iniciadores que comprenden un iniciador que comprende repeticiones que se orienta corriente arriba, y el segundo ensayo puede comprender proporcionar iniciadores que comprenden un iniciador que comprende repeticiones que se orienta corriente abajo, o viceversa.
En algunas modalidades, los metodos comprenden al menos tres ensayos, que comprenden al menos dos ensayos sin anclaje y al menos un ensayo de anclaje, o viceversa. Al menos dos ensayos sin anclaje (o de anclaje) pueden usar iniciadores orientados opuestamente que comprenden repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC, como se discutio en el parrafo anterior.
Se debena senalar que en algunas situaciones, un "conjunto de productos" puede no comprender una pluralidad de productos principales o detectables, tales como ensayos de anclajes con muestras que comprenden como maximo una region rica en CGG que comprende como maximo una interrupcion. Los iniciadores se consideran "no identicos" entre ensayos si al menos uno de los iniciadores usados en uno de los ensayos difiere de los iniciadores usados en los otros ensayos; en otras palabras, algunos de los iniciadores pueden ser identicos.
Los metodos pueden comprender determinar al menos un detalle de un genotipo heterocigoto, aneuploide o mosaico, realizando al menos dos ensayos como se describio anteriormente, en donde las reacciones de amplificacion usan conjuntos de iniciadores no identicos y al menos un detalle se determina comparando los resultados de al menos dos reacciones de amplificacion.
El genotipo de una muestra se refiere al genotipo de la fuente a partir de la cual se obtuvo una muestra; este termino puede abarcar multiples genotipos individuales en el caso de muestras mixtas.
Una muestra que tiene un genotipo heterocigoto comprende material genetico de una celula que comprende dos alelos del locus que comprende la region rica en CGG.
Una muestra que tiene un genotipo de mosaico comprende al menos dos alelos del locus que comprende la region rica en CGG, siendo las celulas de las que se obtuvo la muestra geneticamente diferentes en al menos un alelo del locus que comprende la region rica en CGG. Al menos dos alelos comprendidos por una muestra que tiene un genotipo de mosaico pueden clasificarse como alelos mayor o menor dependiendo de su abundancia. El alelo con mayor abundancia se considera un alelo principal y el alelo con la menor abundancia se considera un alelo menor; cuando estan presentes mas de dos alelos, los alelos se clasifican como mayores o menores basados en si su abundancia relativa, expresada como un porcentaje, es aritmeticamente mas proxima al alelo con la abundancia mas alta o mas baja. Por ejemplo, en una muestra que comprende alelos primero, segundo y tercero con abundancias relativas del 60%, 31% y 9%, respectivamente, el segundo alelo se considera un alelo menor. La presencia de alelos mayores y menores ademas puede resultar de la aneuploidfa, por ejemplo, si un genoma comprende tres copias de una region rica en CGG, de las cuales dos son iguales (el alelo principal) y uno es diferente (el alelo menor). La neuploidfa se discute en detalle mas abajo.
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En algunas modalidades, los metodos comprenden detectar si una muestra comprende un alelo menor con una abundancia relativa de al menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, o 25%. Se entiende que la region rica en CGG del alelo menor puede ser diferente de la region rica en CGG del alelo principal. Por ejemplo, el alelo menor puede tener una region rica en CGG con un numero diferente de repeticiones y/o una distribucion diferente de elementos AGG. En algunas modalidades, los metodos comprenden detectar si una muestra comprende un alelo menor que comprende un elemento de interrupcion. En algunas modalidades, los metodos comprenden detectar la localizacion de un elemento de interrupcion en un alelo menor, que puede estar dentro de un nivel de precision como se describe mas abajo.
Una muestra que tiene un genotipo aneuploide comprende un numero de alelos del locus que comprende la region rica en CGG distinta del numero euploide. El numero euploide es uno para los loci cromosomicos somaticos en los gametos y celulas germinales que han sufrido una division meiotica reductora, excepto los loci cromosomicos sexuales en gametos masculinos y celulas germinales masculinas que han sufrido una division meiotica reductora, donde puede ser 0 o 1 para celulas individuales y promedios hasta aproximadamente 0,5 para una poblacion de esta (sujeto a variacion dependiendo del numero de celulas que portan cromosomas X e Y presentes). El numero euploide es ademas uno para los loci del cromosoma X en las celulas somaticas masculinas y las celulas germinales masculinas que aun no han sufrido una division meiotica reductora. El numero euploide es de 2 para los loci en cromosomas somaticos de celulas somaticas y en celulas germinales que aun no han sufrido una division meiotica reductora y para los loci de cromosomas X en celulas femeninas somaticas y celulas germinales femeninas que aun no han sufrido una division meiotica reductora. Es posible que una muestra tenga mas de una de las condiciones de heterocigosidad, aneuploidfa y mosaicidad.
Los genotipos de mosaico pueden producirse, por ejemplo, en muestras de individuos que comprenden celulas derivadas de diferentes celulas progenitoras (cigotos, blastomeros, celulas madre, etc.) o individuos que comprenden celulas que son geneticamente diferentes debido a mutacion somatica, que incluyen alteracion del numero de repeticion, tal como la expansion de la repeticion. La aneuploidfa esta presente en ciertos smdromes, por ejemplo los de Down, Turner y Klinefelter, y ademas puede surgir somaticamente a traves de eventos de no disyuncion cromosomica; tales eventos pueden dar lugar a individuos que pueden proporcionar muestras aneuploides en mosaico, que pueden ademas ser o no heterocigotos.
Las muestras que comprendan al menos dos alelos diferentes del locus que comprende la region rica en CGG (debido a ser al menos uno de heterocigoto, aneuploide o mosaico para ese locus) pueden analizarse para determinar al menos un detalle con respecto al genotipo.
Al menos un detalle puede comprender si uno, dos, ninguno o mas de dos (si corresponde) de al menos los dos alelos diferentes comprenden al menos un elemento de interrupcion.
Al menos un detalle puede comprender el numero mmimo de elementos de interrupcion comprendidos por al menos uno de al menos dos alelos diferentes. Por ejemplo, se pudo determinar que un alelo comprende al menos un elemento de interrupcion. Al menos un detalle puede comprender ademas que otro alelo comprende, por ejemplo, al menos dos elementos de interrupcion.
Al menos un detalle puede comprender la localizacion de al menos un elemento de interrupcion en uno de los alelos.
En algunas modalidades, al menos un detalle comprende al menos un detalle que no puede determinarse sin ambiguedad acerca del genotipo de una muestra heterozigotica, aneuploide y/o mosaica a partir de los resultados de un unico ensayo. Lo siguiente es una lista no exclusiva de detalles que pueden ser ambiguos a partir de los resultados de un unico ensayo:
1. Los resultados de un solo ensayo pueden indicar que al menos un elemento de interrupcion esta presente, pero dichos resultados pueden ser ambiguos en cuanto a que el alelo comprende al menos un elemento de interrupcion.
2. Los resultados de un unico ensayo pueden indicar que al menos dos elementos de interrupcion estan presentes, pero dichos resultados pueden ser ambiguos en cuanto a si los elementos de interrupcion estan comprendidos por el mismo alelo o alelos diferentes.
3. Los resultados de un unico ensayo pueden indicar que al menos tres elementos de interrupcion estan presentes, pero dichos resultados pueden ser ambiguos en cuanto a como al menos los tres elementos de interrupcion se distribuyen entre al menos los dos alelos diferentes.
4. Los resultados de un unico ensayo pueden ser ambiguos en cuanto a si un elemento de interrupcion esta presente en una posicion en un primer alelo que esta oscurecido en la representacion del tamano del producto y la abundancia por la senal, tal como un pico grande, que corresponde a un segundo alelo.
En algunas modalidades, los metodos de la invencion resultan en la smtesis de productos que no contienen, o estan libres de, una fraccion sustancial de material amplificado inespedficamente. En algunas modalidades, los metodos resultan en la smtesis de productos que no contienen, o estan libres de una fraccion sustancial de material amplificado inespedficamente cuando el molde es una de las muestras descritas en los Ejemplos 1-3 mas abajo. En algunas modalidades, los metodos de la invencion resultan en la smtesis de productos que no contienen o estan libres de una fraccion sustancial de material amplificado inespedficamente que es mayor que un tamano esperado, calculandose
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dicho tamano esperado anadiendo la longitud de la region rica de CGG a un ajuste basado en la posicion en la cual hibrida el segundo iniciador. En algunas modalidades, los productos contienen menos del 20%, 15%, 10%, 5%, 2% o 1% de material que es mayor que el tamano esperado descrito en la oracion anterior, determinado por densitometna o integracion de una representacion del tamano y la cantidad del producto. En algunas modalidades, esta representacion es un electroferograma. Como se define en la presente descripcion, los productos son "esencialmente libres" de material amplificado inespedficamente cuando contienen menos de aproximadamente 10% de material que es mayor que el tamano esperado, como se determino anteriormente.
La invencion se refiere a metodos que comprenden el analisis de un molde que comprende secuencias repetidas ricas en GC, tales como, por ejemplo, trinucleotidos CGG o CCG. Dicho analisis puede comprender realizar una reaccion de amplificacion y resolver los productos a alta resolucion. La alta resolucion puede ser una resolucion suficiente para distinguir productos que contienen, por ejemplo, 20 frente a 21, o 20 frente a 22, 20 frente a 23, 20 frente a 24, o 20 frente a 25 repeticiones de trinucleotidos, o en algunas modalidades, productos que difieren en longitud por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleotidos o pares de bases. Ejemplos detecnicas que pueden emplearse en los metodos de la invencion para llevar a cabo esta etapa de resolucion incluyen, sin limitacion, electroforesis capilar y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; algunas modalidades de PAGE se denominan comunmente en la tecnica como "correr un gel de secuenciacion"), o sistemas de electroforesis/microflmdos del tipo "lab-on-a-chip". La instrumentacion para realizar la electroforesis capilar puede obtenerse, por ejemplo, de vendedores tales como Applied Biosystems (ABI), Beckman, Agilent y Qiagen, y los instrumentos adecuados incluyen sin limitacion ABI 310, 3100, 3130/3130xl o 3730/3730xl; Beckman P/ACE MDQ; Agilent 2100 Bioanalyzer; y Qiagen QIAxcel. El proceso de resolver los productos mediante electroforesis puede implicar el uso de polfmeros lfquidos, que incluyen, por ejemplo, POP-7, POP-6, POP-5 o POP-4, todos los cuales se venden por Applied Biosystems. En algunas modalidades, se usa un polfmero que puede resolver productos que contienen aproximadamente 250, 300, 350, 400 o mas repeticiones de trinucleotidos de conformidad con precisamente el tamano, tal como, por ejemplo, POP-4, para resolver los productos. La resolucion del conjunto de productos a alta resolucion puede realizarse usando una maquina, por ejemplo, elegida a partir de maquinas que comprenden una fuente de voltaje (por ejemplo, una fuente de alimentacion de DC), maquinas que comprenden una fuente de presion (por ejemplo, una bomba), y maquinas que comprenden una columna o capilar adecuado para realizar separaciones qmmicas. Por supuesto, la maquina puede comprender mas de uno de los componentes anteriores.
La resolucion de los productos a alta resolucion conduce a la produccion de una representacion del tamano y la abundancia del producto. Esta representacion puede ser una imagen o grafica que un experto en la tecnica pueda interpretar visualmente o con ayuda de una instrumentacion tal como, por ejemplo, un ordenador con programa apropiado o un densitometro, para comprender los tamanos y las cantidades de los productos de la reaccion. En algunas modalidades, la representacion es un electroferograma, fotograffa, grafico, diagrama o autorradiograma. La representacion puede obtenerse o registrarse a partir de fotones o partfculas beta emitidas por los productos o moleculas de colorantes unidas a los productos; estos pueden detectarse, por ejemplo, fotograficamente o electronicamente, y procesarse o desarrollarse para generar la representacion.
La invencion se refiere a metodos que comprenden obtener informacion acerca del numero de repeticion CGG (es decir, cuantas repeticiones de CGG, o repeticiones de trinucleotidos generalmente, estan comprendidas por el molde) a partir de la representacion del tamano y la abundancia del producto. Tal obtencion puede comprender contar el numero de especies observables en la representacion para determinar el numero de repeticion (a partir del numero de repeticiones comprendidas por el producto mas pequeno, que puede ser, por ejemplo, 4 o 5) o estimar el numero de repeticiones basado en la posicion del producto mas grande observable en la representacion.
En algunas modalidades, la region rica en CGG esta compuesta por la 5' UTR de FMR1 o la 5' UTR de FMR2.
En algunas modalidades, los metodos comprenden detectar si hay elementos de interrupcion presentes dentro de la region rica en CGG. En algunas modalidades, los elementos de interrupcion son trinucleotidos AGG. La deteccion de si estan presentes puede lograrse, por ejemplo, determinando posiciones en el molde donde la union del primer iniciador se redujo esencialmente o determinando un conjunto de longitudes en las que la cantidad de producto se reduce esencialmente en comparacion con longitudes cercanas. Por ejemplo, si el 10mo trinucleotido fuera AGG en una region con al menos 14 repeticiones totales de trinucleotidos y se realizo una reaccion de amplificacion que implica el uso de un iniciador que comprendio 4 repeticiones de CGG, puede esperase que los productos con 10, 11, 12 y 13 repeticiones de CGG estan presentes en una cantidad esencialmente reducida con relacion a los productos cercanos con 9 y 14 repeticiones. El grado en que se reduce la cantidad puede variar de 25% a 95% o mas, por ejemplo, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%. El grado de reduccion dependera generalmente de la cigosidad de la muestra; por ejemplo, una muestra en donde la region rica en CGG es de un heterocigoto individual para un alelo que comprende la region rica en CGG, o para una repeticion AGG espedfica, puede mostrar una reduccion en la cantidad de los productos correspondientes en el intervalo de 25% y 75%. Una muestra en donde la region rica en CGG es de un hemicigoto o homocigotico individual para un alelo que comprende la region rica en CGG, o para una repeticion AGG especifica, puede mostrar una reduccion en la cantidad de los productos correspondientes en el intervalo de 50% a 95% o mas.
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En algunas modalidades, los metodos no requieren el uso de estandares externos o calibradores tales como, por ejemplo, patrones de referencia o patrones moleculares. Esta independencia puede lograrse porque en algunas modalidades pueden usarse picos correspondientes a productos que difieren en longitud por una repeticion trinucleotfdica para contar hasta el tamano del producto mas grande, en donde el conteo puede indicar el numero de repeticiones en el molde (sujeto a cualquier ajuste necesario de conformidad con el numero de repeticiones comprendidas por el iniciador). En algunas modalidades, la separacion entre picos en parte de la representacion del tamano del producto y la cantidad puede usarse para estimar el tamano del producto mas grande, por ejemplo, por extrapolacion; esto puede ser util cuando la resolucion de los picos correspondientes a numeros de repeticion mas grandes es insuficiente para contar todos los picos hasta e incluir el del producto mas grande.
En algunas modalidades, los metodos pueden determinar el numero de repeticiones en la region rica en CGG hasta dentro de 100, 50, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, o 0 repeticiones. Determinacion de una cantidad "dentro de 0 unidades" significa que se determina su valor preciso. En algunas modalidades, los metodos comprenden determinar el numero de repeticiones en la region rica en CGG hasta dentro de las repeticiones de 100, 50, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, o 0 repeticiones. Por ejemplo, los metodos pueden comprender determinar el numero de repeticiones en una region rica en CGG que comprende menos de 70 repeticiones de CGG hasta dentro de 5, 4, 3, 2, 1 o 0 repeticiones; determinar el numero de repeticiones en una region rica en CGG que comprende de 70 a 120 repeticiones de CGG hasta dentro de 10, 5, 4 o 3 repeticiones; o determinar el numero de repeticiones en una region rica en CGG que comprende mas de 120 repeticiones de CGG, hasta aproximadamente 200 repeticiones de CGG, hasta dentro de 20, 10 o 5 repeticiones. La determinacion de los niveles de exactitud para regiones repetidas CGG aun mas grandes puede ser diffcil debido a la falta de estandares conocidos fiables.
En algunas modalidades, los metodos pueden determinar la posicion de un elemento de interrupcion dentro de los nucleotidos de 60, 45, 30, 15, 12, 9, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0. La posicion del elemento de interrupcion puede determinarse, por ejemplo, en terminos de distancia con relacion a cualquiera de los extremos de la region rica en CGG.
En algunas modalidades, al menos uno de los iniciadores comprende una porcion radiologicamente o electromagneticamente detectable. Las porciones radiologicamente detectables incluyen isotopos radiactivos que emiten partmulas detectables, tales como partmulas beta o gamma, por ejemplo, 14C, 3H, 32P, 33P, 35S, y125I. Las porciones electromagneticamente detectables incluyen entidades qmmicas que interactuan con radiacion electromagnetica (incluyendo absorbancia, emision o ambas) de una manera detectable, tales como cromoforos y fluoroforos, por ejemplo, fluorescema, FAM, tintes de cianina, tintes de rodamina, etc.
Los aspectos adicionales de la invencion se expondran en parte en la descripcion que sigue, y en parte seran evidentes a partir de la descripcion, o pueden aprenderse al llevar a la practica la invencion. Los aspectos de la invencion se realizaran y conseguiran por medio de los elementos y combinaciones particularmente destacadas en las reivindicaciones anexas.
Breve descripcion de los dibujos
Los dibujos adjuntos ilustran una o mas modalidades de la invencion y, junto con la descripcion, sirven para explicar los principios de la invencion.
La Figura 1 describe la amplificacion de un molde rico en CGG que comprende los trinucleotidos AGG. Las secuencias de iniciadores son
FAM_FX-F
5'-FAM-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT (sec. con num. de ident.: 38)
Tag- (CCG)4
AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG (sec. con num. de ident.: 39)
Un molde que comprende (CGG)10AGG(CGG)gAGG(CGG)g (sec. con num. de ident.: 42) se muestra. Representa una posible region de repeticion CGG en 5' UTR' de FMR1. El iniciador Tag-(GCC)4 puede unirse internamente en multiples posiciones en la region de repeticion; con el iniciador directo marcado con FAM (FAM-FX-F), que se hibrida corriente arriba de la region de repeticion CGG, puede amplificar una pluralidad de productos de PCR. El amplicon CGG mas corto tendra 4 repeticiones de CGG y el amplicon CGG mas largo comprendera la longitud completa de la sec. con num. de ident.: 40. Todos los productos que son significativamente mas largos que los productos de longitud completa se consideran productos no espedficos.
Las Figuras 2A y 2B muestran electroferogramas de los resultados de la PCR a partir de 5 muestras clmicas (AFM104, AFB107, ABB001, AFB011 y AMB12, como se indica en las areas de trazado en la Figura 2A y el panel superior izquierdo de la Figura 2B) y tres patrones de Coriell (31/46 CGG, 31/54 CGG, y 30/75 CGG, como se indica en las areas de trazado de la Figura 2B diferentes de la parte superior izquierda). Para las muestras clmicas, la secuencia de las regiones ricas en CGG segun se determina por la secuenciacion se ordena en las areas de trazado. Para los patrones de Coriell, el contenido de repeticion CGG de los dos alelos 5' UTR' de FMR1 presentes en la muestra como se indico
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por el electroferograma se clasifica como "Confirmado". Los picos seleccionados se etiquetan con el numero de trinucleotidos CGG comprendidos por el producto correspondiente al pico. Las unidades en el eje vertical representan la intensidad de fluorescencia y son arbitrarias. Las unidades en el eje horizontal representan el tamano estimado en nucleotidos. Estos tamanos estimados se determinaron sobre la base del numero de exploracion (relacionado con el tiempo de retencion) del instrumento de la CE.
Las Figuras 3Ay 3B muestran electroferogramas de los resultados de PCR de ocho patrones de Coriell. En cada uno, el pico correspondiente al numero maximo detectado de trinucleotidos CGG se indica cuando fue soluble. En los casos en que el numero de trinucleotidos difiere de la designacion Coriell o cuando se detectan trinucleotidos AGG, se indica la secuencia deducida del electroferograma en el area de trazado. En el panel superior derecho de la Figura 3B, no pudieron resolverse todos los picos correspondientes a especies de productos individuales, pero la posicion del pico mas a la derecha correspondio a un contenido estimado de 122 trinucleotidos CGG. En los dos paneles inferiores, no se detecto la amplificacion de los productos cercanos a la longitud total de los alelos mas largos. Las etiquetas de los ejes horizontal y vertical son como en la Figura 2A.
La Figura 4 representa un ensayo usando tres iniciadores. FMR1R-FAM se hibrida corriente abajo de la region de repeticion CGG y comprende un fluoroforo FAM, para uso en la deteccion de productos. El iniciador quimerico comprende repeticiones de CGG y ademas, una aleta 5' que coincide con la secuencia del tercer iniciador, en este caso FMR1-F, que se hibrida con el molde original como se indica, pero hibrida tambien con los productos que comprenden la secuencia iniciadora quimerica. El iniciador quimerico se proporciona a una concentracion menor tal que se consume rapidamente para limitar la reduccion progresiva en el tamano del producto de ciclo a ciclo.
La Figura 5 muestra electroferogramas de PCR de un ensayo de tres iniciadores de los patrones de Coriell heterocigoticos indicados en cada area de trazado. Las etiquetas de los ejes horizontal y vertical son como en la Figura 2A. En cada panel, el pico mas alto corresponde al menor de los dos alelos presentes en la muestra y se indica de conformidad con el numero de repeticiones de CGG determinadas por este ensayo. Se contaron picos hasta el pico 190, que se muestra como una ampliacion de la insercion.
La Figura 6 muestra los electroferogramas de los resultados de PCR a partir de cinco muestras de ADN genomico (paneles A, B, C, D y E). Los paneles A, B y C se derivan de muestras de ADN genomico masculino. Los paneles D y E se derivan de muestras de ADN genomico femenino. Los picos seleccionados se etiquetan con el numero de trinucleotidos CGG comprendidos por el producto correspondiente al pico. Las secuencias previstas de los alelos genomicos se enumeran en las areas de trazado. Las unidades en el eje vertical representan la intensidad de fluorescencia y son arbitrarias. Las unidades en el eje horizontal representan el tamano estimado en nucleotidos. Como se describe en los Ejemplos, se determino que las muestras que se usaron para generar los perfiles de los paneles A-E tienen regiones de repeticion CGG con las siguientes secuencias. Panel A: 5'-(CGG)ioAGG(CGG)gAGG(CGG)g-3' (sec. con num. de ident.:46). Panel B: 5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)27-3' (sec. con num. de ident.:47). Panel C: 5'- (CGG)6i-3' (sec. con num. de ident.:48). Panel D: 5'-(CGG)2o-3' (sec. con num. de ident.:49) y 5'- (CGG)ioAGG(CGG)gAGG(CGG)io-3' (sec. con num. de ident.:50). Panel E: 5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.:51) y 5'-(CGG)ioAGG(CGG)86-3' (sec. con num. de ident.:46).
La Figura 7 muestra los electroferogramas de la CE previstos (paneles superior e inferior lateral izquierdo) para dos asignaciones de repeticion AGG diferentes para diferentes alelos (panel superior, 5'-(CGG)gAGG(CGG)io-3' (sec. con num. de ident.:53) y 5'-(CGG)ioAGG(CGG)2o-3' (sec. con num. de ident.: 54); panel inferior, 5'-(CGG)2o-3' (sec. con num. de ident.:4g) y 5'-(CGG)ioAGG(CGG)gAGG(CGG)io-3' (sec. con num. de ident.:5o)) y un electroferograma de CE de simulacion para productos de amplificacion de ambos alelos (panel inferior derecho). El electroferograma de CE observado se muestra en el panel superior derecho.
La Figura 8 representa ocho ensayos de amplificacion que pueden usarse en los metodos de la invencion. FMRi_F hibrida corriente arriba de la region de repeticion CGG. FMRi_R hibrida corriente abajo de la region de repeticion CGG. FMRi_F_FAM y FMRi_R_FAM se corresponden con los mismos dos iniciadores respectivamente, pero que comprenden un fluoroforo FAM, para uso en la deteccion de productos. FMRi_F_(CGG)n es un iniciador quimerico que comprende repeticiones de CGG y una solapa 5' que coincide con la secuencia de FMRi_F, que se hibrida con el molde original como se indica e hibrida tambien a productos que comprenden la secuencia iniciadora quimerica. El iniciador quimerico puede proporcionarse a una concentracion menor de modo que se consume rapidamente, para limitar la reduccion progresiva en el tamano del producto de ciclo a ciclo. FMRi_R_(CCG)n es un iniciador quimerico que comprende repeticiones CCG y una solapa 5' que coincide con la secuencia de FMRi_R, que se hibrida con el molde original como se indica e hibrida tambien a productos que comprenden la secuencia iniciadora quimerica. FMRi_F_(CGG)nA es un iniciador quimerico correspondiente a FMRi_F_(CGG)n pero que tiene ademas un dA terminal 3'. El dA terminal 3' se hibrida al T en la cadena de ADN en la region de complementariedad con la secuencia AGG presente en algunas regiones de repeticion CGG. FMRi_R_(CCG)nCCT es un iniciador quimerico con la misma secuencia que FMRi_R_(CCG)n pero tambien tiene un dCdCdT terminal 3'. El dCdCdT terminal se hibrida con la secuencia de AGG presente en la cadena de ADN complementaria en algunas regiones de repeticion CGG. Las secuencias de iniciadores usadas para estos ensayos pueden ser, por ejemplo:
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FMR1_F
TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (sec. con num. de ident.:14)
FMR1_F_FAM
5'-FAM-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (sec. con num. de ident.:14)
FMR1_F_(CGG)5
TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACGGCGGCGGCGGCGG (sec. con num. de ident.: 41).
n=5
FMR1_R
AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (sec. con num. de ident.:37)
FMR1_R_FAM
5'-FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (sec. con num. de ident.:37)
FMR1_R_(CCG)5
AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCCCGCCGCCGCCGCCG (sec. con num. de ident.:43)
n=5
FMR1_F_(CGG)gA
TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACGGCGGCGGCGGCGGA (sec. con num de ident.: 44)
n=5
FMR1_R_(CCG)4CCT
AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCCCCGCCGCCGCCGCCT (sec. con num. de ident.: 45)
n=4
Las secuencias FMR_F y FMR_R mostradas pueden sustituirse por cualquier otra secuencia de iniciador adecuada de las regiones 5 'y 3' que flanquean las repeticiones de CGG, respectivamente.
La Figura 9 describe la amplificacion de un molde rico en CGG que comprende trinucleotidos AGG, de conformidad con el esquema de PCR mostrado en la Figura 8H. Las porciones superior e inferior de la figura representan dos posibles configuraciones de alelos presentes en la muestra de ADN genomico cuyo electroferograma de CE real se muestra en la Figura 6D. La porcion superior describe la amplificacion de dos alelos incluyendo un alelo de 31 repeticiones que tiene una secuencia AGG presente despues de la 10ma repeticion CGG (5'-(cGg)ioAGG(CGG)2o3' (sec. con num. de ident.:54)) y un alelo de 20 repeticiones que tiene un AGG presente despues de la 9na repeticion de CGG (5'- (CGG)gAGG(CGG)io-3' (sec. con num. de ident.:53)). La porcion inferior describe la amplificacion de dos alelos que incluyen un alelo de 20 repeticiones que no tiene secuencia AGG dentro de las repeticiones de CGG (5'-(CGG)2o-3' (sec. con num. de ident.: 49)) y un alelo de 31 repeticiones que tiene un AGG presente en la posicion de repeticion 11 y un AGG en la posicion de repeticion 21 (5'-(CGG)1oAGG(CGG)gAGG(CGG)1o-3' (sec. con num. de ident.: 50)). El panel de la derecha muestra un electroferograma de CE real de productos de amplificacion de la muestra de ADN genomico, que demuestra la presencia de productos de amplificacion que representan la configuracion del alelo en la porcion inferior de la figura.
La Figura 10 muestra electroferogramas simulados de la CE de productos de amplificacion de alelos que se generan mediante el esquema de PCR mostrado en la Figura 8B a partir de la muestra de ADN genomico cuyo electroferograma de CE real se muestra en la Figura 6E y que contiene alelos que tienen 46 y 97 repeticiones de cGg. Despues de la amplificacion de conformidad con el esquema de PCR de la Figura 8B, dos configuraciones de alelos posibles (paneles de la izquierda, 5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 51) y 5'-(CGG)1oAGG(CGG)s6-3' (sec. con num. de ident.: 52); paneles de la derecha, 5'-(CGG)46-3' (sec. con num. de ident.: 55) y 5'- (CGG)1oAGG(CGG)4gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 56)) pueden generar electroferogramas de la CE identicos como se muestra en los paneles inferiores izquierdo y derecho y en la Figura 6E.
La Figura 11 muestra electroferogramas simulados de la CE de productos de amplificacion de alelos que pueden generarse mediante el esquema de PCR mostrado en la Figura 8D a partir de la muestra de ADN genomico cuyo electroferograma de CE real se muestra en la Figura 6E y que contiene alelos que tienen 46 y g7 repeticiones de CGG. Esta figura simula los productos de amplificacion a partir de las dos posibles configuraciones de alelo (paneles de la izquierda, 5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 51) y 5'-(CGG)1oAGG(CGG)s6-3' (sec. con num. de ident.: 52); paneles de la derecha, 5'-(CGG)46-3' (sec. con num. de ident.: 55) y 5'- (CGG)1oAGG(CGG)4gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 56)), seguido la amplificacion por el esquema de ensayo de PCR mostrado en la Figura 8D, en el que se invierte la direccionalidad del iniciador de repeticion (FMR_R_(CCG)n). Los dos alelos pueden generar escenarios de diferentes perfiles de la CE (Figura 11, paneles inferiores).
La Figura 12 muestra un electroferograma de CE real de los productos de amplificacion de alelos de la misma muestra de ADN genomico descrita en las descripciones de las Figuras 10 y 11 anteriores (que contienen el alelo de 46^7 repeticiones CGG). Los electroferogramas de la CE se generaron a partir de muestras amplificadas de conformidad con el esquema de ensayo de PCR en la Figura 8B (panel superior) o Figura 8F (panel inferior).
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La Figura 13 muestra esquematicamente los productos de amplificacion esperados de la misma muestra de ADN genomico descrita en las descripciones de las Figuras 10, 11 y 12 anteriores (que contienen el alelo de 46/97 repeticiones CGG) (5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 51), 5'-(CGG)10AGG(CGG)86-3' (sec. con num. de ident.: 52), 5'-(CGG)46-3' (sec. con num. de ident.: 55), y 5'-(CGG)10AGG(CGG)4gAGG(CGG)gAGG(CGG)26- 3' (sec. con num. de ident.: 56)), despues de la amplificacion por el esquema de ensayo de PCR mostrado en la Figura 8F.
La Figura 14 muestra esquematicamente los productos de amplificacion que pueden esperarse usando el esquema de ensayo de PCR de la Figura 8H, despues de la amplificacion de genomica ADN (descrito en las descripciones de las Figuras 10-13 anteriores y que contiene el alelo de 46/97 repeticiones de CGG) con dos alelos en escenarios diferentes (parte superior de la figura: 5'-(CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 51) y 5'- (CGG)-ioAGg(CGG)86-3' (sec. con num. de ident.: 52); porcion inferior de la figura: 5'-(CGG)46-3' (sec. con num. de ident.: 55) y 5-(CGG)-ioAGG(CGG)4gAGG(CGG)gAGG(cGG)26-3' (sec. con num. de ident.: 56)). El ensayo de PCR de la Figura 8H utiliza un iniciador dT anclado de orientacion inversa (FMR1_R_(CCG)nCCT) (Figura 8H). Este ensayo debe producir un electroferograma de CE con picos de 14, 15 y 24 CGG de tamanos equivalentes para el escenario de alelos representado en la parte superior de la figura, en el que el alelo de 46 repeticiones tiene dos AGG y el alelo de g7 repeticiones tiene un AGG, o el ensayo debe producir un electroferograma de CE con picos de 15, 65 y 75 CGG de tamanos equivalentes para el escenario de alelos representado en la porcion inferior de la figura, en el que el alelo de 46 repeticiones no tiene AGG y el alelo de g7 repeticiones tiene las tres AGG. La figura muestra tambien el electroferograma de CE real (porcion superior derecha de la figura) despues de la amplificacion de esta muestra de ADN genomico. El electroferograma es consistente con el alelo en el escenario mostrado en la parte superior izquierda de la figura.
La Figura 15 representa electroferogramas de la CE despues de la amplificacion de muestras de ADN genomico y muestras de ADN genomico mixto, de conformidad con el metodo de ensayo de la invencion mostrado en la Figura 8C. Se analizaron por separado dos muestras de ADN diferentes, una con un alelo de 30 repeticiones de CGG (panel A) y otra con un alelo de 645 repeticiones de CGG (panel B). Tambien se analizo una combinacion artificial de ADN cromosomico de estas dos muestras (panel C) para demostrar que el metodo era capaz de mapear la presencia o ausencia de trinucleotidos AGG cerca del extremo 5' de repeticiones de CGG largas en presencia de un alelo mas corto que tiene insertos del trinucleotido AGG.
La Figura 16 muestra electroferogramas de la CE despues de la amplificacion del ADN cromosomico de la muestra 20 (Tabla 4). La muestra tiene dos alelos principales, uno de los cuales es un alelo de mutacion completa y dos alelos menores. Se cree que la configuracion del alelo se deriva de una poblacion de celulas en mosaico dentro de la muestra. Panel A, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8A. Panel B, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8H. Panel C, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8D. Ademas de demostrar las capacidades de mapeo de AGG/CGG de los ensayos, los datos demuestran tambien la presencia de un trinucleotido AGG en un alelo de mutacion completa.
La Figura 17 muestra electroferogramas de la CE despues de la amplificacion del ADN cromosomico de la muestra 27 (Tabla 4). Panel A, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8A. Panel B, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8H. Panel C, productos de amplificacion despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8C. Tenga en cuenta que el Panel C se muestra a una escala mas cercana que el Panel A, de modo que la region donde podna aparecer el pico de longitud completa no esta visible.
La Figura 18 muestra electroferogramas de la CE despues de la amplificacion del ADN cromosomico de la muestra 6 y 20 (Tabla 4). Los paneles A y B muestran los productos de amplificacion de las muestras 6 y 20 respectivamente, despues de la amplificacion por PCR mediante el esquema mostrado en la Figura 8F. Como se describe en los Ejemplos, las muestras que se usaron para generar los perfiles de los paneles A-E se determinaron que tienen regiones de repeticion CGG en mosaico, compuestas de las siguientes secuencias de repeticion CGG. Panel A: 5'- (CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)g-3' (sec. con num. de ident.:57), 5'-(CGG)gAGG(CGG)7AGG(CGG)24-3' (sec. con num. de ident.:58) (alelo menor), y 5'-(CGG)gAGG(CGG)7AGG(CGG)42-3' (sec. con num. de ident.:5g). Panel B: 5'- (CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)g-3' (sec. con num. de ident.:57), 5'-(CGG)gAGG(CGG)44-3' (sec. con num. de ident.: 60) y 5'-(CGG)gAGG(CGG)60-3' (sec. con num. de ident.: 61).
La Figura 1g representa un flujo de trabajo para mapear trinucleotidos AGG dentro de repeticiones de CGG en la region 5' no traducida de los genes FMR1 y FMR2. Los ensayos A, C, G y F se refieren a ensayos de PCR correspondientes mostrados en la Figura 8.
Ejemplos
Se hara referencia en detalle a modalidades de la invencion, cuyos aspectos y resultados se ilustran en los dibujos que se acompanan. A los efectos de una mayor claridad y continuidad, se proporcionan a continuacion varios segmentos de
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la discusion e interpretacion de los metodos y resultados de ciertos ejemplos; la presentacion de ejemplos se resume siguiendo estos segmentos.
Ejemplo 1: Determinacion del numero de repeticion CGG y la posicion AGG en el promotor FMR1 para los alelos de premutacion normales y bajos mediante un ensayo de PCR con iniciador de repeticion y electroforesis capilar de alta resolucion
Ocho muestras de ADN genomico que contienen numeros de premutacion normal a baja de repeticiones de CGG (5 muestras clmicas: AFM104, AFB107, ABB001, AFB011, y AMB12; y tres patrones Coriell: 31/46 CGG, 31/54 CGG y 30/75 CGG) se evaluaron de la siguiente manera. Se usaron iniciadores de sec. con nums. de ident.: 38-39. Las condiciones de reaccion de PCR que se usaron se basaron en un protocolo publicado (Saluto y otros, J. Mol. Diagn. 7: 605-12 (2005)) con ligeras modificaciones. 15 a 20 ng de ADN genomico se amplificaron en un regulador de reaccion que contiene regulador de PCR 2 para molde de ampliacion Roche (num. de catalogo Roche 11681834001) mas 2,2 M de betama (num. de catalogo Sigma B0300-1VL), 250 |jM de cada dNTP (Roche, grado GMP num. de catalogo G 04631129103, C 04631072103, A 04631056103, T 04631137103), 1,5 jM de cada iniciador, y 1,25 U de Taq recombinante de ADN polimerasa Roche GMA (Roche, num. de catalogo 03734935001), en un volumen de reaccion de 15 jl. Las condiciones de ciclacion por PCR fueron 95°C durante 5 min; despues 10 ciclos de 97°C durante 35 sec - 62°C durante 35 seg - 68°C durante 4 min; despues 20 ciclos de 97°C durante 35 seg - 62°C durante 35 seg - 68°C durante 4 min con 20 seg de auto-extension por ciclo. 1 jl de productos de PCR se mezclaron con 2 jl de patron ROX 1007 (preparado de conformidad con DeWoody y otros, Biotechniques 37:348, 350, 352 (2004)) en 12 jl de formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems (ABI) num. de parte 4311320) y se desnaturalizo por calor a 95°C durante 2 min antes de la electroforesis capilar en un instrumento ABI 3130xl con una longitud capilar de 36 cm usando el polfmero lfquido POP7 (ABI num. de parte 4352759). Los electroferogramas resultantes se muestran en las Figuras 2A y 2B.
Los picos en los electroferogramas se numeraron comenzando con 4, el contenido mmimo de producto CGG posible. Una reduccion severa en la intensidad maxima desde el pico n a n+1, por ejemplo, desde el pico 10 a 11, indico la presencia de un trinucleotido AGG en la posicion correspondiente al pico n+1. Un trinucleotido resulto cuatro picos de baja intensidad, que se cree que sean porque el trinucleotido AGG redujo la afinidad del iniciador que contiene CGG para las cuatro posiciones de union que abarcan ese trinucleotido (recuerde que el iniciador con la secuencia de sec. con num. de ident.: 39, contiene cuatro repeticiones de CGG). El numero total de trinucleotidos se determino contando el numero total de picos, siendo el primero numerado como 4 se describio anteriormente. Se cree que el pico pequeno a la derecha de cada panel de la Figura 2A y en el panel superior izquierdo de la Figura 2B resulta de sucesos de hibridacion en donde, solo se hibridan 3 repeticiones de CGG del iniciador y molde y por lo tanto no refleja la longitud real del molde. Se confirmaron mediante tecnicas estandar el contenido total de repeticion y las localizaciones de repeticion de trinucleotidos AGG secuenciando las cinco muestras clmicas (ver Tabla 1). Para las cinco muestras clmicas, los resultados obtenidos a traves del metodo descrito coincidieron con los resultados obtenidos a traves de la secuenciacion.
Tabla 1
ID de la muestra
Fuente # de CGG posicion AGG determinada por secuenciacion posicion AGG determinada por repeticion de PCR # de CGG determinado por repeticion de PCR
AFM104
Lavado bucal donante#4 Asuragen 30/30 11, 21 11, 21 30
AFB107
donante de sangre Asuragen#7 30/30 11, 21 11, 21 30
AMB001
donante de sangre Asuragen#1 29 10, 20 10, 20 29
AMB011
donante de sangre Asuragen#11 29 10, 20 10, 20 29
AMB012
donante de sangre Asuragen#12 37 10, 18, 28 10, 18, 28 37
NA20234
Coriell 31 N/A 31
46 N/A 46
NA20236
Coriell 31 N/A 31
54 N/A 54
NA20242
Coriell 30 N/A 30
73 N/A 75
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Ejemplo 2: Dificultad para determinar el numero y posicion de la repeticion en algunos alelos largos de muestras femeninas con el ensayo de PCR con iniciacion de dos iniciadores de repeticion
Para evaluar este ensayo con muestras que comprenden repeticiones de CGG desde el intervalo normal hasta la completa mutacion, otro conjunto de ocho muestras, a saber, dos muestras clmicas de sangre completa (ID de las muestras 00100 y 00065, correspondientes a los paneles de la Figura 3 marcados con CGG 69 y CGG 87) y seis muestras de ADN genomico de lmea celular Coriell (con designaciones Coriell que indican CGG 56, 76, 96, 118, 20/183- 193 y 28/336). Las reacciones de PCR se realizaron como se describe en el Ejemplo 1. Los electroferogramas resultantes se muestran en las Figuras 3A-3B. En estos electroferogramas, el pico final a contar se determino mediante inspeccion visual. Para las seis muestras masculinas (todos los paneles de la Figura 3A y los dos paneles superiores de la Figura 3B), este ensayo fue capaz de determinar tanto el tamano (numero de repeticion) como la posicion de los trinucleotidos AGG (ver tabla 2). Los numeros repetidos coincidieron con las designaciones de Coriell o el numero obtenido mediante secuenciacion hasta un 4%. El ensayo no pudo detectar el numero total de repeticiones presentes en los alelos mas largos de las muestras femeninas (paneles inferiores de la Figura 3B).
Tabla 2
ID de la muestra
Fuente # de CGG posicion AGG determinada por secuenciacion posicion AGG determinada por repeticion de PCR # de CGG determinado por repeticion de PCR
CD00014
Lmea Coriell celular 56 11,21 11,21 57
00100
Sangre 69 N/A num de AGG 69
NA20231
Lmea Coriell celular 76 11 11 78
00065
Sangre 87 N/A num de AGG 87
NA06906
Lmea Coriell celular 96 11 11 100
NA06891
Lmea Coriell celular 118 11 11 122
NA20239
Lmea Coriell celular 20/182-193 N/A 11 (20 CGG) 20/>60
NA07537
Lmea Coriell celular 28/336 N/A 10, 20 (29 CGG) 29>50
Ejemplo 3: Determinacion del numero de repeticion CGG y de la posicion AGG en alelos de premutacion y mutacion completa usando el sistema modificado detres iniciadores para la PCR con iniciador de repeticion
Para aumentar el numero de repeticiones que se pueden detectar, el procedimiento se modifico como se indica en la Figura 4. Se usaron tres iniciadores. El primer iniciador fue un iniciador quimerico que contema 5 repeticiones de CGG en el extremo 3' y tema la secuencia de sec. con num. de ident.: 41. El segundo iniciador fue un iniciador inverso con relacion al primer iniciador; este segundo iniciador tema la secuencia de sec. con num. de ident.: 37. El tercer iniciador se oriento hacia delante con respecto al iniciador quimerico y tema la misma secuencia que el iniciador quimerico pero sin las 5 repeticiones de CGG. El iniciador quimerico se proporciono a una concentracion, 1,5 nM, aproximadamente 1000 veces por debajo de las del segundo y tercer iniciador (cada uno a 1,5 jM), de tal manera que el iniciador quimerico puede agotarse dentro de los primeros ciclos de la PCR. Las otras condiciones fueron como en el Ejemplo 1. Este procedimiento, realizado con moldes como se indica en la Figura 5, resulto en productos que se obtinen y que tuvieron aproximadamente 196-199 repeticiones en el experimento representado en el panel superior. Este valor fue cercano, pero ligeramente superior, a la designacion Coriell de 183-193 repeticiones de CGG. En el experimento representado en el panel inferior, se observo un pico muy a la derecha del electroferograma, marcado 336 repeticiones de CGG de conformidad con la designacion de Coriell. El numero de repeticion aparente fue entre 250-300 repeticiones, pero este tamano aparente no se considero preciso porque se cree que el tamano de este producto no esta dentro del intervalo en donde la CE a base del polfmero POP-7 puede resolver con precision los productos que contienen la repeticion CGG de acuerdo con el tamano. Con la CE a base del polfmero POP-7, los productos que contienen aproximadamente mas de 200 repeticiones de CGG tienden a tener un tamano aparente artificialmente acortado. Asf, este resultado indico que el pico representaba un producto con un numero de repeticion no menor de 250. En ambos paneles, se observaron picos en la posicion aproximada esperada para un producto con el numero de repeticion indicado por los alelos mas cortos enumerados en las designaciones Coriell, siendo estas designaciones 20 para el panel superior y 28 para el panel inferior (el pico grande mostrado en este panel corresponde a un numero de repeticion de 29). En cada panel, el pico correspondiente al alelo mas largo (numeros de repeticion designados por Coriell 183-193
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y 336) fue mas amplio que los picos para los productos que contienen numeros de repeticion individuals. El ancho del pico 183-193 de cGg en el panel superior de la Figura 5 parece ser aproximadamente 5-10 repeticiones de CGG o 1530 pb. Observese que el pico mas a la izquierda en cada electroferograma de la Figura 5 corresponde a 5 CGG, debido al iniciador quimerico que contiene 5 repeticiones de CGG.
Ejemplo 4: Determinacion de la localizacion AGG dentro de las repeticiones de CGG del promotor de FMR1 en los alelos masculinos mediante un sistema modificado de tres iniciadores para la PCR con iniciador de repeticion
Se evaluaron cinco muestras de ADN genomico que contienen alelos con un numero de repeticiones de CGG en el intervalo de pre-mutacion normal a bajo (30 CGG, 47 CGG, 61 CGG, 20/31 CGG y 46/97 CgG). Para mayor brevedad, los numeros de repeticiones de CgG enumeradas reflejan el numero total de trinucleotidos, es decir, la suma del numero de trinucleotidos CGG y el numero de trinucleotidos AGG de interrupcion. Las muestras se amplificaron por PCR mediante la preparacion de una mezcla maestra que contiene 11,45 pl de regulador de AMP rico en GC (Asuragen num. de catalogo #49387), 1,5 pl de iniciadores de FMR1 marcados con FAM (Asuragen num. de catalogo #49386; FMR1_F (sec. con num. de ident.: 14), FMR1_R_FAM (sec. con num. de ident.: 37 que tiene un 5'FAM)), 0,5 pl FMR1_F_(CGG)n (sec. con num. de ident.: 41) (Asuragen num. de catalogo #49393), 0,5 pl agua libre de nucleasa, y 0,05 pl mezcla de polimerasa rica en GC (Asuragen num. de catalogo #49388) de Asuragen Inc. (Austin, TX, EE.UU.). La mezcla principal de PCR se agito en vortice antes de dispensarse en una placa de microtitulacion (placas de 96 o 384 pocillos, Phenix Research Products, Candler, NC, EE.UU.). Las concentraciones finales de reaccion de FMR_F y FMR_R_FAM fueron 1,3 pM, y la concentracion final de reaccion de FMR1_F_ (CGG)n fue 1,3 nM. Alfcuotas de las muestras de ADN genomico, tipicamente 1 pl a 20 ng/pl, se transfirieron a cada pocillo de la placa de microvaloracion. Se utilizaron hojas de pelfcula de aluminio ABgene (Thermo Fisher Scientific) para sellar las placas. Las placas selladas se sometieron a vortice, se centrifugaron y se transfirieron a un termociclador (Sistema de PCR GeneAmp® 9700, Applied Biosystems™, Foster City, CA, EE.UU.). Las muestras se amplificaron con una etapa de desnaturalizacion termica inicial de 95°C durante 5 min, seguido por 10 ciclos de 97°C durante 35 segundos, 62°C durante 35 segundos, 68°C durante 4 min y luego 20 ciclos de 97°C durante 35 segundos, 62°C durante 35 segundos y 68°C durante 4 min con una extension automatica de 20 segundos en cada ciclo. La etapa de extension final fue 72°C durante 10 min. Este sistema de tres iniciadores para ensayar repeticiones de CGG se representa esquematicamente en la Figura 4 y la Figura 8A.
Despues de la PCR, las muestras se almacenaron a -15 hasta -30°C (protegidas de la luz antes del analisis) o se usaron inmediatamente para el analisis del producto de amplificacion por electroforesis capilar (CE). Para la CE, los productos de PCR (1 pl) se mezclaron con 2 pl de patron rOx 1007 (preparado de conformidad con DeWoody y otros, Biotechniques 37:348, 350, 352 (2004)) en 12 pl de formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems (ABI) num. de parte 4311320) y se desnaturalizo por calor a 95°C durante 2 min antes de la electroforesis capilar en un instrumento ABI 3130xl con una longitud capilar de 36 cm usando el polfmero lfquido POP7 (ABI num. de parte 4352759). Los electroferogramas resultantes se muestran en la Figura 6.
Los picos en los electroferogramas se numeraron comenzando con 5, el contenido de repeticion CGG mmimo posible de productos de PCR, basado en el diseno del iniciador quimerico. Una reduccion severa en la intensidad maxima desde el pico n a n+1, (por ejemplo, en la Figura 6 panel A desde el pico 9 a 10,) indico la presencia de un trinucleotido AGG en la posicion correspondiente al pico n+1. Un trinucleotido AGG resulto de cinco picos de baja intensidad, que se cree sean porque el trinucleotido AGG redujo la afinidad del iniciador que contiene CGG para las cinco posiciones de union que abarcan ese trinucleotido (recuerde que el iniciador con la secuencia de sec. con num. de ident.: 41, contiene cinco repeticiones de CGG). El numero total de trinucleotidos CGG/AGG se determino contando el numero total de picos, siendo el primero numerado como 5 se describio anteriormente. Por ejemplo, el electroferograma de la Figura 6, panel A, perfila productos amplificados a partir de un molde hemicigoto masculino normal con 30 repeticiones de CGG/AGG. Tres conjuntos de picos bien definidos fueron evidentes en el lado izquierdo del trazado, correspondientes a los productos del iniciador de repeticion CGG. El pico mas a la izquierda se correspondio a productos con 5 CGG ya que el iniciador quimerico esta compuesto por 5 repeticiones de CGG complementarias. La interrupcion entre los primeros 5 picos y el siguiente conjunto de 5 picos mas intensos refleja la interferencia de una secuencia de intervencion AGG. Esta interrupcion fue equivalente a 5 repeticiones de CGG, es decir, la amplitud del iniciador quimerico cuando interroga cada posicion posible para la hibridacion (que esta, a su vez, comprometida con cada unidad de repeticion en el iniciador por desajustes entre la "C" del iniciador de repeticion CGG y la "T" dentro del complemento inverso (CCT) de la secuencia del interruptor AGG). El siguiente conjunto de 5 picos reflejo un marcado incremento en la intensidad de la senal cuando el iniciador quimerico se unio a sitios mas alla de la secuencia de interrupcion AGG. Entonces se encontro un segundo elemento AGG, y despues de la extension del iniciador a traves del ultimo conjunto de secuencias CGG, la senal del producto CGG se perdio por completo. Los datos de la CE indicaron la presencia de 30 repeticiones de CGG/AGG en este alelo. Despues de los amplicones repetidos, se observo una interrupcion en el electroferograma y el pico mas a la derecha fue una banda de producto muy intensa correspondiente al amplicon de longitud completa, producido a partir de los iniciadores FMR1-F y FMR1 R-fAm, que abarco el tramo de 30 cGg/AGG. Este perfil de la CE correspondio a una secuencia 5'-(CGG)10AGG(CGG)gAGG(CGG)g-3' (sec. con num. de ident.:46).
Se obtuvieron cuatro ejemplos adicionales de perfiles de producto de PCR a partir de los alelos FMR1 (Figura 6, paneles B-E). Se representan muestras masculinas en los paneles B y C y muestras femeninas en los paneles D y E. En cada caso, el pico espedfico del gen se midio en comparacion al tamano con un ADN de referencia (es decir, el
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10
15
20
25
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40
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65
patron ROX). Este tamano estuvo de acuerdo con el metodo libre de calibracion del conteo de picos de producto CGG descrito anteriormente. La precision de la cuantificacion de CGG usando este enfoque tambien se correlaciono bien con los resultados de Wilson y otros, (J Mol Diagn 10:2-12, 2008) usando materiales consensuales de X fragiles publicados. Usando la misma estrategia de analisis, las muestras B y C se descodificaron como (CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)27 (sec. con num. de ident.:47) y (CGG)61 (sec. con num. de ident.:48) (no AGG), respectivamente.
Discusion de las posibles interpretaciones de los resultados en las Figuras 6D-E, y ensayos reflejos para distinguirlos
Los resultados con muestras de ADN genomico de mujeres pueden ser mas complejos de interpretar. Por ejemplo, los resultados de la muestra presentados en la Figura 6, paneles D y E revelaron una combinacion de picos de intensidad media y alta. Este patron de producto reflejo la superposicion de dos poblaciones de productos de repeticion CGG, una de cada alelo. Las posiciones de AGG pueden determinarse a partir de la posicion de las dos senales "cafdas" (es decir, reducciones en la intensidad de la senal del pico) en el perfil heterocigotico. La unica diferencia con los perfiles de los alelos hemicigoticos masculinos es que la intensidad de la senal en la "cafda" nunca puede reducirse hasta la lmea base en la muestra femenina, porque en estos casos, los dos alelos femeninos no tuvieron trinucleotidos AGG en la misma posicion con relacion al extremo 3' del amplicon. Para la muestra mostrada en el panel D (alelo 20/31 CGG), la primera "cafda" de la intensidad de la senal AGG, entre los picos 10 y 16, nunca se redujo hasta la lmea de base, porque solo un alelo tuvo un trinucleotido AGG en esa posicion, mientras que otros tuvieron un trinucleotido CGG. Por el contrario, la segunda cafda de la senal regreso a la lmea de base porque el alelo 20 CGG termina en la posicion 20 y la segunda cafda de AGG junto con los picos CGG corriente abajo en el electroferograma pertenecieron unicamente al alelo 31 CGG. La unica ambiguedad en la presente descripcion era cual de los dos alelos tuvo el trinucleotido AGG identificado por la primera cafda de la senal. Basandose en la incidencia de haplotipos AGG conocidos, el caso mas probable es que el alelo muy corto (20 CGG) no contiene el AGG mientras que el alelo 31 CGG tiene dos AGG (como se muestra por las secuencias en el panel D). Sin embargo, el ensayo estandar de tres iniciadores con iniciador de repeticion CGG, solo, no puede determinar definitivamente que alelo contribuye a la primera cafda de AGG.
El analisis de la siguiente muestra (Figura 6, panel E) fue mas complejo. La traza de la CE mostro tres cafdas de AGG aparentes (flechas no marcadas). Usando el escenario mas probable basado en las estadfsticas de haplotipos, las dos cafdas de AGG en el lado izquierdo de la traza de la CE se pueden asignar al alelo de 46 repeticiones y la tercera cafda de AGG (flecha no marcada mas a la derecha) puede asignarse al alelo de 97 repeticiones. Como resultado, las secuencias alelo pueden ser (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26 y (CGG)10AGG(CGG)s6. Sin embargo, existen dos incertidumbres en esta secuencia. En primer lugar, cada uno de los trinucleotidos AGG identificados por las cafdas de senal, en teona, pueden asignarse a cualquiera de los dos alelos. Si los tres trinucleotidos AGG ocurren en el alelo de 97 repeticiones, y ninguno en el alelo de 46 repeticiones de CGG, las secuencias deducidas del trazado del electroferograma pueden ser (CGG)46 y (CGG)9AGG(CGG)60AGG(CGG)9AGG(CGG)26. Esta combinacion de secuencia puede generar el perfil de la CE identico al descrito anteriormente. En segundo lugar, el pico espedfico del gen completo del alelo de 46 repeticiones (el pico de intensidad muy alta cerca del centro de la traza de la CE) puede superponerse y oscurecer cualquier cafda de AGG en el alelo de 97 repeticiones. Asf, puede haber una cafda adicional de la senal de AGG dentro del alelo de 97 repeticiones que migra en la misma posicion en el electroferograma de CE que el alelo de 46 genes espedficos de longitud completa.
Se desarrollaron metodos adicionales para diferenciar las posibilidades de mapeo de AGG espedficas para los alelos 20/31 de CGG y 46/97 de CGG mostrados en el Ejemplo 4 (Figura 6 paneles D y E). El ejemplo 5 mas abajo demuestra la utilidad de los metodos de la invencion para resolver con precision estas incertidumbres.
Para la muestra de alelo 20/31 (Figura 6 panel D), dos asignaciones posibles de AGG a los alelos de 20 y 31 repeticiones se muestran en la Figura 7 (paneles de la izquierda). Se preve que ambos escenarios produciran electroferogramas de la CE identicos cuando los productos de amplificacion por PCR se separen por la CE (simulada en la Figura 7, panel inferior derecho). El perfil simulado de la CE de las dos configuraciones de alelos posibles (Figura 7, panel inferior derecho) estuvo de acuerdo con los resultados empmcos de la CE (Figura 7, panel superior derecho).
Aunque el ensayo estandar de tres iniciadores con iniciador de repeticion CGG (Figura 4, Figura 8A) no pudo distinguir el estado AGG de los dos alelos, se desarrollo un ensayo reflejo, representado esquematicamente en la Figura 8H, que puede distinguir entre el dos posibles escenarios de alelos, como se muestra en la Figura 9. Usando el ensayo de pCr mostrado en la Figura 8H, un electroferograma de CE para el escenario del primer alelo (es decir, cada alelo tiene un AGG, Figura 9, parte superior) pueden generarse dos picos adyacentes con equivalentes de tamano de 14 CGG y 15 CGG. Un electroferograma de CE para el segundo alelo, en el que el alelo mas corto de 20 repeticiones no tiene cGg y el alelo de 31 repeticiones tiene dos AGG (Figura 9, parte inferior), puede generar picos con equivalentes de tamano de 15 CGG y 25 cGg. En otro ejemplo (Figura 6, panel E), la muestra contuvo dos alelos que teman 46 y 97 repeticiones de CGG. Como se menciono anteriormente, el ensayo estandar de tres iniciadores con iniciador de repeticion CGG (Figura 4, Figura 8A) no puede diferenciar el contenido de AGG de los alelos espedficos. Los electroferogramas simulados de la CE de los productos de amplificacion de alelos para esta muestra se muestran en la Figura 10. Los paneles inferiores izquierdo y derecho de la Figura 10 revelan que el ensayo de PCR de tres iniciadores con iniciador de repeticion CGG es incapaz de resolver las dos posibles configuraciones de alelos. Sin embargo, cuando se usa un ensayo de PCR (Figura 8C) en el que se invierte la direccionalidad del iniciador de repeticion (FMR1_R_(CCG)n; sec.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
con num. de ident.: 43), se predice que los dos escenarios de alelos generan diferentes perfiles de la CE como se muestra en Figura 11, paneles inferiores.
Ejemplo 5: Ensayos de PCR para determinar la localizacion de AGG dentro de las repeticiones de CGG del promotor FMR1 en los alelos complejos femeninos
Se usaron las condiciones de PCR y CE en un ensayo reflejo de la muestra 20/31 de CGG de la Figura 6D que fueron identicos a los descritos en el Ejemplo 4 anterior excepto que se usaron diferentes iniciadores. La secuencia de iniciador directo fue FMR1_F_FAM (sec. con num. de ident.: 14) y el iniciador inverso fue un iniciador anclado que tiene un dT 3' terminal (Figura 8H, FMR_R_(CCG)nCCT, donde n=4; sec. con num. de ident.: 45). El perfil de la CE real para la muestra contuvo 15 y 25 picos de CGG (Figura 9, traza de la CE) confirmando que las dos secuencias de alelo fueron (CGG)20 (sec. con num. de ident.: 49) y (CGG)-ioAGG(CGG)gAGG(CGG)1o (sec. con num. de ident.: 50).
Cuando se realizo un ensayo de PCR en la muestra de 46/97 CGG de la Figura 6E con un diseno de dos iniciadores con iniciador de repeticion, representado esquematicamente en la Figura 8B, solamente tres cafdas de AGG estuvieron presentes en el perfil de la CE (Figura 12, parte superior del panel B, flechas sin marcar). Estos datos excluyeron la posibilidad de una 4ta cafda de AGG que se podfa superponer por el pico del gen espedfico del alelo de 46 repeticiones (Figura 6E). Tambien, cuando se realizo el ensayo de PCR anclado representado esquematicamente en la Figura 8F, se observaron tres picos de alelos CGG distintos, en las posiciones de repeticion CGG de 32, 42 y 92 (Figura 12, panel inferior F). Este resultado confirmo claramente que solo 3 AGG estuvieron presentes en los dos alelos.
Discusion
Sin embargo, ninguno de estos dos ensayos (Figura 8B, 8F) puede asignar definitivamente el numero de elementos AGG presentes en cada alelo. La Figura 13 explica por que esto es asf, el ensayo anclado del iniciador A (FMR1_F_(CGG)nA; sec. con num. de ident.: 44), mostrado en la Figura 8F y la Figura 13, podna generar resultados de la CE identicos para el escenario alelico (1) en el que el alelo de 46 repeticiones tiene dos AGG y el alelo de 97 repeticiones tiene un AGG (Figura 13, esquema superior) y para el escenario alelico (2) en el que el alelo de 46 repeticiones no tiene AGG y el alelo de 97 repeticiones tiene las tres AGG (Figura 13, esquema inferior). Sin embargo, cada AGG se puede asignar con precision al alelo apropiado utilizando un ensayo en el que la direccionalidad del iniciador CGG se invierta. Como se muestra en la Figura 14, un ensayo de PCR que utiliza un iniciador dT anclado de orientacion inversa (FMR1_R_(CCG)Ncct; sec. con num. de ident.: 45); (Figura 8H, Figura 14) debe producir un electroferograma de CE con picos equivalentes de tamano de CGG 14, 24, y 15 para el escenario alelico (1) o un electroferograma de CE con picos equivalentes de tamano de CGG 15, 65 y 75 para el escenario alelico (2). La Tabla 3 enumera todas las distribuciones AGG posibles en los dos alelos, junto con el tamano de pico CGG esperado despues de la separacion de la CE de los productos de amplificacion por PCR de este ensayo de iniciador dT anclado (Figura 8H).
Tabla 3
Picos de la CE (Equivalentes de repeticion de CGG)
posicion AGG en el alelo 46 posicion AGG en el alelo 97
CGG 15, 14, 24
(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26 (sec. con num. de ident.: 51) (CGG)10AGG(CGG)b6 (sec. con num. de ident.: 52)
CGG 15, 65, 24
(CGG)19AGG(CGG)26 (sec. con num. de ident.: 68) (CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)36 (sec. con num. de ident.: 69)
CGG 15, 14, 75
(CGG)9AGG(CGG)36 (sec. con num. de ident.: 70) (CGG)10AGG(CGG)59AGG(CGG)26 (sec. con num. de ident.: 71)
CGG 15, 65, 75
(CGG)46 (sec. con num. de ident.: 55) (CGG)10AGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26 (sec. con num. de ident.: 56)
Ejemplo 6: Determinacion de la distribucion AGG usando un ensayo anclado con un iniciador de CGG orientado de forma opuesta
Se realizo un ensayo de PCR como esquematizado en la Figura 8H sobre la muestra de 46/97 CGG de la Figura 6E con un iniciador dT anclado (FMR1_R_(CCG)nCCT; sec. con num. de ident.: 45). El perfil de la CE resultante (Figura 14) confirmo que el alelo de 46 repeticiones CGG tuvo dos AGG en las posiciones de repeticion 10 y 20; mientras que el alelo de 97 repeticiones CGG tiene un AGG en la posicion de repeticion 11 (contando de 5' a 3' a partir de la primera CGG, segun el consenso de la literatura). Asf, pueden usarse los ensayos de mapeo de la invencion para resolver patrones complejos de repeticion alelica de CGG/AGG en genes de FMR cromosomicos.
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 7: Determinacion del numero de repeticion de CGG y la posicion de AGG en alelos de mutacion normal y completa a partir de muestras femeninas utilizando un ensayo de PCR de orientacion inversa con iniciador de repeticion CCG
El numero de repeticiones CGG y la presencia y localizacion de trinucleotidos AGG, se analizaron para 29 muestras clmicas de ADN cromosomico usando el ensayo de PCR de tres iniciadores con iniciador de repeticion CGG (Figura 8A) y el ensayo de PCR inversa dT anclado (Figura 8H). Los metodos de PCR fueron como los descritos en los Ejemplos 4 y 5, excepto que se usaron iniciadores apropiados. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Los numeros de la posicion AGG siguen el consenso de la literatura para la numeracion. NA indica que no se detectaron trinucleotidos de AGG en ese alelo. Se cree que las muestras masculinas tienen mas de un alelo (1, 4, 17, 19, 25 y 26) y las muestras femeninas con mas de dos alelos (6 y 20) provienen de una poblacion de celulas en mosaico dentro de la muestra.
Tabla 4
ID de la muestra
Sexo Picos alelos de CE equivalentes de repeticion de CGG posicion de AGG
1
M >200 11
170
11
2
F 20 NA
31
11,21
3
M 47 10,20
4
M 154 NA
174
NA
>200
NA
5
M 61 NA
6
F 29 10,20
60
10,18
42**
10,18
7
M 51 11
8
F 31 11,21
47 12
9
F 30 11,21
50 10
10
M 46 10,20
11
F 30 11,21
49 10
12
M 54 10
13
M >200 11
14
F 19 NA
57 10,20
15
M 57 10,20
16
F 41 11,21,32
57 10,20
17
M 53 NA
>200 NA
152 NA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
18
F 30 11,21
60
10,20
19
M >200 12
61
NA
20
F 29 10,20
>200**
10
54**
10
90**
10
21
M 50 10
22
F 32 10,23
53
10
23
F 46 10,20
97
11
24
M 46 10,20
25
M 64 NA
>200
11
26
M 108 NA
>200
NA
27
F 30 11,21
>200**
0
28
M 58 10,20
29
F 29 10,20
59
10,20
Despues de la amplificacion por PCR con estos dos ensayos (Figura 8A, 8H) y el analisis de la CE, el numero de repeticiones CGG y el estado AGG de los alelos se determinaron positivamente para 26 de las 29 muestras. Estos dos formatos de ensayo no pudieron determinar positivamente el estado AGG para solo cinco alelos de este grupo. Estos alelos se designan con "**" en la Tabla 4 (alelo 42 CGG en la muestra 6; alelos 54 CGG, 90 CGG y >200 CGG en la muestra 20; alelo >200 CGG en la muestra 27). Se usaron metodos de ensayo adicionales de la invencion (Figura 8) para resolver el numero de repeticion CGG y el estado de AGG para esos alelos.
El analisis de CE de los productos de PCR revelo que dos muestras (20 y 27) tuvieron trinucleotidos AGG en uno de los alelos normales. Por ejemplo, en la muestra 20, los trinucleotidos AGG estan presentes en las posiciones 10 y 20 en el alelo 29 CGG. Es posible que otros alelos (por ejemplo, >200 CGG) que tienen trinucleotidos AGG en las mismas posiciones exactas (10, 20) no puedan detectarse por el ensayo con iniciador de repeticion CGG (Figuras 4, 8A) debido a que las cafdas de AGG que son mas que ~100 nucleotidos lejos del extremo 3' pueden ser diffciles de detectar debido a la baja intensidad de pico. Ademas, en esta situacion, el ensayo dT anclado (Figura 8H) puede generar picos identicos a los del alelo mas corto, si la localizacion AGG con respecto al extremo 5' de la region de repeticion CGG es identica en ambos alelos. La muestra 27 presenta una situacion similar en que los trinucleotidos AGG se identificaron en las posiciones 11 y 21 para el alelo 30 CGG, pero la presencia de un trinucleotido AGG en el alelo >200-CGG no puede determinarse sin ambiguedad.
Para resolver estos problemas, se diseno otro ensayo reflejo (Figura 8C). En una prueba de principio del experimento, se analizaron tres moldes de ADN genomico artificial (Instituto Coriell para la Investigacion Medica, Camden, NJ, EE.UU.) que tienen 30 repeticiones de CGG (NA07174), 645 repeticiones de CGG (NA04025) y 30/645 repeticiones de CGG (50% NA07174 y 50% NA04025). El ensayo de iniciador de repeticion CCG (Figura 8C) se realizo en la direccion inversa con los iniciadores FMR1_F_FAM, FMR1_R_(CCG)5 y FMR1_R (sec. con nums. de ident.: 14, 43, 37). La Figura 15, panel A muestra un electroferograma de CE producido a partir del alelo 30 CGG (NA07174). Se observaron dos trinucleotidos AGG, uno en la posicion 10 y otro en la posicion 20. El panel B de la Figura 15 muestra que no hubo trinucleotido AGG en el alelo 645 CGG (NA04025). Cuando las muestras cromosomicas que teman estos dos alelos se combinaron para imitar una muestra femenina de alelo 30/645, se observaron dos cafdas de AGG, pero la senal no se redujo a la lmea de base (Figura 15, panel C). Este resultado confirmo que el alelo CGG 30 tuvo dos trinucleotidos AGG
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10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en las posiciones 10 y 20, mientras que el alelo 645 CGG no contuvo ningun de los interruptores AGG en esas posiciones. Por lo tanto, este ensayo de PCR fue capaz de interrogar el extremo 5' de repeticiones largas, tales como el alelo 645 CGG, para determinar la presencia o ausencia de interruptores AGG.
Este ensayo se utilizo para analizar muestras clmicas 20 y 27, que tienen alelos de mutacion completa que contienen >200 repeticiones de CGG (Tabla 4). La Figura 16 muestra los resultados de la muestra 20. El panel A de la Figura 16 muestra un electroferograma de CE de los productos de PCR despues de la amplificacion con el ensayo de iniciacion CGG estandar (Figura 8A) con el iniciador de repeticion orientado en la direccion hacia delante. Se observaron dos AGG en las posiciones 10 y 20 (contando a partir del extremo 3' de las repeticiones CGG). Basandose en la incidencia de haplotipos, los AGG se situan normalmente en las posiciones 10, 11, 20 y 21, contando desde el extremo 5' de la region de repeticion CGG. ver, por ejemplo,Zhong y otros, Am. J. Hum. Genet. 57: 351-61 (1995); Kunst y otros, Am. J. Hum. Genet. 58:513-22 (1996); y Eichler y otros, Hum. Mol. Genet. 4:2199-208 (1995). La incidencia del haplotipo sugiere, por lo tanto, que los interruptores AGG estan presentes en el alelo 29 CGG. El panel B de la Figura 16 muestra un electroferograma de CE de los productos de PCR despues de la amplificacion de las mismas muestras usando el ensayo de dT anclado con dos iniciadores orientado en la direccion inversa (Figura 8H). Estos resultados confirmaron que los dos trinucleotidos AGG se localizaron en las posiciones 10 y 20 contando a partir del extremo 5' de la region de repeticion CGG. El analisis de los resultados en la Figura 16, paneles A y B revelo que dos trinucleotidos AGG se localizaron dentro del alelo 29 CGG, cuya region de repeticion CGG tema por lo tanto la secuencia (CGG)g(AGG)(CGG)gAGG(CGG)g (sec. con num. de ident.: 57). Una incertidumbre restante con esta muestra es que el alelo de mutacion completo (> 200 CGG) puede tener trinucleotidos AGG en las mismas posiciones (10, 20) a partir del extremo 5'. Si es asf, estas secuencias de AGG no pueden detectarse mediante un ensayo T anclado con orientacion inversa ni diferenciarse de las AGG en el alelo corto (debido a la distancia neta al iniciador directo y la correspondiente reduccion en la intensidad de senal observada para mapear los elementos de la secuencia 5'). Por lo tanto, se uso el ensayo de PCR mostrado en la Figura 8D, un ensayo de PCR de tres iniciadores con el iniciador de repeticion CCG en la direccion inversa, para resolver este problema. Los resultados del ensayo (Figura 16, panel C) confirmaron que el alelo CGG >200 tuvo un AGG en la posicion 10 desde el extremo 5' de las repeticiones CGG, ya que la senal cayo casi completamente hasta la lmea base en esa posicion. Asf, tanto el alelo 29 CGG como el alelo 200 CGG tuvieron trinucleotidos AGG en la posicion 10. No hubo AGG presente en la posicion 20 del alelo de mutacion completa (>200 CGG) debido a que la senal en ese lugar no se redujo hasta cerca de la lmea de base (Figura 16 panel C).
Discusion
Estos analisis demostraron la aparicion de los trinucleotidos AGG en alelos de mutacion completa. Se cree que esto contrasta con la posicion establecida de multiples expertos en el campo de que los interruptores AGG no se producen en los alelos de mutacion completa. Ademas, los metodos y ensayos de la invencion son capaces de detectar interruptores de trinucleotidos AGG cerca del extremo 5' de la region de repeticion CGG.
Ejemplo 8: Mapeo de los elementos del interruptor en la muestra 27
La Figura 17 muestra los resultados del mapeo de AGG obtenidos para la muestra 27 (Tabla 4). El panel A de la Figura 17 muestra un electroferograma de CE despues de la amplificacion con el ensayo estandar de iniciacion con CGG en la direccion directa (Figura 8A), que demostro que estuvieron presentes dos trinucleotidos AGG. El patron de pico CGG revelo dos AGG, uno en la posicion 10 y otro en la posicion 20 (desde el extremo 3' de las repeticiones CGG). Basandose en el conocimiento de los haplotipos comunes, las interrupciones AGG de las repeticiones CGG se colocan caractensticamente en las posiciones 10, 11, 20, y/o 21 contando desde el extremo 5' de las repeticiones CGG, lo que sugiere que las repeticiones AGG se presentan en el alelo 30 CGG en esta muestra. El panel B de la Figura 17 presenta los resultados del ensayo de PCR de dos iniciadores dT anclado, orientado en la direccion inversa (Figura 8H). Este ensayo confirmo que los dos trinucleotidos AGG estuvieron en las posiciones 11 y 21, contando desde el extremo 5' de las repeticiones CGG - (CGG^AGG^GG^AGG^GG^ (sec. con num. de ident.: 46). Una incertidumbre restante con esta muestra es que el alelo de mutacion completa (> 200 CGG) puede tener trinucleotidos AGG en las mismas posiciones que las del alelo de repeticion 30 CGG. El panel C de la Figura 17 ofrece los resultados del ensayo de PCR de tres iniciadores con iniciador CCG (Figura 8D) orientado en la direccion inversa. Este ensayo confirmo que el alelo >200 CGG no tiene AGG en la posicion 11 o 21, porque la cafda de AGG no se redujo hasta cerca de la lmea de base en estas dos posiciones.
Ejemplo 9: Resolucion de las posiciones de AGG para alelos de baja abundancia en muestras de mosaico usando un ensayo de PCR con anclaje A de orientacion directa
El analisis del ADN cromosomico de algunas muestras en la Tabla 4 revelo la presencia de alelos de baja abundancia en las muestras 6 y 20. Se cree que estos son alelos derivados de una poblacion de celulas en mosaico presentes en esas muestras. El ensayo de PCR de la invencion, dA anclado orientado hacia delante (Figura 8F) fue suficientemente sensible para detectar trinucleotidos AGG en la secuencia de estos alelos menores. Los resultados del ensayo dA anclado de dos iniciadores para las muestras 6 y 20 se muestran en la Figura 18. La amplificacion del ADN cromosomico de la muestra 6, usando el ensayo de PCR mostrado en la Figura 8F, y el posterior analisis de CE de los productos de PCR revelo cuatro picos principales, con longitudes de 15, 25, 48 y 56 repeticiones de CGG y dos picos menores, con longitudes de 30 y 38 repeticiones de CGG (Figura 18 panel A). Estas longitudes incluyen las cinco

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    Reivindicaciones
    1. Un metodo para analizar si una secuencia interruptor esta presente en al menos una region rica en CGG comprendida por al menos un molde en una muestra, que comprende:
    a) proporcionar al menos dos iniciadores diferentes, incluyendo un primer iniciador que comprende repeticiones CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC, y un segundo iniciador que se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG;
    b) realizar la PCR con al menos dos iniciadores diferentes y al menos un molde que comprende al menos una region rica en CGG, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
    c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
    d) derivar la informacion acerca de si una secuencia de interruptor esta presente en al menos una region rica en CGG o donde al menos dentro de una region rica en CGG se encuentra una secuencia de interruptor a partir de dicha representacion.
  2. 2. Un metodo para analizar si una secuencia interruptor esta presente en al menos una region rica en CGG comprendida por al menos un molde en una muestra, que comprende:
    a) proporcionar al menos tres iniciadores diferentes, incluyendo un primer iniciador que comprende repeticiones CGG, CCG, GCG, CGC, GCC, o GGC y una solapa 5', un segundo iniciador que se hibrida a una posicion fuera de la region rica en CGG y un tercer iniciador que tiene una secuencia comprendida por la solapa 5' del primer iniciador, en donde el primer iniciador se proporciona a una concentracion menor que el tercer iniciador;
    b) realizar la PCR con al menos tres iniciadores diferentes y al menos un molde, en donde la PCR produce un conjunto de productos;
    c) resolver el conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una representacion del tamano y la abundancia del producto; y
    d) derivar la informacion acerca de si una secuencia de interruptor esta presente en al menos una region rica en CGG o donde al menos dentro de una region rica en CGG se encuentra una secuencia de interruptor a partir de dicha representacion.
  3. 3. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de interruptor es un elemento AGG.
  4. 4. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas derivar la informacion sobre el numero de repeticiones CGG de dicha representacion que determina si la region de repeticion rica en CGG comprende mas o menos de 200 repeticiones CGG y opcionalmente determina el numero de repeticiones CGG presentes en la repeticion region rica en CGG.
  5. 5. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, con la condicion de que no se utilice un patron o calibrador externo en la derivacion de la informacion sobre si una secuencia de interrupcion esta presente en la region rica en CGG o cuando se localiza dentro de la region rica en CGG la secuencia de interrupcion a partir de dicha representacion.
  6. 6. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde derivar la informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en la region rica en CGG o donde se localiza una secuencia de interrupcion dentro de la region rica en CGG a partir de dicha representacion comprende determinar una o mas longitudes del producto en el que se reduce la cantidad de producto en al menos 50% en comparacion con la cantidad de productos de longitud vecinos, o en donde derivar informacion acerca de si una secuencia de interrupcion esta presente en la region rica en CGG o donde se localiza una secuencia de interrupcion dentro de la region rica en CGG a partir de dicha representacion, comprende determinar una o mas longitudes de producto en las que la cantidad de producto se reduce en al menos 25% en comparacion con la cantidad de productos de longitud vecinos, en donde la region rica en CGG es a partir de un individuo heterocigotico para el alelo que comprende la region rica en CGG.
  7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el metodo es un ensayo anclado y el primer iniciador comprende una seleccion subsiguiente de A, T, AG, CT, AGG y CCT entre o en el extremo 3' de las repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC.
  8. 8. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende proporcionar ademas al menos un primer iniciador adicional y opcionalmente un segundo iniciador adicional, el primer iniciador adicional que comprende repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC; realizar una segunda PCR con al menos el primer iniciador adicional, un iniciador seleccionado a partir del segundo iniciador de la etapa (a) y el segundo iniciador adicional, y la al menos una plantilla, en donde la segunda PCR produce un segundo conjunto de productos; Y resolver el segundo conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una segunda representacion del tamano y la abundancia del producto; en donde el primer iniciador de la etapa (a) tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica de CGG que no comprende un elemento de
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    interrupcion y en donde el primer iniciador adicional tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica en CGG que comprenden un elemento de interrupcion.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas, determinar al menos una longitud de al menos una region rica en CGG, en donde la muestra comprende el material genetico a partir de celulas que tienen una ploidfa de al menos 2 con respecto a la region CGG y el metodo comprende determinar al menos dos longitudes de al menos dos regiones ricas en CGG.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas, determinar si la muestra comprende alelos mayores y menores con elementos de interrupcion posicionados de forma diferente.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 8, que comprende ademas, proporcionar al menos un tercer iniciador adicional y opcionalmente un cuarto iniciador adicional, el tercer iniciador adicional que comprende repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC; realizar una tercera PCR con al menos el tercer iniciador adicional, un iniciador seleccionado a partir del segundo iniciador adicional y el cuarto iniciador adicional, y al menos un molde, en donde la tercera PCR produce un tercer conjunto de productos; y resolver el tercer conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una tercera representacion del tamano y la abundancia del producto; en donde el tercer iniciador adicional esta orientado de manera opuesta con relacion al primer iniciador de la etapa (a) y es diferente del primer iniciador adicional.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende ademas, determinar la presencia o ausencia de elementos de interrupcion dentro de 150 pb de cada extremo de al menos un alelo comprendido por la muestra.
  13. 13. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas, proporcionar ademas al menos un primer iniciador adicional y un segundo iniciador adicional, el primer iniciador adicional que comprende repeticiones de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC o GGC; realizar una segunda PCR con al menos el primer iniciador adicional y el segundo iniciador adicional, y al menos una plantilla, en donde la segunda PCR produce un segundo conjunto de productos; y resolver el segundo conjunto de productos con una tecnica de alta resolucion para producir una segunda representacion del tamano y la abundancia del producto; en donde el primer iniciador adicional esta orientado de manera opuesta con relacion al primer iniciador de la etapa (a).
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en donde el primer iniciador tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica de CGG que no comprende elementos de interrupcion, el primer iniciador adicional tiene una actividad de union preferencial para sitios en la region rica de CGG que comprende elementos de interrupcion, y la muestra comprende al menos dos alelos que comprenden regiones ricas en CGG de diferentes longitudes, el metodo ademas que comprende determinar las longitudes de al menos dos alelos y detectar al menos un elemento de interrupcion y determinar la longitud del alelo mediante el cual al menos esta comprendido un elemento de interrupcion.
  15. 15. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la region rica en CGG esta compuesta por un 5' UTR de FMR1 o 5' UTR de FMR2.
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