BRPI1013410B1 - Método de analisar se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em cgg compreendida por pelo menos um molde em uma amostra - Google Patents

Método de analisar se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em cgg compreendida por pelo menos um molde em uma amostra Download PDF

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Liangjing Chen
Sachin Sah
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Abstract

método de ánalise de pelo menos uma região rica em cgg compreendida por pelo menos um molde em uma amostra. a presente invenção refere-se a processos de determinação da presença e da posição de agg ou elementos de interrupção dentro de uma região de repetição com três nucleotídeos (por exemplo, cgg) e a processos de determinação do número de repetições presentes nesta região, através da amplificação de um conjunto de produtos com um conjunto de iniciadores do qual pelo menos um compreende uma parte da região de repetição de cgg e da resolução dos produtos para produzir uma representação de tamanho e abundância do produto.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos de Patentes Relacionados
[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente U.S. Provisório N° 61/162.977, depositado em 24 de março de 2009.
Descrição da Invenção Campo da Invenção
[0002] A presente invenção refere-se a campos de síntese e análise de DNA, particularmente em relação a moldes e produtos ricos em GC.
Descrição Geral
[0003] Uma vez que o primeiro isolamento de uma DNA polimerase e a determinação de condições sob as quais o DNA pode ser sintetizado in vitro, as reações de síntese de DNA foram amplamente utilizadas com finalidades de preparação e analíticas nas aplicações biotecnológicas, médicas e de pesquisa. A reação em cadeia da polimerase ou PCR é um tipo de reação de síntese de DNA através da qual uma sequência de DNA pode ser amplificada rapidamente e exponencialmente. Como outras reações de síntese em ciclos, esta envolve copiar repetidamente a sequência-alvo de uma maneira cíclica. Uma implementação típica da PCR envolve o fornecimento de iniciadores complementares às extremidades da sequência que será amplificada, um tampão adequado, um sal de magnésio, trifosfatos de desoxinucleotídeo (dNTPs) e uma DNA polimerase termofílica. O DNA molde ou alvo, contido, por exemplo, dentro de uma amostra de DNA genômico, é exposto a estes componentes em solução aquosa. A mistura é ciciada ao longo de etapas a temperaturas diferentes que promovem a desnaturação do molde, o anelamento dos iniciadores ao molde e então a extensão dos iniciadores pela polimerase, criando mais produto. Uma vez que o produto de cada ciclo está disponível como molde em reações subsequentes, a quantidade de produto aumenta aproximadamente exponencialmente até que os outros componentes de reação (inicialmente presente em excesso) sejam eliminados. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 4.683.202; M. J. McPherson & S. G. Moller, PCR: The Basics (2- Ed., Taylor & Francis) (2006).
[0004] A PCR, junto com outras formas de reações de síntese de ácidos nucleicos cíclicas, é uma ferramenta padronizada na biologia molecular, na biotecnologia e, de forma crescente, na medicina. As vantagens principais da PCR e técnicas relacionados são rapidez, baixo custo, sensibilidade, acessibilidade à análise de alto rendimento e versatilidade. As amplificações requerem apenas algumas horas ou menos, pequenas reações individuais podem consumir bem menos que o valor de um dólar americano em reagentes, a quantidade de molde requerida está tipicamente na faixa de nanograma, a automatização pode resultar na corrida de milhares de reações por dia por autômato e os iniciadores podem ser planejados para amplificar quase qualquer sequência.
[0005] A PCR e técnicas relacionadas são amplamente adotadas para aplicações tanto analíticas quanto de preparação. Uma aplicação de preparação típica da PCR é amplificar uma sequência de forma que esta possa ser clonada em um vetor heterólogo. As aplicações analíticas notáveis da PCR incluem diagnósticos de condições ou determinações de genótipos que envolvem loci genéticos com polimorfismos de tamanho.
[0006] Um exemplo de um lócus que exibe polimorfismo de tamanho relevante na medicina é a região não traduzida a 5' (UTR) do gene FMR1 humano no cromossomo X. Indivíduos normais possuem tipicamente 5-44 repetições de CGG nesta região. Em contraste, alelos deste lócus que contêm 200 até 2000 ou mais repetições de CGG são indicativos de síndrome do X Frágil (FXS). Tais alelos são referidos como Alelos de Mutação Completa. Estes alelos são geneticamente instáveis. Os indivíduos com FXS podem ter várias combinações de sintomas tais como ataxia, falência prematura dos óvulos, deficiências de aprendizado e outras condições cognitivas/comportamentais, incluindo sintomas similares ao autismo.
[0007] Uma exceção infeliz para a versatilidade da PCR está na dificuldade de amplificação de corridas longas de sequência altamente rica em GC, incluindo Alelos de Mutação Completa da 5'UTR de FMR1. Tentativas de otimizar a PCR de FMR1 incluíam modificações nas condições de ensaio da PCR convencional. Ver Genome Res. 6(7):633-8 (1996); Nucleic Acids Res. 25(19):3957-8 (1997); J. Mol. Diagn 8:544-550 (2006); Am. J. Med. Genet. 51(4):527-34 (1994). Ainda após mais de 15 anos do desenvolvimento do ensaio de PCR para FMR1, recentemente em 2008 (Genet. Med. 10(10):714-9 (2008)) um estudo de verificação piloto publicado para detectar X Frágil em recém-nascidos relatou que "dois métodos de análise quantitativa de reação em cadeia da polimerase (PCR) ... utilizados no processo de validação interno para determinar o número de repetições de FMR1 nos indivíduos de sexo feminino falharam em produzir resultados confiáveis e reproduzíveis" (ênfase adicionada) e, ainda, que "uma segunda falha na [PCR] da qual o primeiro ou o isolamento secundário era altamente sugestivo de um tamanho de repetições de CGG no FMR1 anormal". Assim, os versados na técnica continuam a considerar a amplificação pela PCR reproduzível dos alelos de X Frágil com mutação completa um problema não resolvido.
[0008] Foi observado que a detecção de regiões de repetição do tripleto CGG que contêm mais que aproximadamente 100 repetições pela PCR se tornou progressivamente enfraquecida com o aumento do número de repetições. J. Mol. Diagn. 7:605-12 (2005). Esta dificuldade, combinada com a natureza heterogênea dos sintomas de FXS, contribuiu para o uso de procedimentos tal como Southern blotting com a finalidade de detectar os Alelos de Mutação Completa. Id. O Southern blotting é geralmente mais demorado e custoso e muito menos susceptível a implementações de alto rendimento, que a PCR.
[0009] Uma publicação recente por Tassone e outros (J. Mol. Diagn. 10:43-49 (2008); "Tassone 2008") descreve um ensaio para testar em relação à presença de alelos de CGG mais longos sem a amplificação de comprimento completo do alelo. Ver também a W02008/011170. O método utiliza um iniciador de PCR quimérico que se hibridiza aos sítios dentro da região de CGG expandida, de forma que a presença de um espalhamento mais amplo de produtos da PCR representa um resultado positivo para um alelo expandido. Id. em 46.
[00010] A estratégia de hibridização aleatória pode resultar na amplificação inespecífica e na ausência de resolução. As condições da PCR de base utilizadas neste artigo foram amplamente testadas em muitos laboratórios diferentes e parece que o número máximo de repetições de CGG que pode ser amplificado de forma bem sucedida é de aproximadamente 350 repetições de CGG. Ver, por exemplo, Saluto e outros, J. Mol. Diagn. 7:605-612 (2005). A amplificação inespecífica é evidente em Tassone 2008. O espalhamento no gel de agarose mostrado por Tassone 2008 como a figura 1 parece conter produtos mais longos que o comprimento máximo esperado de 350 amplicons que contêm repetições e assim pode ser que grande parte do espalhamento não represente os produtos específicos de repetições de CGG (ver a figura 1 de Tassone 2008; o espalhamento na faixa 5 parece se estender até a vizinhança do poço de carregamento). Tassone e outros indicam na legenda da figura 3 que utilizaram o High-Low ladder (Bionexus, Oakland, CA) como um marcador de peso molecular e o marcador na figura 1 parece ser o mesmo que na figura 3. A banda maior do High-Low é de aproximadamente 10 kb e o espalhamento na figura 1 se estende acima desta banda. Este comprimento também é mais longo que o produto de comprimento completo esperado da amostra utilizada no ensaio. O tamanho do alelo mais longo é listado na forma de 615 repetições de CGG. Portanto, é esperado que os produtos de comprimento completo sejam de aproximadamente 2 kb, estimados através da adição de aproximadamente 200 nt de sequência flanqueadora nos 1845 nt de repetições. Produtos inespecíficos podem reduzir tanto a precisão quanto a confiança das determinações baseadas na amplificação considerando o estado dos alelos associados ao X Frágil.
[00011] Adicionalmente, alguns ensaios de PCR convencionais para a detecção de um X Frágil baseados puramente em planejamentos de iniciadores específicos ao gene possuem limitações. Por exemplo, tais ensaios fornecem uma estimativa do número de repetições de CGG com base na mobilidade do amplicon da PCR. Para possibilitar a quantificação acurada do número de repetições, a mobilidade do amplicon é geralmente medida em relação a calibradores externos, por exemplo, um conjunto apropriado de padrões de tamanho. É desejável possibilitar a quantificação acurada de CGG sem se basear em calibradores externos.
[00012] Além disso, os alelos de FMR1 podem conter sequências de AGG que estão que ficam intercaladas entre as repetições de CGG, geralmente na região a 5' do segmento de repetição. O conhecimento dos elementos de sequência de AGG caracteriza o alelo sob um aspecto. Os elementos de sequência de AGG podem ser utilizados na tomada de decisão clínica. Por exemplo, casos de expansão de um alelo de FMR1 da mãe para um alelo de mutação completa em seu bebê foram observados para um alelo com tão pouco quanto 59 repetições e este alelo é conhecido por não possui quaisquer elementos de AGG. Ver Nolin e outros, Am. J. Hum. Genet. 72:454- 464 (2003). Na verdade, mutações completas raramente se em algum momento parecerem conter elementos de AGG além das primeiras 20 repetições de CGG e estudos biofísicos sugeriram que moldes com sequências "interruptoras" de AGG entre a repetição do segmento de CGG mais provavelmente adotam estruturas de DNA convencionais e são mais estáveis e mais susceptíveis à replicação acurada. Ver, por exemplo, Weisman-Shomer e outros, Nucleic Acids Res. 28:1535-41 (2000); Zhong e outros, Am. J. Med. Genet. 64:261-5 (1996); Larsen e outros, Am. J. Med. Genet. 93:99-106 (2000); e Dombrowski e outros, Hum. Mol. Genet. 11:371-78 (2002). Assim, há uma necessidade de uma tecnologia para mapear elementos interruptores, tais como elementos de AGG, dentro do gene FMR1. O mapeamento dos elementos interruptores possui assim aplicações de pesquisa e de diagnóstico relacionadas à síndrome do X Frágil e a outras doenças associadas às repetições também.
[00013] Os métodos existentes para mapear elementos de AGG incluem o sequenciamento e o mapeamento de restrição. A tecnologia de sequenciamento de DNA é relativamente trabalhosa, particularmente pelo fato de que geralmente requer enriquecimento ou isolamento (in vitro ou in silico) da sequência de interesse e não é realizada de forma rotineira no teste para diagnóstico de X Frágil. Os ensaios baseados no mapeamento de restrição utilizavam a enzima Mnl\, que reconhece a sequência GAGG e corta 7 pares de bases a 5' de tal sequência, para inferir posições de AGG com base no tamanho de fragmentos resultantes dos produtos da PCR digeridos que compreendem a região de repetições de CGG da 5'UTR de FMR1. Ver, por exemplo, Eichler e outros, Nat. Genet. 8:88-94 (1994); Zhong e outros, Am. J. Hum. Genet. 57:351-361 (1995). O ensaio de Eichler e outros envolvia a amplificação através de PCR da região de repetição, a purificação dos produtos, a digestão durante a noite, a eletroforese durante 7 horas e o Southern blotting. No ensaio de Zhong e outros, "o produto da PCR foi extraído uma vez com fenol/clorofórmio, precipitado com etanol e parcialmente digerido em 10 litros com 5 unidades de Mnl\ a 37°C durante 50-70 min." Id. a 353. Isto foi seguido pela eletroforese e o Southern blotting. Ambos estes ensaios envolviam assim várias etapas incluindo purificação/limpeza, digestão de restrição e Southern blotting em adição à PCR e à eletroforese.
[00014] São fornecidos aqui métodos para quantificar repetições de CGG e para identificar, quantificar e revelar o contexto de sequência de sequências interruptoras na 5' UTR dos genes FMR1 e FMR2. As aplicações potenciais dos produtos da invenção incluem aplicações clínicas para o teste de X Frágil.
[00015] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos dois iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG; (b) a realização da PCR com os pelo menos dois iniciadores diferentes e o pelo menos um molde que compreende a pelo menos uma região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora.
[00016] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos três iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um flap a 5', um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG e um terceiro iniciador que possui uma sequência compreendida pelo flap a 5' do primeiro iniciador, em que o primeiro iniciador é fornecido em uma concentração menor que a do terceiro iniciador; (b) a realização da PCR com os pelo menos três iniciadores diferentes e o pelo menos um molde, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação.
[00017] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos dois iniciadores diferentes, em que o primeiro iniciador compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e o segundo iniciador se anela a uma posição fora da região rica em CGG; (b) a realização da PCR com os pelo menos dois iniciadores diferentes e um molde que compreende a região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG da dita representação.
[00018] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de três iniciadores diferentes, em que o primeiro iniciador compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um flap a 5', o segundo iniciador se anela a uma posição fora da região rica em CGG, o terceiro iniciador possui a mesma sequência do flap a 5' do primeiro iniciador e o primeiro iniciador é fornecido em uma concentração menor que a do terceiro iniciador; (b) a realização da PCR com os três iniciadores diferentes e um molde que compreende a região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG da dita representação.
[00019] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo que compreende uma sequência escolhida da SEQ ID NO: 44 e da SEQ ID NO: 45.
[00020] Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplos e explicativas e não são restritivas da invenção, como reivindicado.
Descrição Detalhada
[00021] A invenção refere-se a reações de amplificação que amplificam toda ou parte de uma região de repetição de CGG. Em algumas modalidades, a região de repetição de CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR1 ou pela 5' UTR de FMR2.
[00022] A invenção refere-se a reações de amplificação que usam um iniciador que se anela fora de uma região de repetição de CGG e um iniciador que se anela a sequências de repetição de CGG, permutações de sequências ou complementos inversos das sequências (GCG, CCG, CGC, GCC ou GGC). Os iniciadores que podem se anelar fora (a montante ou a jusante) da região de repetição de CGG podem ser iniciadores para frente ou inversos. Os iniciadores podem se anelar às sequências que flanqueiam a região de repetição de CGG. Os exemplos de tais iniciadores para frente incluem CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (SEQ ID NO: 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (SEQ ID NO: 2), CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G (SEQ ID NO: 3), TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC (SEQ ID NO: 4), GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG (SEQ ID NO: 5), GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG (SEQ ID NO: 6), GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA (SEQ ID NO: 7), CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G (SEQ ID NO: 8), GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A (SEQ ID NO: 9), GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (SEQ ID NO: 10), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (SEQ ID NO: 11), GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (SEQ ID NO: 12), GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC (SEQ ID NO: 13), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (SEQ ID NO: 14), CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (SEQ ID NO: 15), TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (SEQ ID NO: 16) e TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACG GCG GCG GCG GCG GA (SEQ ID NO: 44). Os exemplos de tais iniciadores inversos incluem CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A (SEQ ID NO: 17), GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (SEQ ID NO: 18), GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT (SEQ ID NO: 19), CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC AT (SEQ ID NO: 20), CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (SEQ ID NO: 21), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (SEQ ID NO: 22), CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG (SEQ ID NO: 23), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (SEQ ID NO: 24), GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (SEQ ID NO: 25), CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T (SEQ ID NO: 26), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A (SEQ ID NO: 27), GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A (SEQ ID NO: 28), AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C (SEQ ID NO: 29), CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C (SEQ ID NO: 30), TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A (SEQ ID NO: 31), AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C (SEQ ID NO: 32), GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T (SEQ ID NO: 33), CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G (SEQ ID NO: 34), CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA TCT (SEQ ID NO: 35), TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC (SEQ ID NO: 36), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC (SEQ ID NO: 37), AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CG (SEQ ID NO: 43) e AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CT (SEQ ID NO: 45).
[00023] A invenção ainda refere-se ao uso e aos métodos que compreendem o fornecimento dos iniciadores TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGG TTTCACTTCCGGT (SEQ ID NO: 38), AGCGTCTACTGTCTCGGCACTT GCCCGCCGCCGCCG (SEQ ID NO: 39), TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (SEQ ID NO: 40) e TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA CGGCGGCGGCGGCGG (SEQ ID NO: 41). A invenção adicionalmente refere-se a iniciadores que compreendem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-38 ou 40 com repetições de CGG ou as permutações e os complementos inversos das mesmas anexadas à extremidade a 3'. A invenção refere-se ainda ao uso e aos métodos que compreendem o fornecimento de um iniciador que contém um número de repetições de trinucleotídeos da sequência CGG ou as permutações e os complementos inversos das mesmas. Em algumas modalidades, o número de repetições de CGG no iniciador é quatro ou cinco. Em algumas modalidades, o iniciador contém 12-15 nucleotídeos de sequência de repetição de trinucleotídeos. Em algumas modalidades, o iniciador contém um número de repetições que varia de 3 até 10. O iniciador pode conter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 repetições e opcionalmente uma repetição parcial adicional de 1 ou 2 resíduos de C e/ou G. Iniciadores adicionais podem ser fornecidos, por exemplo, para garantir a ligação em um sítio polimórfico ou para amplificar uma região de tamanho conhecido com a finalidade de servir como um padrão interno.
[00024] Em algumas modalidades, o iniciador que se anela às sequências de repetição de CGG possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreende um elemento interruptor. A ligação preferencial do iniciador que se anela às sequências de repetição de CGG em pelo menos um sítio que compreende um elemento interruptor pode resultar na amplificação seletiva de pelo menos um produto que compreende o elemento interruptor, por exemplo, através da utilização do iniciador em uma reação de PCR com um segundo iniciador orientado de forma oposta que se liga fora da região rica em CGG, como descrito anteriormente. A atividade de ligação preferencial pode ser específica, por exemplo, por sítios que compreendem CGG e elementos de AGG ou as permutações e/ou complementos inversos dos mesmos, tal como um sítio que compreende (1) um elemento de AGG ou uma parte de um elemento de AGG que compreende um A e (2) três, quatro, cinco ou seis elementos de CGG e opcionalmente um elemento parcial adicional de CGG.
[00025] O grau de ligação preferencial, expresso em termos de uma proporção da abundância de produto amplificado de forma seletiva em relação aos produtos de fundo provenientes de uma reação de amplificação utilizando o iniciador com um segundo iniciador orientado de forma oposta que se liga fora da região rica em CGG, pode ser de pelo menos 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 6 vezes ou pode variar de 3 vezes até 12 vezes, 3 vezes até 10 vezes, 3 vezes até 8 vezes, 4 vezes até 12 vezes, 4 vezes até 10 vezes, 4 vezes até 8 vezes, 3 vezes até 7 vezes, 4 vezes até 7 vezes, 3 vezes até 6 vezes ou 4 vezes até 6 vezes. O pelo menos um produto amplificado de forma seletiva geralmente possui um comprimento que corresponde à distância ao longo do molde partindo da extremidade a 5' do primeiro iniciador, quando preferencialmente ligado a um sítio que compreende um elemento interruptor, à extremidade a 5' do segundo iniciador, quando ligado ao seu sítio fora da região rica em CGG.
[00026] Em algumas modalidades, o iniciador que se anela às sequências de repetição de CGG e se liga preferencialmente a um sítio ou sítios na região rica em CGG que compreende um elemento interruptor pode compreender um resíduo de A, T ou U dentro ou na extremidade da parte do iniciador que se anela às sequências de repetição de CGG ou em outras palavras, entre ou na extremidade das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; Ver, por exemplo, as SEQ ID NOs: 44 e 45 acima. O resíduo de A, T ou U pode ocorrer na extremidade a 3' do iniciador. Quando o resíduo de A, T ou U ocorre na extremidade das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC ou GCC, GGC, pode ou não ser uma repetição parcial de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC entre o resíduo de A, T ou U e a última repetição completa de CGG, CCG, GCG, CGC, GGC ou GGC. É possível substituir resíduos de nucleotídeos não naturais, discutidos em maiores detalhes abaixo, que preferencialmente se pareiam com bases com resíduos T/U ou A em relação a outros resíduos de nucleotídeos naturais pelo resíduo de A, T ou U. Similarmente, também é possível substituir um ou mais resíduos de nucleotídeos não naturais que preferencialmente se pareiam com bases com resíduos C ou G em relação a outros resíduos de nucleotídeos naturais por um ou mais resíduos de G e/ou C que constituem as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. A presença de um ou mais tais resíduos não naturais dentro de uma sequência de outra maneira constituída das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC (opcionalmente com um A, T, U ou que corresponde ao resíduo não natural como discutido acima) não nega a identidade da dita sequência dentro do contexto da presente divulgação como uma sequência de repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC.
[00027] Em um ensaio não ancorado, é fornecido um primeiro iniciador que possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem elementos interruptores. A presença de um elemento interruptor pode ser indicada nos resultados de um ensaio não ancorado por um nível relativamente baixo de produtos cuja síntese envolvia a extensão do primeiro iniciador ligado aos sítios que compreendem o elemento interruptor. Estes níveis baixos podem aparecer na forma de um espaço (gap) ou um conjunto de picos baixos circundados por picos mais altos em um eletroferograma.
[00028] Em um ensaio ancorado, é fornecido um primeiro iniciador que possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem elementos interruptores. Dever ser observado que um iniciador que possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem elementos interruptores podem ser fornecidos em reações em que pelo menos um molde compreende pelo menos uma região rica em CGG que compreende zero, um ou um grande número de elementos interruptores e a recitação de um iniciador com "uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem elementos interruptores" não implica, por exemplo, que a região rica em CGG compreende necessariamente um grande número de elementos interruptores. A presença de um elemento interruptor é indicada em um ensaio ancorado por um nível relativamente alto de produtos cuja síntese envolvia a extensão do primeiro iniciador ligado aos sítios que compreendem o elemento interruptor. O alto nível pode aparecer na forma de uma ponta circundada por picos menores e/ou sinal de linha de base em um eletroferograma.
[00029] Em algumas modalidades, o primeiro iniciador utilizado em um ensaio ancorado compreende um resíduo de A, T ou U entre ou na extremidade a 3' das repetições de CGG. Em algumas modalidades, o primeiro iniciador utilizado em um ensaio ancorado compreende um resíduo de nucleotídeo não natural que preferencialmente se pareia com bases com resíduos de A ou T/U em relação a outros resíduos de nucleotídeos naturais. Os resíduos de nucleotídeos não naturais são resíduos de nucleotídeos que compreende uma nucleobase sem ser adenina, timina, guanina, citosina e uracil (A, T, G, C e U, respectivamente). Os exemplos de resíduos de nucleotídeos não naturais que preferencialmente se pareiam com bases com resíduos de A ou T/U incluem, sem limitação, adutos de resíduos de T, U ou A que preferencialmente se pareiam com bases com resíduos de A ou T/U em relação a outros resíduos naturais (por exemplo, análogos de uracil substituídos em 5); e resíduos que compreendem nucleobases tais como, por exemplo, pseudouracila e diaminopurina.
[00030] Dois iniciadores são considerados orientados de forma oposta quando se ligam a fitas opostas de um molde de ácido nucleico de fita dupla.
[00031] Como utilizado aqui, uma sequência está "a montante" de uma região rica em CGG quando ocorre a 5' da região rica em CGG ao longo da fita que compreende repetições de CGG. Como utilizado aqui, uma sequência está "a jusante" de uma região rica em CGG quando ocorre a 3' da região rica em CGG ao longo da fita que compreende repetições de CGG.
[00032] Os métodos da invenção podem se referir a reações de amplificação que compreendem o fornecimento de pelo menos dois ou pelo menos três iniciadores diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos três iniciadores diferentes são fornecidos e um dos iniciadores é uma subsequência de outro iniciador. Em algumas modalidades, um iniciador é um iniciador quimérico que compreende repetições de CGG e uma sequência de flap a 5' e outro iniciador possui a sequência da sequência de flap a 5' do iniciador quimérico. Dever ser observado que o iniciador que possui a sequência da sequência de flap a 5' do iniciador quimérico pode, mas não necessariamente, ter a sequência sem repetições inteira do iniciador quimérico. Em outras palavras, a sequência de parte ou de todo um iniciador pode ser compreendida pela sequência de outro iniciador; por exemplo, o iniciador quimérico compreende uma sequência de flap a 5' e outro iniciador pode compreender a sequência de parte ou de todo o flap a 5'. Em algumas modalidades, o iniciador contém 12-15 nucleotídeos de sequência de repetição de CGG. a sequência de flap a 5' pode corresponder a uma sequência adjacente a ou próxima da região de repetição de CGG ou pode ser não relacionada às sequências dentro e ao redor da região de repetição de CGG. Em algumas modalidades, o comprimento do iniciador quimérico pode ser de aproximadamente 35, 40, 45, 50 ou 55 nt. Em algumas modalidades, um ou mais dos iniciadores possuem uma Tm que varia de 60°C até 75°C, por exemplo, aproximadamente 60°C, 65°C, 70°C ou 75°C.
[00033] Em algumas modalidades, pelo menos três iniciadores diferentes são fornecidos e um iniciador é fornecido em uma concentração menor que a concentração de outro iniciador. Por exemplo, o iniciador quimérico é opcionalmente fornecido em uma concentração menor que o iniciador com a sequência da sequência de flap a 5' do iniciador quimérico. A proporção de concentrações, expressa na forma da quantidade de diferença, pode variar de 2 até 10.000 ou mais, por exemplo, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000 ou 10.000. Em tais modalidades, o iniciador presente em uma concentração menor pode ser eliminado em rodadas iniciais da reação de amplificação, de forma que a extensão é geralmente toda ou quase toda, proveniente dos iniciadores ainda presentes (que estiveram presentes inicialmente em concentrações relativamente mais altas).
[00034] A invenção refere-se a reações que amplificam ácidos nucleicos. Os exemplos de reações de amplificação incluem, sem limitação, PCR, NASBA (amplificação baseada na sequência de ácido nucleico) e SDA (amplificação por deslocamento de fita). Ver, por exemplo, Patente U.S. 4.683.202 (PCR); Patente U.S. 6.326.173; e J. of Virol. Methods 151:283-293 (2008) (NASBA); e Patente U.S. 5.648.211 (SDA). Todos os anteriores são incorporados aqui como referência. O versado na técnica entenderá que reagentes são apropriados para fornecimento. Cada um destes métodos envolve síntese de DNA e como tal envolve o uso de DNA polimerases, nucleotídeos e cátions divalentes (fornecidos na forma de um sal), particularmente magnésio, em uma solução que leva à polimerização do DNA e em que o molde está presente. Os métodos variam em termos do fornecimento de atividades catalíticas adicionais, do uso de termociclagem ou incubação isotérmica e o uso e a estrutura de iniciadores. Um tampão em um pH adequado tal como entre 7 e 8, entre 6,5 e 8,5, entre 6 e 9 ou aproximadamente 7,4 ou 7,5 também é tipicamente fornecido.
[00035] No PCR de acordo com a invenção, é fornecido pelo menos um par de iniciadores que se liga em cada extremidade de ou dentro de uma região-alvo, em fitas opostas, de forma que cada um inicie a síntese em direção ao outro iniciador. A reação é submetida a ciclos térmicos de forma a iniciar a desnaturação do substrato em uma etapa à alta temperatura, o anelamento dos iniciadores em uma etapa à temperatura menor e a extensão a uma temperatura que pode ser, mas não é necessariamente mais alta que aquela da etapa de anelamento. A amplificação ocorre devido ao fato de que os produtos de um ciclo podem servir como moldes no ciclo seguinte.
[00036] Em NASBA, uma RNA polimerase (RNAP) é fornecida em adição à DNA polimerase, que pode também ser uma transcriptase reversa (RT) (por exemplo, uma enzima que pode catalisar a síntese de DNA utilizando um molde de RNA ou de DNA). São fornecidos iniciadores que são similares aqueles utilizados na PCR exceto pelo fato de que pelo menos um iniciador compreende adicionalmente uma sequência promotora que é reconhecida pela RNAP. Assim, o produto da RT serve como um molde para RNAP, que sintetiza RNA que serve como um molde para a RT, levando à amplificação. Em algumas formas de NASBA, a RNase H é fornecida para produzir DNA de fita simples após a síntese de um híbrido de RNA-DNA pela RT. A amplificação ocorre através da ação combinada da RT e da RNAP, na ausência de desnaturação térmica repetida.
[00037] SDA é uma técnica em que o DNA é amplificado de uma maneira isotérmica e assíncrona, significando que a desnaturação térmica cíclica não é utilizada para separar as fitas; ao invés disso, o deslocamento das fitas ocorre através da síntese de DNA por si mesmo, em que a extensão de um 3' OH causa o deslocamento do filamento a jusante. O 3' OH é fornecido inicialmente por um iniciador externo e subsequentemente através de uma reação de formação de pequenos cortes. Dois pares de iniciadores são fornecidos. Um par 'interno' se liga circundando o amplicon e adicionalmente compreende flaps a 5' que contêm um sítio de restrição. O outro par ‘externo' fica posicionado de forma distai, isto é, longe da região-alvo. Um iniciador interno pode se ligar ao molde, ser estendido e então ser deslocado através da síntese partindo do iniciador externo correspondente. Subsequentemente, o DNA deslocado torna-se filta dupla, por exemplo, pela síntese da segunda fita. A etapa seguinte é a produção de pequenos cortes em uma fita da molécula de fita dupla, que pode ser realizada utilizando nucleotídeos modificados e um sítio de restrição em que o sítio de clivagem é inativado em uma fita (mas não no outro) pelo nucleotídeo modificado. A enzima de restrição que corresponde a este sítio é fornecida na reação e gera o pequeno corte. O 3' OH no pequeno corte resultante é então estendido pela DNA polimerase, deslocando uma fita (que pode novamente servir como um molde ) e a molécula de fita dupla regenerada é novamente um substrato para pequenos cortes seguido pela extensão e o deslocamento, levando à amplificação. Não é necessária a desnaturação térmica repetida.
[00038] Em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem o fornecimento de dNTPs em uma Proporção de GC/AT maior que um e a uma concentração de dNTPs totais que leva à síntese de DNA utilizando moldes ricos em GC. Ver o Pedido de Patente U.S. No. 12/371.306. A proporção de GC/AT pode ser aproximadamente de 1,1, 1,2, 1,4, 1,6, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou maior. A proporção de GC/AT pode estar entre 1,1 e 20, 1,1 e 15, 1,1 e 10, 1,1 e 8, 1 e 15, 1,1 e 7, 1,1 e 6, 1,1 e 5, 1,2 e 25, 1,4 e 25, 1,6 e 25, 2 e 25, 3 e 25, 4 e 25, 5 e 25, 2 e 15, 2,5 e 10 ou 4 e 10. A concentração de dNTPs totais pode ser aproximadamente de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,2, 1,5, 2 ou 3 mM. A concentração de dNTPs pode estar entre 0,4 e 3 mM, 0,5 e 3 mM, 0,6 e 3 mM, 0,7 e 3 mM, 0,8 e 3 mM, 0,9 e 3 mM, 1 e 3 mM, 0,4 e 2 mM, 0,4 e 1,5 mM, 0,4 e 1,2 mM, 0,4 e 1 mM, 0,4 e 0,9 mM, 0,4 e 0,8 mM, 0,4 e 0,7 mM, 0,5 e 2 mM, 0,5 e 1 mM ou 0,6 e 0,9 mM. "Proporção de GC/AT" significa a proporção da concentração da soma de dCTP, dGTP e todos os análogos de nucleotídeos dos mesmos, relação à concentração da soma de dATP, dTTP, dUTP e todos os análogos de nucleotídeos dos mesmos, em certa solução ou mistura. "dNTP" significa trifosfato de desoxinucleotídeo e refere-se a dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dllTP e análogos dos mesmos. "Análogos de nucleotídeos" são moléculas ou ions que compreendem um grupamento básico sem ser as bases naturais adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) ou uracil (U), um grupamento de açúcar idêntico ou similar à desoxirribose e pelo menos um grupamento fosfato ou fosfato múltiplo (por exemplo, difosfato ou trifosfato). O análogo de nucleotídeo é um análogo de um nucleotídeo específico, em particular dATP, dCTP, dGTP, dTTP ou dllTP, quando este compreende um trifosfato e um grupamento de açúcar, cuja estrutura e configuração são adequadas para incorporação em um dupla hélice de ácido nucleico por uma polimerase e uma base cujas propriedades de pareamento de bases em uma dupla hélice de ácido nucleico e os loci de incorporação pelas DNA polimerases em uma dupla hélice de ácido nucleico são mais similares as de um dos cinco nucleotídeos listados anteriormente, com a exceção de que os análogos de dTTP serão geralmente também análogos de dllTP e vice versa. O termo "análogo" utilizado em associação aos termos que incluem, mas não são limitados a "nucleosídeo", "base", "nucleobase" ou "resíduo" deve ser interpretado da mesma maneira como se fosse utilizado em associação a "nucleotídeo".
[00039] Em algumas modalidades, podem ser fornecidos intensificadores. Os intensificadores contribuem para o sucesso de reações que geram produto rico em GC. Uma variedade de intensificadores pode ser incluída em reações da PCR em geral para aumentar o rendimento, a especificidade e a consistência e pode operar através da diminuição da Tm do DNA molde. Os intensificadores podem funcionar através da desestabilização de hélices, da neutralização de inibidores de reação ou outros mecanismos, incluindo mecanismos desconhecidos. Os intensificadores incluem, sem limitação, betaína, análogos de betaína, glicerol, albumina do soro bovino (BSA), polietileno glicol, cloreto de tetrametilamônio, 7-desaza-GTP, detergentes neutros, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, etanol, isopropanol, formamida, acetona, acetamida, N-metilformamida, N,N-dimetilformamida, acetona, acetimida, N-metilacetimida, N,N-dimetilacetimida, 2-pirrolidona, N- metilpirrolidona, propionamida e isobutiramida. Os detergentes neutros incluem, sem limitação, TWEEN-20, β-octil-glucosideo, Octil-β-Thio- glucopiranosídeo, Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween-80, Pluronic F-68, Pluronic F-127, Deoxy Big CHAP, CHAPS, CHES, nonil fenoxilpolietoxiletanol (Tergitol-type NP-40) e octil fenoxilpolietoxiletanol (Igepal CA-630). Os análogos de betaina incluem, sem limitação, homodeanol betaina, deanol betaina, propio betaina, homoglicerol betaina, dietanol homobetaina, trietanol homobetaina, hidroxipropil homobetaina, sal interno de A/-Metil-A/-(2- carboxietil)morfolinio, sal interno de /V-Metil-/V-(2-carboxietil)piperidínio, sal interno de A/-metil-A/-(2-carboxietil)pirrolidínio, sal interno de /V,/V- dimetil-A/-(2-hidroxietil)-A/-(2-sulfo-etil)amônio, sal interno de /V,/V- dimetil-A/-(2-hidroxietil)-A/-(3-sulfopropil)-amônio, sal interno de /V,/V- dihidroxietil-A/-metil-A/-(3-sulfopropil)amônio, sal interno de /V,/V-dimetil- A/-(2-hidroxietil)-A/-(4-sulfobutil)amônio, sal interno de /V-metil-A/-(3- sulfopropil)morfolinio e sal interno de A/-metil-/V-(3-sulfopropil)piperidio.
[00040] A betaina, os análogos de betaina e/ou outros intensificadores podem ser fornecidos em concentrações molares entre 0,01 e 5 M, 0,01 e 4 M, 0,01 e 3 M, 0,01 e 2,5 M, 0,02 e 5 M, 0,03 e 5 M, 0,04 e 5 M, 0,05 e 5 M, 0,07 e 5 M, 0,1 e 5 M, 0,2 e 5 M, 0,3 e 5 M, 0,4 e 5 M, 0,5 e 5 M, 0,7 e 5 M, 1 e 5 M, 1,5 e 5 M, 0,1 e 4 M, 0,5 e 3 M, 1 e 2,5 M ou 1,5 e 2,5 M, por exemplo, aproximadamente 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 M. Alternativamente, os intensificadores podem ser fornecidos concentrações percentuais em p/v ou v/v entre 0,1 e 50%, 0,2 e 50%, 0,5 e 50%, 1 e 50%, 2 e 50%, 5 e 50%, 0,1 e 40%, 0,1 e 30%, 0,1 e 20%, 0,5 e 40%, 1 e 30% ou 2 e 20%, por exemplo, aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% em volume. Os detergentes neutros podem ser fornecidos em entre 0,0001 e 10% em volume, 0,0002 e 10%, 0,0005 e 10%, 0,001 e 10%, 0,002 e 10%, 0,005 e 10%, 0,01 e 10%, 0,02 e 10%, 0,05 e 10%, 0,0001 e 5%, 0,0001 e 2%, 0,0001 e 1%, 0,0005 e 1% ou 0,001 e 1%, por exemplo, aproximadamente 0,0001, 0,0002, 0,0003, 0,0004, 0,0005, 0,0006, 0,0007, 0,0008, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% em volume. Os versados na técnica reconhecerão concentrações apropriadas para vários intensificadores.
[00041] A invenção refere-se a métodos que compreendem o fornecimento de tampões para reações de amplificação. Os tampões podem compreender, por exemplo, e sem limitação, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), bis-tris propano, bicarbonato, fosfato, glicina, histidina, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico (HEPES), ácido 3-(N-morpholino)propanossulfônico (MOPS) e várias bases/ácidos conjugados e sais dos mesmos.
[00042] A invenção refere-se a métodos que compreendem o fornecimento de pelo menos um DNA polimerase para sintetizar DNA partindo de dNTPs de uma maneira dependente do molde. A DNA polimerase pode compreender uma do tipo selvagem, modificada, termofílica, quimérica, engenheirada e/ou uma mistura de mais de um a polimerase. A DNA polimerase pode compreender Exact Polymerase (5 PRIME GmbH), AccuSure® DNA Polymerase (Bioline), Phusion® AccuPrime® Pfx (Invitrogen), Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), Phire® Hot Start DNA Polymerase (New England Biolabs), Phusion® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs), JumpStart® REDTaq® DNA Polymerase (Sigma- Aldrich), Pfullltra® Hotstart DNA Polymerase (Stratagene), PfuTurbo® Cx Hotstart DNA Polymerase (Stratagene), PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Takara), Extensor Hi-Fidelity PCR Enzima (ABgene), ACCUZYME® DNA Polymerase (Bioline), SAHARA® DNA Polymerase (Bioline), VELOCITY DNA Polymerase (Bioline), GeneChoice® AccuPOL® DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), GeneChoice® UniPOL® DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), Elongase Enzyme Mix (Invitrogen), PfxδO® DNA Polymerase (Invitrogen), Phusion DNA Polymerase (New England Biolabs), KOD HiFi DNA Polymerase (Novagen), KOD XL DNA Polymerase (Novagen), Expand 20 kb PLUS Thermostable DNA Polymerase mixture (Roche Applied Science), Expand High Fidelity PLUS Thermostable DNA Polymerase mixture (Roche Applied Science), Expand High Fidelity Thermostable DNA Polymerase mixture (Roche Applied Science), Expand Long Template Thermostable DNA Polymerase mixture (Roche Applied Science), Easy-A® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene), EXL™ DNA Polymerase (Stratagene), Herculase® Enhanced DNA Polymerase (Stratagene), Herculase® II Fusion DNA Polymerase (Stratagene), Kapa LongRange® DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa HiFi® DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Robust DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Robust Hotstart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Fast DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Kapa2G® Fast Hotstart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), LA TAQ DNA Polymerase (Takara), Optimase DNA Polymerase (Transgenomic, Inc.), Exo- Pfu DNA Polymerase (Stratagene), HotMaster Taq DNA Polymerase (5 PRIME GmbH), HotTaq DNA Polymerase (Abnova Corporation), AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied Biosystems), Bst DNA Polymerase Lg Frag (New England Biolabs), MasterAmp® Tfl DNA Polymerase (EPICENTRE Biotechnologies), Red Hot DNA Polymerase (ABgene), Thermoprime Plus DNA Polymerase (ABgene), Taq-red DNA Polymerase (AppliChem GmbH), BIO-X-ACT® Long DNA Polymerase (Bioline), BIO-X-ACT® Short DNA Polymerase (Bioline), Bioline HybriPol® DNA Polymerase (Bioline), Bioutram Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), EU-Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), Synergy Taq DNA Polymerase (eEnzyme LLC), GeneChoice® RedPOL® DNA Polymerase (GeneChoice, Inc.), AccuPrime® GC-Rich DNA Polymerase (Invitrogen), PiroPhage® 3173 DNA Polymerase, Exo Minus (Lucigen), 9 Degrees North (Modificada) DNA Polymerase (New England Biolabs), Therminator DNA Polymerase (New England Biolabs), Pwo DNA Polymerase (Roche Applied Science), PaqδOOO® DNA Polymerase (Stratagene), YieldAce® DNA Polymerase (Stratagene), e2TAK® DNA Polymerase (Takara) ou DNA polimerases que ocorrem naturalmente de P. kodakaraensis, P. furiosus, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis "VentTM", P. GB-D "Deep Vent", T. 9N-7, T. aggregans, T. barossii, T. fumicolans, T. celer, Pyrococcus sp. strain ST700, T. pacificus, P. abysii, T. profundus, T. siculi, T. hydrothermalis, Thermococcus sp. cepa GE8, T. thioreducens, P. horikoshii ou T. onnurineus NA1, Thermococcus sp. 9°N-7, Thermococcus sp. Gl-J, Thermococcus sp. MAR-13, Thermococcus sp. GB-C, Thermococcus sp. Gl-H, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermotoga marítima, Bacillus stearoutramophilus ou Bacillus caldotenax.
[00043] Os dados obtidos através da invenção, por exemplo, os resultados dos testes, podem ser utilizados no processo de diagnóstico da presença ou da ausência de um estado de saúde ou doença. Os dados obtidos através do uso da invenção podem ser utilizados na determinação do genótipo de um indivíduo. Os dados obtidos através da invenção podem ser utilizados para detectar genótipos associados com a síndrome do X Frágil, síndrome de ataxia com tremor associada a X Frágil e insuficiência ovariana primária associada a X Frágil. Os loci genéticos associados com estes estados de saúde são conhecidos na arte e incluem sem limitação FMR1, FMR2, a 5' UTR de FMR1, a 5' UTR de FMR2, as repetições de CGG dentro da 5' UTR de FMR1 e as repetições de CGG dentro da 5' UTR de FMR2. Em uma modalidade adicional, os dados obtidos através da invenção podem ser utilizados para detectar genótipos associados com distúrbios por repetições de trinucleotídeos ricas em GC e/ou com elementos interruptores, tais como síndrome do X Frágil, síndrome de ataxia com tremor associada a X Frágil e insuficiência ovariana primária associada a X Frágil, distrofia miotônica, doença de Huntington, atrofia muscular espinobulbar, atrofia Dentatorrubropalidoluisiana e/ou ataxia espinocerebelar. Um elemento interruptor, como o nome sugere, interrompe uma série de repetições. Uma região rica em CGG pode ou não compreender elemento(s) interruptor(es). Assim, uma região rica em CGG pode compreender séries de repetições de trinucleotídeos e pelo menos um elemento interruptor entre as séries. Os loci genéticos associados com estes estados de saúde são conhecidos na arte e incluem sem limitação FMR1, FMR2, DMPK, ZNF9, HTT, AR, ATN1, ATXN1-3, ATXN7, ATXN10, CACNA1A, SCA8, PPP2R2B e TBP. Ver, por exemplo, Nat. Genet. 13(1): 105-8 (1996); Nat. Genet. 13(1): 109-13 (1996).
[00044] Os métodos podem compreender a determinação da presença ou da ausência de elementos interruptores próximos a qualquer uma das extremidades de uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um alelo compreendido pela amostra, por exemplo, dentro de 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 ou 300 pb de qualquer uma das extremidades. A determinação da presença ou da ausência de elementos interruptores dentro de certa distância de qualquer uma das extremidades de uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um alelo compreendido pela amostra é entendida como incluindo a determinação da presença ou da ausência de interruptores ao longo das regiões ricas em CGG com tamanhos de forma que a região rica em CGG inteira fica dentro da certa distância de qualquer uma das extremidades.
[00045] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a análise de pelo menos uma região rica em CGG independentemente de ensaios auxiliares ou reflexos que compreende procedimentos tal como Southern blotting, digestão de restrição ou sequenciamento, por exemplo, sequenciamento de Sanger, sequenciamento de Maxam- Gilbert, sequenciamento de ligação e sequenciamento-por-síntese de molécula isolada (também conhecido como sequenciamento de segunda geração), que inclui sequenciamento com terminador reversível e pirossequenciamento. Todavia os métodos podem compreender a determinação da informação em relação a pelo menos uma região rica em CGG tal como comprimento e/ou conteúdo ou posição do elemento interruptor como descrito aqui. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a derivação de informação que é necessária e suficiente para a determinação de informação em relação a pelo menos uma região rica em CGG tal como comprimento e/ou conteúdo ou posição do elemento interruptor como descrito aqui partindo da representação de tamanho e abundância de produto obtido através de uma técnica de alta resolução partindo de uma reação de amplificação como descrito aqui.
[00046] A informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora pode compreender informação tal como o fato de que menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra compreende uma sequência interruptora; em casos em que mais de um molde diferente está presente, se cada molde em uma amostra compreende uma sequência interruptora; uma estimativa de ligação menor do número de sequências interruptoras presentes na pelo menos uma região rica em CGG; e/ou pelo menos um posição de pelo menos um elemento interruptor (incluindo determinação dentro de certo nível de acurácia, como discutido abaixo). A listagem anterior de tipos específicos de informação não inclui outros tipos de informação que podem ser determinados através dos métodos da invenção divulgados explicitamente ou implicitamente aqui, considerando o conhecimento de um perito comum na arte.
[00047] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a realização de pelo menos dois ensaios, em que cada ensaio compreende (a) o fornecimento de iniciadores, em que os iniciadores dos pelo menos dois ensaios não são idênticos; (b) a realização de uma reação de amplificação para produzir um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos, pelo menos duas representações de tamanho e abundância de produto que será produzido partindo dos pelo menos dois ensaios; e (d) a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora. Em algumas modalidades, a informação derivada compreende uma informação que poderia não ter sido derivada se apenas um ensaio tivesse sido realizado, tal como, em casos em que a amostra compreende pelo menos dois moldes diferentes que compreendem regiões ricas em CGG e pelo menos um elemento interruptor está presente em pelo menos uma das regiões ricas em CGG, das quais pelo menos duas regiões ricas em CGG compreendem o pelo menos um elemento interruptor. Por exemplo, uma situação em que esta informação pode ser ambígua partindo dos resultados de um ensaio é ilustrada na figura 10. Outras ambiguidades e exemplos possíveis de como resolvê-las, são discutidos abaixo.
[00048] Em algumas modalidades, os pelo menos dois ensaios compreendem um ensaio ancorado e um ensaio não ancorado. Em algumas modalidades, os pelo menos dois ensaios utilizam iniciadores orientados de forma oposta que compreendem as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. Isto é, um primeiro ensaio pode compreender o fornecimento de iniciadores que compreendem um iniciador que compreende repetições que fica orientado a montante e o segundo ensaio pode compreender o fornecimento de iniciadores que compreendem um iniciador que compreende repetições que fica orientado a jusante ou vice versa.
[00049] Em algumas modalidades, os métodos compreendem pelo menos três ensaios, que compreendem pelo menos dois ensaios não ancorados e pelo menos um ensaio ancorado ou vice versa. Os pelo menos dois ensaios não ancorados (ou ancorados) podem utilizar iniciadores orientados de forma oposta que compreendem as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC, como discutido no parágrafo anterior.
[00050] Dever ser observado que em algumas situações, um "conjunto de produtos" pode não compreender um grande número de produtos principais ou detectáveis, tal como em ensaios ancorados com amostras que compreendem quando muito uma região rica em CGG que compreende quando muito um interruptor. Os iniciadores são considerados "não idênticos" entre ensaios se pelo menos um dos iniciadores utilizado em um dos ensaios diferir dos iniciadores utilizados nos outros ensaios; em outras palavras, alguns dos iniciadores podem ser idênticos.
[00051] Os métodos podem compreender a determinação de pelo menos um detalhe de um genótipo heterozigoto, aneuploide ou mosaico, através da realização de pelo menos dois ensaios como descrito anteriormente, em que as reações de amplificação utilizam conjuntos de iniciadores não idênticos e o pelo menos um detalhe é determinado através da comparação de resultados dos pelo menos duas reações de amplificação.
[00052] O genótipo de uma amostra refere-se ao genótipo da origem da qual uma amostra foi obtida; este termo pode abrangir vários genótipos individuais no caso de amostras mistas.
[00053] Uma amostra que possui um genótipo heterozigoto compreende material genético de uma célula que compreende dois alelos do lócus compreendendo uma região rica em CGG.
[00054] Uma amostra que possui um genótipo mosaico compreende pelo menos dois alelos do lócus compreendendo uma região rica em CGG, com as células das quais a amostra foi obtida sendo geneticamente diferentes em pelo menos um alelo do lócus compreendendo uma região rica em CGG. Os pelo menos dois alelos compreendidos por uma amostra que possui um genótipo mosaico pode ser categorizados como alelos principais ou menos importantes dependendo de sua abundância. O alelo com a maior abundância é considerado um alelo principal e o alelo com a menor abundância é considerado um alelo menos importante; quando mais de dois alelos estão presentes, os alelos são classificados como principais ou menos importantes com base no fato de que sua abundância relativa, expressa na forma de uma porcentagem, é aritmeticamente mais próxima a do alelo com a abundância maior ou menor. Por exemplo, em uma amostra que compreende o primeiro, o segundo e o terceiro alelos com abundâncias relativas de 60%, 31% e 9%, respectivamente, o segundo alelo é considerado um alelo menos importante. A presença de alelos principais ou menos importantes pode também resultar da aneuploidia, por exemplo, se um genoma compreender três cópias de uma região rica em CGG, das quais duas são a mesma (o alelo principal) e um é diferente (o alelo menos importante). A aneuploidia é discutida em detalhes abaixo.
[00055] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a detecção do fato de uma amostra compreender um alelo menos importante com uma abundância relativa de pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% ou 25%. É entendido que uma região rica em CGG do alelo menos importante seria diferente de uma região rica em CGG do alelo principal. Por exemplo, o alelo menos importante poderia ter uma região rica em CGG com um número de repetições diferente e/ou uma distribuição diferente de elementos de AGG. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a detecção do fato de uma amostra compreende um alelo menos importante que compreende um elemento interruptor. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a detecção da localização de um elemento interruptor em um alelo menos importante, que pode estar dentro de um nível de precisão como discutido abaixo.
[00056] Uma amostra que possui um genótipo aneuploide compreende um número de alelos do lócus compreendendo uma região rica em CGG sem ser o número euploide. O número euploide é um para loci de cromossomos somáticos nos gametas e células de linhagem germinativa que sofreram uma divisão meiótica redutora, exceto para loci de cromossomos sexuais nos gametas do sexo masculino e nas células de linhagem germinativa masculinas que sofreram uma divisão meiótica redutora quando este pode ser 0 ou 1 para células individuais e médias para aproximadamente 0,5 para uma população das mesmas (sujeito à variação dependendo do número de células que carregam cromossomos X e Y presentes). O número euploide também é um para loci do cromossomo X em células somáticas masculinas e células de linhagem germinativa masculinas que ainda não sofreram uma divisão meiótica redutora. O número euploide é 2 para loci em cromossomos somáticos em células somáticas e em células de linhagem germinativa que ainda não sofreram uma divisão meiótica redutora e para os loci do cromossomo X em células somáticas femininas e células de linhagem germinativa femininas que ainda não sofreram uma divisão meiótica redutora. É possível que uma amostra tenha mais de uma das condições de heterozigosidade, aneuploidia e mosaicidade.
[00057] Genótipos mosaicos podem ocorrer, por exemplo, em amostras de indivíduos que compreendem células derivadas de células progenitoras diferentes (zigotos, blastômeros, células-tronco etc.) ou indivíduos que compreendem células que são geneticamente diferentes devido à mutação somática, incluindo alteração do número de repetições, tal como expansão de repetições. A aneuploidia está presente em certas síndromes, por exemplo, de Down, de Turner e de Klinefelter e pode também ocorrer de forma somática através de eventos de não disjunção cromossômica; tais eventos podem resultar em indivíduos que podem fornecer amostras aneuploides de mosaico, que podem ou não também ser heterozigotas.
[00058] As amostras que compreendem pelo menos dois alelos diferente do lócus compreendendo uma região rica em CGG (devido ao fato de ser pelo menos um de heterozigoto, aneuploide ou mosaica para cada lócus) podem ser analisadas para determinar pelo menos um detalhe em relação ao genótipo.
[00059] O pelo menos um detalhe pode compreender o fato de um, dois, nenhum ou mais de dois (se aplicável) dos pelo menos dois alelos diferente compreenderem pelo menos um elemento interruptor.
[00060] O pelo menos um detalhe pode compreender o número mínimo de elementos interruptores compreendidos por pelo menos um dos pelo menos dois alelos diferente. Por exemplo, poderia ser determinado que um alelo compreende pelo menos um elemento interruptor. O pelo menos um detalhe poderia ainda compreender que outro alelo compreende, por exemplo, pelo menos dois elementos interruptores.
[00061] O pelo menos um detalhe pode compreender a localização de pelo menos um elemento interruptor em um dos alelos.
[00062] Em algumas modalidades, o pelo menos um detalhe compreende pelo menos um detalhe que pode não ser determinado de forma não ambígua em relação ao genótipo de uma amostra heterozigota, aneuploide e/ou de mosaico partindo dos resultados de um único ensaio. Vem a seguir uma lista não exclusiva de detalhes que podem ser ambíguos partindo dos resultados de um único ensaio: 1. Os resultados de um único ensaio podem indicar que pelo menos um elemento interruptor está presente, mas os ditos resultados podem ser ambíguos em relação ao que o alelo compreende o pelo menos um elemento interruptor. 2. Os resultados de um único ensaio podem indicar que pelo menos dois elementos interruptores estão presentes, mas os ditos resultados podem ser ambíguos em relação ao fato de que os elementos interruptores são compreendidos pelo mesmo alelo ou alelos diferentes. 3. Os resultados de um único ensaio podem indicar que pelo menos três elementos interruptores estão presentes, mas os ditos resultados podem ser ambíguos em relação a como os pelo menos três elementos interruptores são distribuídos entre os pelo menos dois alelos diferentes. 4. Os resultados de um único ensaio podem ser ambíguos em relação ao fato de que um elemento interruptor está presente em uma posição em um primeiro alelo que é obscura na representação de tamanho e abundância de produto pelo sinal, tal como um pico grande, que corresponde a um segundo alelo.
[00063] Em algumas modalidades, os métodos da invenção resultam na síntese de produtos que não contêm ou são livres de uma fração substancial de material amplificado de forma inespecífica. Em algumas modalidades, os métodos resultam na síntese de produtos que não contêm ou são livres de uma fração substancial de material amplificado de forma inespecífica quando o molde é uma das amostras descritas nos Exemplos 1-3 abaixo. Em algumas modalidades, os métodos da invenção resultam na síntese de produtos que não contêm ou são livres de uma fração substancial de material amplificado de forma inespecífica que é maior que um tamanho esperado, o dito tamanho esperado sendo calculado através da adição do comprimento de uma região rica em CGG a um ajuste com base na posição em que o segundo iniciador se anela. Em algumas modalidades, os produtos contêm menos de 20%, 15%, 10%, 5%, 2% ou 1% de material que é maior que o tamanho esperado descrito na frase anterior, que é determinado por densitometria ou integração de sinal de uma representação de tamanho e quantidade de produto. Em algumas modalidades, esta representação é um eletroferograma. Como definido aqui, os produtos são "substancialmente livres" de material amplificado de forma inespecífica quando contêm menos que aproximadamente 10% de material que é maior que o tamanho esperado, como determinado acima.
[00064] A invenção refere-se a métodos que compreendem a análise de um molde que compreende sequências de repetições ricas em GC, tais como, por exemplo, trinucleotídeos CGG ou CCG. A dita análise de pode compreender a realização de uma reação de amplificação e a resolução dos produtos em alta resolução. A alta resolução pode ser uma resolução suficiente para distinguir produtos que contêm, por exemplo, 20 versus 21 ou 20 versus 22, 20 versus 23, 20 versus 24 ou 20 versus 25 repetições de trinucleotídeos ou em algumas modalidades, produtos que diferem no comprimento em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos ou pares de bases. Os exemplos de técnicas que podem ser empregadas nos métodos da invenção para realizar esta etapa de resolução incluem, sem limitação, eletroforese por capilaridade e gel de eletroforese de poliacrilamida (PAGE; algumas modalidades de PAGE sendo comumente referidas na arte como "correndo um gel de sequenciamento") ou sistemas microfluidos/eletroforese do tipo "lab- on-a-chip". A instrumentação para a realização de eletroforese por capilaridade pode ser obtida, por exemplo, de fornecedores tais como Applied Biosystems (ABI), Beckman, Agilent e Qiagen e os instrumentos adequados incluem sem limitação ABI 310, 3100, 3130/3130x1 ou 3730/3730x1; Beckman P/ACE MDQ; Agilent 2100 Bioanalyzer; e Qiagen QlAxcel. O processo de uma resolução dos produtos de forma eletroforética pode envolver o uso de polímeros líquidos, incluindo, por exemplo, POP-7, POP-6, POP-5 ou POP-4, dos quais todos são vendidos pela Applied Biosystems. Em algumas modalidades, um polímero que pode resolver produtos que contêm aproximadamente 250, 300, 350, 400 ou mais repetições de trinucleotídeos precisamente de acordo com tamanho, tal como, por exemplo, POP-4, é utilizado na resolução dos produtos. A resolução do conjunto de produtos em alta resolução pode ser realizada utilizando uma máquina, por exemplo, escolhida de máquinas que compreendem uma fonte de voltagem (por exemplo, um suprimento de energia DC), máquinas que compreendem uma fonte de pressão (por exemplo, uma bomba) e máquinas que compreendem uma coluna ou um capilar adequado para a realização de separações químicas. A máquina pode evidentemente compreender mais de um dos componentes anteriores.
[00065] A resolução dos produtos em alta resolução leva à produção de uma representação de tamanho e abundância de produto. Esta representação pode ser uma imagem ou um gráfico que um versado na técnica pode interpretar, visualmente ou com o auxílio de instrumentação tal como, por exemplo, um computador com software apropriado ou um densitômetro, para entender o(s) tamanho(s) e a(s) quantidade(s) dos produtos da reação. Em algumas modalidades, a representação é um eletroferograma, fotografia, gráfico, diagrama ou autorradiograma. A representação pode ser derivada ou registrada partindo de fótons ou partículas beta emitidas pelos produtos ou moléculas corantes ligadas aos produtos; estes podem ser detectados, por exemplo, de forma fotográfica ou eletronicamente e processados ou revelados para gerar a representação.
[00066] A invenção refere-se a métodos que compreendem a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG (isto é, quantas repetições de CGG ou repetições de trinucleotídeos geralmente, são compreendidas pelo molde) partindo da representação de tamanho e abundância de produto. Tal derivação pode compreender a contagem do número de espécies que podem ser observadas na representação para determinar o número de repetições (partindo do número de repetições compreendidas pelo produto menor, que pode, por exemplo, ser 4 ou 5) ou a estimativa do número de repetições com base na posição do produto maior que pode ser observado na representação.
[00067] Em algumas modalidades, uma região rica em CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR1 ou pela 5' UTR de FMR2.
[00068] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a detecção do fato de que os elementos interruptores estão presentes dentro da uma região rica em CGG. Em algumas modalidades, os elementos interruptores são trinucleotídeos AGG. A detecção do fato destes estarem presentes pode ser conseguida, por exemplo, através da determinação de posições no molde quando a ligação do primeiro iniciador foi substancialmente reduzida ou através da determinação de um conjunto de comprimentos em que a quantidade de produto é substancialmente reduzida comparada a comprimentos próximos. Por exemplo, se o 10- trinucleotídeo for AGG em uma região com pelo menos 14 repetições de trinucleotídeos totais e uma reação de amplificação for realizada envolvendo a utilização de um iniciador que compreende 4 repetições de CGG, seria esperado que os produtos com 10, 11, 12 e 13 repetições de CGG estivessem presentes em uma quantidade substancialmente reduzida em relação aos produtos próximos com 9 e 14 repetições. O grau até o qual a quantidade é reduzida pode variar de 25% a 95% ou mais, por exemplo, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. O grau de redução geralmente dependerá da zigosidade da amostra; por exemplo, uma amostra em que uma região rica em CGG é proveniente de um indivíduo heterozigoto em relação a um alelo que compreende uma região rica em CGG ou em relação a uma repetição de AGG específica, pode exibir uma redução na quantidade dos produtos correspondentes que varia de 25% até 75%. Uma amostra em que uma região rica em CGG é proveniente de um indivíduo hemizogoto ou homozigoto em relação a um alelo que compreende uma região rica em CGG ou em relação a uma repetição de AGG específica, pode exibir uma redução na quantidade dos produtos correspondentes que varia de 50% até 95% ou mais.
[00069] Em algumas modalidades, os métodos não requerem o uso de padrões ou calibradores externos tais como, por exemplo, padrões de referência ou escalas moleculares. Esta independência pode ser atingida porque em algumas modalidades, picos que correspondem a produtos que diferem no comprimento em uma repetição de trinucleotide© podem ser utilizados para somar o tamanho do produto maior, em que a contagem pode indicar o número de repetições no molde (sujeito a qualquer ajuste necessário de acordo com o número de repetições compreendidas pelo iniciador). Em algumas modalidades, o espaçamento entre picos em parte da representação de tamanho e quantidade de produto pode ser utilizado para estimar o tamanho do produto maior, por exemplo, por extrapolação; isto pode ser útil quando a resolução de picos que correspondem a números maiores de repetições é insuficiente para contar todos os picos até e incluindo aquele do produto maior.
[00070] Em algumas modalidades, os métodos podem determinar o número de repetições na região rica em CGG até dentro de 100, 50, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 repetições. A determinação de uma quantidade "dentro de 0 unidades" significa que seu valor preciso é determinado. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a determinação do número de repetições na região rica em CGG até dentro de 100, 50, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 repetições. Por exemplo, os métodos podem compreender a determinação do número de repetições na região rica em CGG que compreende menos de 70 repetições de CGG até dentro de 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 repetições; a determinação do número de repetições na região rica em CGG que compreende de 70 até 120 repetições de CGG até dentro de 10, 5, 4 ou 3 repetições; ou a determinação do número de repetições na região rica em CGG que compreende mais que 120 repetições de CGG, até aproximadamente 200 repetições de CGG, até dentro de 20, 10 ou 5 repetições. A determinação dos níveis de acurácia para regiões de repetição de CGG ainda maiores pode ser difícil devido à ausência de padrões conhecidos confiáveis.
[00071] Em algumas modalidades, os métodos podem determinar a posição de um elemento interruptor até dentro de 60, 45, 30, 15, 12, 9, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 nucleotídeos. A posição do elemento interruptor pode ser determinada, por exemplo, em termos da distância em relação a qualquer uma das extremidades da região rica em CGG.
[00072] Em algumas modalidades, pelo menos um dos iniciadores compreende um grupamento que pode ser detectado de forma radioativa ou de forma eletromagnética. Os grupamentos que podem ser detectados de forma radioativa incluem isótopos radioativos que emitem partículas detectáveis, tais como partículas beta ou gama, por exemplo, 14C, 3H, 32P, 33P, 35S e 125l. Os grupamentos que podem ser detectados de forma eletromagnética incluem entidades químicas que interagem com radiação eletromagnética (incluindo absorbância, emissão ou ambas) de uma maneira detectável, tais como cromóforos e fluoróforos, por exemplo, fluoresceína, FAM, corantes de cianina, corantes de rodamina etc.
[00073] Aspectos adicionais da invenção serão apresentados em parte na descrição a seguir e em parte serão óbvios partindo da descrição ou podem ser aprendidos através da prática da invenção. Os aspectos da invenção serão entendidos e atingidos através dos elementos e das combinações particularmente indicados nas reivindicações em anexo.
Breve Descrição dos Desenhos
[00074] Os desenhos em anexo, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram várias modalidades da invenção e junto com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.
[00075] A figura 1 resume a amplificação de um molde rico em CGG que compreende trinucleotídeos AGG. As sequências dos iniciadores são
Figure img0001
[00076] Um molde que compreende (CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)9 (SEQ ID NO: 42) é mostrado. Este representa uma região de repetição de CGG possível na 5' UTR de FMR1. O iniciador Tag-(GCC)4 pode se ligar internamente em várias posições na região de repetição; com o iniciador para frente marcado com FAM (FAM-FX-F), que se anela a montante da região de repetição de CGG, este pode amplificar um grande número de produtos da PCR. O amplicon de CGG mais curto terá 4 repetições de CGG e o amplicon de CGG mais longo compreenderão o comprimento completo da SEQ ID NO: 40. Quaisquer produtos que são significativamente mais longos que os produtos de comprimento completo são considerados produtos inespecíficos.
[00077] As figuras 2A e 2B mostram eletroferogramas de resultados da PCR de 5 amostras clínicas (AFM104, AFB107, ABB001, AFB011 e AMB12, como indicado nas áreas de diagrama na figura 2A e no painel esquerdo superior da figura 2B) e três padrões de Coriell (31/46 CGG, 31/54 CGG e 30/75 CGG, como indicado nas áreas de diagrama da figura 2B sem ser o esquerdo superior). Para as amostras clínicas, a sequência das regiões ricas em CGG que é determinada através do sequenciamento é listada nas áreas de diagrama. Para os padrões de Coriell, a repetição do conteúdo de CGG dos dois alelos da UTR a 5' de FMR1 presentes na amostra como indicado pelo eletroferograma é listada como "Confirmada". Os picos selecionados são marcados com o número de trinucleotídeos CGG compreendido pelo produto que corresponde ao pico. As unidades no eixo vertical representam intensidade de fluorescência e são arbitrárias. As unidades no eixo horizontal representam o tamanho estimado em nucleotídeos. Estes tamanhos estimados foram determinados com base no número de varreduras (relacionado ao tempo de retenção) do instrumento de CE.
[00078] As figuras 3A e 3B mostram eletroferogramas de resultados da PCR de oito padrões de Coriell. Em cada um, o pico que corresponde ao número de trinucleotídeos CGG máximo detectado é indicado quando este poderia ser resolvido. Em casos em que o número de trinucleotídeos diferia da designação de Coriell ou quando os trinucleotídeos AGG são detectados, a sequência deduzida partindo do eletroferograma é indicada na área do diagrama. No painel direito superior da figura 3B, nem todos os picos que correspondem a espécies de produtos individuais podiam ser observados, mas a posição do pico mais à direita correspondia a um conteúdo estimado de 122 trinucleotídeos CGG. Nos dois painéis inferiores, a amplificação de produtos próximos do comprimento completo dos alelos mais longos não foi detectada. Os marcadores dos eixos horizontal e vertical são como na figura 2A.
[00079] A figura 4 representa um ensaio que utiliza três iniciadores. FMR1R-FAM se anela a jusante da região de repetição de CGG e compreende um fluoróforo FAM, para utilização na detecção de produtos. O iniciador quimérico compreende repetições de CGG e também um flap a 5' que se combina com a sequência do terceiro iniciador, neste caso FMR1-F, que se anela ao molde original como indicado, mas também se anela aos produtos que compreendem a sequência do iniciador quimérico. O iniciador quimérico é fornecido em uma concentração menor de forma que é consumido rapidamente de forma a limitar a redução progressiva no tamanho do produto de ciclo para ciclo.
[00080] A figura 5 mostra eletroferogramas de resultados da PCR partindo de um ensaio com três iniciadores dos padrões de Coriell heterozigotos indicados em cada área do diagrama. Os marcadores dos eixos horizontal e vertical são como na figura 2A. Em cada painel, o pico mais alto corresponde ao mais curto dos dois alelos presentes na amostra e é indicado de acordo com o número de repetições de CGG determinado através deste ensaio. Os picos foram contados até o 1902 pico, que é mostrado na forma de um aumento de inserção.
[00081] A figura 6 mostra eletroferogramas de resultados da PCR partindo de cinco amostras de DNA genômico (painéis A, B, C, D e E). Os painéis A, B e C são derivados de amostras de DNA genômico do sexo masculino. Os painéis D e E são derivados de amostras de DNA genômico do sexo feminino. Os picos selecionados são marcados com o número de trinucleotídeos CGG compreendido pelo produto que corresponde ao pico. As sequências previstas de alelos genômicos são listadas nas áreas de diagrama. As unidades no eixo vertical representam a intensidade de fluorescência e são arbitrárias. As unidades no eixo horizontal representam o tamanho estimado em nucleotídeos. Como descrito nos Exemplos, as amostras que foram utilizadas para gerar os perfis dos painéis A-E foram determinadas como possuindo regiões de repetição de CGG com as sequências a seguir. Painel A: 5'-(CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)9-3' (SEQ ID NO: 46). Painel B: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)27-3' (SEQ ID NO: 47). Painel C: 5'-(CGG)6I-3' (SEQ ID NO: 48). Painel D: 5'-(CGG)2o-3' (SEQ ID NO: 49) e 5'-(CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)IO-3' (SEQ ID NO: 50). Painel E: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 51) e 5'- (CGG)IOAGG(CGG)86-3' (SEQ ID NO: 46).
[00082] A figura 7 mostra eletroferogramas de CE previstos (painéis do lado esquerdo superiores e inferiores) para duas atribuições de repetição de AGG diferente para alelos diferentes (painel superior, 5'- (CGG)9AGG(CGG)IO-3' (SEQ ID NO: 53) e 5'-(CGG)IOAGG(CGG)2O-3' (SEQ ID NO: 54); painel inferior, 5'-(CGG)2o-3' (SEQ ID NO: 49) e 5'- (CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)IO-3' (SEQ ID NO: 50)) e um eletroferograma de CE de simulação para os produtos de amplificação de ambos os alelos (painel direito inferior). O eletroferograma de CE observado é mostrado no painel direito superior.
[00083] A figura 8 representa oito ensaios de amplificação que podem ser utilizados nos métodos da invenção. FMR1_F se anela a montante da região de repetição de CGG. FMR1_R se anela a jusante da região de repetição de CGG. FMR1_F_FAM e FMR1_R_FAM correspondem aos mesmos dois iniciadores respectivamente, mas compreendendo um fluoróforo FAM, para utilização na detecção de produtos. FMR1_F_(CGG)n é um iniciador quimérico que compreende repetições de CGG e um flap a 5' que se combina com a sequência de FMR1_F, que se anela ao molde original como indicado e também se anela aos produtos que compreendem a sequência do iniciador quimérico. O iniciador quimérico pode ser fornecido em uma concentração menor de forma que é consumido rapidamente, de forma a limitar a redução progressiva no tamanho do produto de ciclo para ciclo. FMR1_R_(CCG)n é um iniciador quimérico que compreende repetições de CCG e um flap a 5' que se combina com a sequência de FMR1_R, que se anela ao molde original como indicado e também se anela a produtos que compreendem a sequência do iniciador quimérico. FMR1_F_(CGG)nA é um iniciador quimérico que corresponde a FMR1_F_(CGG)n, mas também que possui um dA 3' terminal. O dA 3' terminal se anela à T na fita de DNA na região de complementaridade com a sequência de AGG presente em algumas regiões de repetição de CGG. FMR1_R_(CCG)nCCT é um iniciador quimérico com a mesma sequência que FMR1_R_(CCG)n, mas também que possui um dCdCdT 3' terminal. O dCdCdT terminal se anela à sequência de AGG presente na fita de DNA complementar em algumas regiões de repetição de CGG. As sequências dos iniciadores utilizados para estes ensaios podem ser, por exemplo:
Figure img0002
[00084] As sequências de FMR_F e FMR_R mostradas podem ser substituídas por qualquer outra sequência de iniciador adequada das regiões a 5' e a 3' que flanqueiam as repetições de CGG, respectivamente.
[00085] A figura 9 resume a amplificação de um molde rico em CGG que compreende trinucleotídeos AGG, de acordo com o esquema de PCR mostrado na figura 8H. As partes superior e inferior da figura representam duas configurações alélicas possíveis presentes na amostra de DNA genômico cujo eletroferograma de CE real é mostrado na figura 6D. A parte superior resume a amplificação de dois alelos incluindo um alelo de 31 repetições que possui uma sequência de AGG presentes após a 10â repetição de CGG (5'- (CGG)IOAGG(CGG)2O3' (SEQ ID NO: 54)) e um alelo de 20 repetições que possui um AGG presente após a 9- repetição de CGG (5'- (CGG)gAGG(CGG)w-3' (SEQ ID NO: 53)). A parte inferior resume a amplificação de dois alelos incluindo um alelo de 20 repetições que não possui sequência de AGG dentro das repetições de CGG (5'- (CGG)2O-3' (SEQ ID NO: 49)) e um alelo de 31 repetições que possui um AGG presente na posição de repetição 11 e um AGG na posição 21 da repetição (5'-(CGG)ioAGG(CGG)gAGG(CGG)io-3' (SEQ ID NO: 50)). O painel à direita mostra um eletroferograma de CE real dos produtos de amplificação partindo da amostra de DNA genômico, demonstrando a presença de produtos de amplificação que representam a configuração alélica na parte inferior da figura.
[00086] A figura 10 mostra eletroferogramas de CE simulados de produtos da amplificação de alelos que seriam gerados através do esquema de PCR mostrado na figura 8B partindo da amostra de DNA genômico cujo eletroferograma de CE real é mostrado na figura 6E e que contém alelos que possuem 46 e 97 repetições de CGG. Após a amplificação de acordo com o esquema de PCR na figura 8B, duas configurações alélicas possíveis (painéis esquerdos, 5'- (CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 51) e 5'- (CGG)IOAGG(CGG)86-3' (SEQ ID NO: 52); painéis direitos, 5'-(CGG)46-3' (SEQ ID NO: 55) e 5'-(CGG)i0AGG(CGG)49AGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 56)) gerariam eletroferogramas de CE idênticos como mostrado nos painéis inferiores esquerdos e direitos e na figura 6E.
[00087] A figura 11 mostra eletroferogramas de CE simulados de produtos da amplificação de alelos que seriam gerados através do esquema de PCR mostrado na figura 8D partindo da amostra de DNA genômico cujo eletroferograma de CE real é mostrado na figura 6E e que contém alelos que possuem 46 e 97 repetições de CGG. Esta figura simula os produtos de amplificação partindo das duas configurações alélicas possíveis (painéis esquerdos, 5'- (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 51) e 5'- (CGG)IOAGG(CGG)86-3' (SEQ ID NO: 52); painéis direitos, 5'-(CGG)4^3' (SEQ ID NO: 55) e 5'-(CGG)IOAGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 56)), após a amplificação através do esquema de ensaio da PCR mostrado na figura 8D, em que a característica de direção do iniciador de repetição (FMR_R_(CCG)n) é invertida. Os dois cenários de alelos gerariam perfis de CE diferentes (figura 11, painéis inferiores).
[00088] A figura 12 mostra um eletroferograma de CE real de produtos da amplificação de alelos partindo da mesma amostra de DNA genômico descrita nas descrições das figuras 10 e 11 acima (que contêm o alelo de repetição de CGG 46/97). Os eletroferogramas de CE foram gerados partindo de amostras amplificadas de acordo com o esquema de ensaio de PCR na figura 8B (painel superior) ou na figura 8F (painel inferior).
[00089] A figura 13 mostra de forma esquemática os produtos de amplificação esperados partindo da mesma amostra de DNA genômico descrita nas descrições das figuras 10, 11 e 12 acima (que contêm o alelo de repetição de CGG 46/97) (5- (CGG)9AGG(CGG)gAGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 51), 5'- (CGG)IOAGG(CGG)86-3' (SEQ ID NO: 52), 5'-(CGG)46-3' (SEQ ID NO: 55) e 5'-(CGG)IOAGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 56)), após a amplificação através do esquema de ensaio da PCR mostrada na figura 8F.
[00090] A figura 14 mostra de forma esquemática os produtos de amplificação que seriam esperados utilizando o esquema de ensaio de PCR da figura 8H, após a amplificação do DNA genômico (descritos nas descrições das figuras 10-13 acima e que contêm o alelo de repetição de CGG 46/97) com dois cenários de alelos diferentes (parte superior da figura: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 51) e 5'-(CGG)ioAGG(CGG)δ6-3' (SEQ ID NO: 52); parte inferior da figura: 5'-(CGG)46-3' (SEQ ID NO: 55) e 5,-(CGG)IOAGG(CGG)49AGG(CGG)9AGG(CGG)26-3' (SEQ ID NO: 56)). O ensaio de PCR da figura 8H utiliza um iniciador dT ancorado com orientação inversa (FMR1_R_(CCG)nCCT) (figura 8H). Este ensaio deve produzir um eletroferograma de CE com picos de 14, 15 e 24 equivalentes de tamanhos de CGG para o cenário de alelos representado na parte superior da figura, em que o alelo de repetição 46 possui dois AGGs e o alelo de repetição 97 possui um AGG ou o ensaio deve produzir um eletroferograma de CE com picos de 15, 65 e 75 equivalentes de tamanhos de CGG para o cenário de alelos representado na parte inferior da figura, em que o alelo de repetição 46 não possui AGG e o alelo de repetição 97 possui todos os três AGGs. A figura também mostra o eletroferograma de CE real (parte direita superior da figura) após a amplificação desta amostra de DNA genômico. O eletroferograma é coerente com o cenário de alelos mostrado na parte superior esquerda da figura.
[00091] A figura 15 descreve eletroferogramas de CE após a amplificação de amostras de DNA genômico e amostras de DNA genômico misturadas, de acordo com o método de ensaio da invenção mostrado na figura 8C. Duas amostras de DNA diferentes, uma possuindo um alelo de repetição de CGG 30 (painel A) e outra possuindo um alelo de repetição de CGG 645 (painel B) foram analisadas separadamente. Uma combinação artificial de DNA cromossômico destas duas amostras (painel C) também foi analisada para demonstrar que o método era capaz de mapear a presença ou a ausência de trinucleotídeos AGG próximos às extremidade a 5' de repetições de CGG longas na presença de um alelo mais curto que possui inserções de trinucleotídeos AGG.
[00092] A figura 16 mostra eletroferogramas de CE após a amplificação de DNA cromossômico partindo da amostra 20 (Tabela 4). A amostra possui dois alelos principais, dos quais um é um alelo de mutação completa e dois alelos menos importantes. Acredita-se que a configuração alélica seja derivada de uma população de mosaico de células dentro da amostra. Painel A, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8A. Painel B, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8H. Painel C, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8D. Em adição à demonstração das capacidades de mapeamento de AGG/CGG dos ensaios, os dados também demonstram a presença de um trinucleotídeo AGG em um alelo de mutação completa.
[00093] A figura 17 mostra eletroferogramas de CE após a amplificação de DNA cromossômico partindo da amostra 27 (Tabela 4). Painel A, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8A. Painel B, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8H. Painel C, produtos de amplificação após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8C. Observar que o Painel C é mostrado em uma escala mais próxima que o Painel A, de forma que a região onde o pico de comprimento completo apareceria não é visível.
[00094] A figura 18 mostra eletroferogramas de CE após a amplificação de DNA cromossômico partindo das amostras 6 e 20 (Tabela 4). Os Painéis A e B mostram produtos de amplificação partindo das amostras 6 e 20 respectivamente, após a amplificação pela PCR através do esquema mostrado na figura 8F. Como descrito nos Exemplos, foi determinado que as amostras que foram utilizadas para gerar os perfis dos painéis A e B possuem regiões de repetição de CGG de mosaico, compostas das sequências de repetição de CGG a seguir. Painel A: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3' (SEQ ID NO: 57), 5'- (CGG)9AGG(CGG)7AGG(CGG)24-3' (SEQ ID NO: 58) (alelo menos importante) e 5'-(CGG)9AGG(CGG)7AGG(CGG)42-3' (SEQ ID NO: 59). Painel B: 5'-(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9-3' (SEQ ID NO: 57), 5'- (CGG)9AGG(CGG)44-3' (SEQ ID NO: 60) e 5'-(CGG)9AGG(CGG)6o-3' (SEQ ID NO: 61).
[00095] A figura 19 representa um fluxo de trabalho para o mapeamento de trinucleotídeos AGG dentro das repetições de CGG na região não traduzida a 5' dos genes FMR1 e FMR2. Os Ensaios A, C, G e F referem-se aos ensaios de PCR correspondentes mostrados na figura 8. Listagem de Exemplos de Modalidades 1. Um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos dois iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG; (b) a realização da PCR com os pelo menos dois iniciadores diferentes e o pelo menos um molde que compreende a pelo menos uma região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora. 2. Um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos três iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um flap a 5', um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG e um terceiro iniciador que possui uma sequência compreendida pelo flap a 5' do primeiro iniciador, em que o primeiro iniciador é fornecido em uma concentração menor que a do terceiro iniciador; (b) a realização da PCR com os pelo menos três iniciadores diferentes e o pelo menos um molde, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto; e (d) a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou quando dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação. 3. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, que compreende a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG da dita representação. 4. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, que compreende a derivação de informação em relação a quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação. 5. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a sequência interruptora é um elemento de AGG. 6. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, que compreende ainda a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG da dita representação. 7. O método da modalidade 6, em que a dita informação em relação ao número de repetições de CGG determina se a região de repetição rica em CGG compreende mais ou menos que 200 repetições de CGG. 8. O método da modalidade 6, em que a dita informação em relação ao número de repetições de CGG determina o número de repetições de CGG presente na região rica em CGG. 9. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, com a condição de que um padrão ou um calibrador externo não é utilizado na derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação. 10. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que uma região rica em CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR1. 11. 0 método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que uma região rica em CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR2. 12. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a técnica de alta resolução pode resolver produtos que diferem no comprimento em 3 nucleotídeos ou pares de bases. 13. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a técnica de alta resolução é eletroforese por capilaridade. 14. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a técnica de alta resolução é eletroforese em gel de poliacrilamida. 15. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a representação é um eletroferograma. 16. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a representação é uma imagem ou um gráfico registrado partindo de fótons ou partículas beta emitidas pelos produtos da PCR ou pelas moléculas de corante ligadas aos produtos. 17. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação compreende a determinação das posições quando a ligação do primeiro iniciador era substancialmente reduzida. 18. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação compreende a determinação de um ou mais comprimentos dos produtos em que a quantidade de produto é substancialmente reduzida comparada com a quantidade dos produtos com comprimentos próximos. 19. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação compreende a determinação de um ou mais comprimentos dos produtos em que a quantidade de produto é reduzida em pelo menos 50% comparada com a quantidade dos produtos com comprimentos próximos. 20. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação compreende a determinação de um ou mais comprimentos dos produtos em que a quantidade de produto é reduzida em pelo menos 90% comparada com a quantidade dos produtos com comprimentos próximos. 21. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que a derivação de informação em relação ao fato de que uma sequência interruptora está presente na região rica em CGG ou quando dentro da uma região rica em CGG fica localizada uma sequência interruptora da dita representação compreende a determinação de um ou mais comprimentos dos produtos em que a quantidade de produto é reduzida em pelo menos 25% comparada com a quantidade dos produtos com comprimentos próximos, em que uma região rica em CGG é proveniente de um indivíduo heterozigoto para o alelo que compreende uma região rica em CGG. 22. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que o primeiro iniciador compreende quatro ou cinco repetições de CGG ou CCG. 23. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que o segundo iniciador é escolhido das SEQ ID Nos: 1-38. 24. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que pelo menos um dos iniciadores compreende um grupamento que pode ser detectado de forma radioativa ou de forma eletromagnética. 25. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que pelo menos um dos iniciadores compreende um fluoróforo. 26. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que o método é um ensaio ancorado. 27. 0 método da modalidade 26, em que o primeiro iniciador compreende uma subsequência escolhida de A, T, AG, CT, AGG e CCT entre ou na extremidade a 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. 28. 0 método da modalidade 27, em que o primeiro iniciador compreende um A na extremidade a 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. 29. 0 método da modalidade 27, em que o primeiro iniciador compreende um CCT na extremidade a 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. 30. O método da modalidade 26, que compreende ainda a detecção de pelo menos um elemento interruptor compreendido pela pelo menos uma região rica em CGG. 31. O método da modalidade 30, que compreende ainda a determinação do fato de que a amostra compreende alelos principais ou menos importantes com elementos interruptores posicionados de forma diferente. 32. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, em que o método é um ensaio não ancorado. 33. O método da modalidade 2, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 100 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 34. O método da modalidade 2, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 500 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 35. O método da modalidade 2, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 900 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 36. O método da modalidade 2, em que o segundo iniciador se anela a jusante da região rica em CGG e o terceiro iniciador se anela a montante da região rica em CGG. 37. O método da modalidade 2, em que o segundo iniciador se anela a montante da região rica em CGG e o terceiro iniciador se anela a jusante da região rica em CGG. 38. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, que compreende ainda o fornecimento de pelo menos um primeiro iniciador adicional e opcionalmente um segundo iniciador adicional, o primeiro iniciador adicional compreendendo as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de uma segunda PCR com pelo menos o primeiro iniciador adicional, um iniciador escolhido do segundo iniciador da etapa (a) e o segundo iniciador adicional e o pelo menos um molde, em que a segunda PCR produz um segundo conjunto de produtos; e uma resolução do segundo conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma segunda representação de tamanho e abundância de produto;
[00096] em que o primeiro iniciador da etapa (a) possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem um elemento interruptor e em que o primeiro iniciador adicional possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem um elemento interruptor. 39. 0 método da modalidade 38, em que o primeiro iniciador adicional compreende um A na extremidade a 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. 40. 0 método da modalidade 38, em que o primeiro iniciador adicional compreende um T na extremidade a 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC. 41. O método da modalidade 38, que compreende ainda a determinação de pelo menos um comprimento da pelo menos uma região rica em CGG. 42. 0 método da modalidade 41, em que a amostra compreende o material genético das células que possui uma ploidia de pelo menos 2 em relação à região de CGG e o método compreende a determinação de pelo menos dois comprimentos de pelo menos duas regiões ricas em CGG. 43. 0 método da modalidade 41, em que a amostra compreende um alelo que compreende uma região rica em CGG que compreende pelo menos 100 repetições de CGG. 44. O método da modalidade 38, que compreende ainda a determinação do fato de que a amostra compreende alelos principais ou menos importantes com elementos interruptores posicionados de forma diferente. 45. 0 método da modalidade 38, em que o primeiro iniciador adicional está orientado de forma oposta em relação ao primeiro iniciador. 46. 0 método da modalidade 45, em que o primeiro iniciador se liga à região rica em CGG com sua extremidade a 3' orientada a jusante e o primeiro iniciador adicional se liga à região rica em CGG com sua extremidade a 3' orientada a montante. 47. 0 método da modalidade 46, em que o método compreende a detecção de pelo menos um elemento interruptor e a determinação do tamanho da região rica em CGG que compreende o pelo menos um elemento interruptor. 48. 0 método da modalidade 47, em que a amostra compreende pelo menos o primeiro e o segundo alelos e o primeiro e o segundo alelos compreendem regiões ricas em CGG de comprimentos diferentes. 49. O método da modalidade 38, que compreende ainda o fornecimento de pelo menos um terceiro iniciador adicional e opcionalmente um quarto iniciador adicional, o terceiro iniciador adicional compreendendo as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de um terceiro PCR com pelo menos o terceiro iniciador adicional, um iniciador escolhido do segundo iniciador adicional e o quarto iniciador adicional e o pelo menos um molde, em que a terceira PCR produz um terceiro conjunto de produtos; e uma resolução do terceiro conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma terceira representação de tamanho e abundância de produto;
[00097] em que o terceiro iniciador adicional está orientado de forma oposta em relação ao primeiro iniciador da etapa (a) e é diferente do primeiro iniciador adicional. 50. O método da modalidade 49, que compreende ainda a determinação da presença ou da ausência de elementos interruptores dentro de 150 pb de qualquer uma das extremidades de pelo menos um alelo compreendido pela amostra. 51. O método da modalidade 50, que compreende ainda a determinação de pelo menos uma posição de pelo menos um elemento interruptor compreendido por o pelo menos um alelo. 52. O método de qualquer uma das modalidades 1 ou 2, que compreende ainda o fornecimento de pelo menos um primeiro iniciador adicional e um segundo iniciador adicional, o primeiro iniciador adicional compreendendo as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de uma segunda PCR com pelo menos o primeiro iniciador adicional e o segundo iniciador adicional e o pelo menos um molde, em que a segunda PCR produz um segundo conjunto de produtos; e uma resolução do segundo conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma segunda representação de tamanho e abundância de produto;
[00098] em que o primeiro iniciador adicional está orientado de forma oposta ao primeiro iniciador da etapa (a). 53. O método da modalidade 52, em que pelo menos um do primeiro iniciador e o primeiro iniciador adicional possuem uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem elementos interruptores. 54. 0 método da modalidade 53, em que o primeiro iniciador possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem elementos interruptores e o primeiro iniciador adicional possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem elementos interruptores. 55. 0 método da modalidade 54, em que a amostra compreende pelo menos dois alelos que compreende regiões ricas em CGG de comprimentos diferentes, que compreende ainda a determinação dos comprimentos dos pelo menos dois alelos. 56. O método da modalidade 55, que compreende ainda a detecção de pelo menos um elemento interruptor e a determinação do comprimento do alelo pelo qual o pelo menos um elemento interruptor é compreendido. 57. Um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos dois iniciadores diferentes, em que o primeiro iniciador compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e o segundo iniciador se anela a uma posição fora da região rica em CGG; (b) a realização da PCR com os pelo menos dois iniciadores diferentes e um molde que compreende uma região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto em que os produtos que diferem no comprimento em três nucleotídeos são resolvidos; e (d) a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG da dita representação. 58. Um método de análise de pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, que compreende: (a) o fornecimento de três iniciadores diferentes, em que o primeiro iniciador compreende as repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um flap a 5', o segundo iniciador se anela a uma posição fora da região rica em CGG, o terceiro iniciador possui a mesma sequência do flap a 5' do primeiro iniciador e o primeiro iniciador é fornecido em uma concentração menor que a do terceiro iniciador; (b) a realização da PCR com os três iniciadores diferentes e um molde que compreende uma região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância de produto em que os produtos que diferem no comprimento em três nucleotídeos são resolvidos; e (d) a derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG da dita representação. 59. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a dita informação em relação ao número de repetições de CGG determina se a região de repetição rica em CGG compreende mais ou menos que 200 repetições de CGG. 60. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a dita informação determina o número de repetições de CGG presente na região rica em CGG. 61. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, com a condição de que um padrão ou um calibrador externo não é utilizado na derivação de informação em relação ao número de repetições de CGG. 62. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que uma região rica em CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR1. 63. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que uma região rica em CGG é compreendida pela 5' UTR de FMR2. 64. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a técnica de alta resolução pode resolver produtos que diferem no comprimento em 3 nucleotídeos ou pares de bases. 65. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a técnica de alta resolução é eletroforese por capilaridade. 66. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a técnica de alta resolução é eletroforese em gel de poliacrilamida. 67. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a representação é um eletroferograma. 68. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que a representação é uma imagem ou um gráfico registrado partindo de fótons ou partículas beta emitidas pelos produtos da PCR ou pelas moléculas de corante ligadas aos produtos. 69. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que o primeiro iniciador compreende quatro ou cinco repetições de CGG ou CCG. 70. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que o segundo iniciador é escolhido das SEQ ID Nos: 1-38. 71. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que pelo menos um dos iniciadores compreende um grupamento que pode ser detectado de forma radioativa ou de forma eletromagnética. 72. O método de qualquer uma das modalidades 57 ou 58, em que pelo menos um dos iniciadores compreende um fluoróforo. 73. 0 método da modalidade 58, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 100 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 74. 0 método da modalidade 58, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 500 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 75. 0 método da modalidade 58, em que o primeiro iniciador e o terceiro iniciador são fornecidos em concentrações tais que o terceiro iniciador é pelo menos 900 vezes mais abundante que o primeiro iniciador por molaridade. 76. 0 método da modalidade 58, em que o segundo iniciador se anela a jusante da região rica em CGG e o terceiro iniciador se anela a montante da região rica em CGG. 77. 0 método da modalidade 58, em que o segundo iniciador se anela a montante da região rica em CGG e o terceiro iniciador se anela a jusante da região rica em CGG. 78. Um oligonucleotídeo que compreende uma sequência escolhida da SEQ ID NO: 44 e da SEQ ID NO: 45. EXEMPLOS
[00099] Será feita agora referência em detalhes a modalidades da invenção, aspectos e resultados os quais são ilustrados nos desenhos em anexo. Com a finalidade de clareza e continuidade, vários segmentos de discussão e interpretação dos métodos e dos resultados de certos exemplos são fornecidos imediatamente depois; a apresentação de resumos dos exemplos após estes segmentos.
Exemplo 1: Determinação do número de repetições de CGG e da posição de AGG no promotor de FMR1 para alelos com premutação normal e baixa através do ensaio da PCR com iniciadores repetidos e eletroforese por capilaridade de alta resolução
[000100] Oito amostras de DNA genômico que contêm números de repetições de CGG com premutação normal a baixa (5 amostras clínicas: AFM104, AFB107, ABB001, AFB011 e AMB12; e três padrões de Coriell: 31/46 CGG, 31/54 CGG e 30/75 CGG) foram avaliadas como a seguir. Os iniciadores utilizados eram as SEQ ID NOs: 38-39. As condições de reação da PCR que foram utilizadas se baseavam em um protocolo publicado (Saluto e outros, J. Mol. Diagn. 7: 605-12 (2005)) com ligeiras modificações. 15 até 20 ng do DNA genômico foram amplificados em um tampão de reação que contém Roche Expand Long Molde PCR buffer 2 (Roche Cat. No. 11681834001) mais betaína a 2,2 M (Sigma Cat. N° B0300-1VL), 250 pM de cada dNTP (Roche, GMP Grade Cat. No. G 04631129103, C 04631072103, A 04631056103, T 04631137103), 1,5 pM de cada iniciador e 1,25 U de Roche GMA recombinant Taq DNA polymerase (Roche, Cat. No. 03734935001), em urn volume de reação de 15 pL. As condições de ciclos da PCR eram 95°C durante 5 min; então 10 ciclos de 97°C durante 35 s - 62°C durante 35 s - 68°C durante 4 min; então 20 ciclos de 97°C durante 35 s - 62°C durante 35 s - 68°C durante 4 min com autoextensão de 20 s por ciclo. 1 pL de produtos da PCR foi misturado com 2 pL de ROX 1007 ladder (preparado de acordo com DeWoody e outros, Biotechniques 37:348, 350, 352 (2004)) em 12 pL de Hi-Di™ Formamida (Applied Biosystems (ABI) parte no. 4311320) e desnaturado com calor a 95°C durante 2 min antes da eletroforese por capilaridade em um instrumento ABI 3130x1 com comprimento do capilar de 36 cm utilizando o polímero líquido POP7 (ABI parte no. 4352759). Os eletroferogramas resultantes são mostrados nas figuras 2A e 2B.
[000101] Os picos nos eletroferogramas foram numerados começando com 4, o conteúdo mínimo possível de CGG do produto. Uma redução grave na intensidade de pico do pico n até n+1, por exemplo, do pico 10 até 11, era indicativa da presença de um trinucleotídeo AGG na posição que corresponde ao pico n+1. Um trinucleotídeo resultou em quatro picos de baixa intensidade, acreditados como ocorrendo porque o trinucleotídeo AGG reduziu a afinidade do iniciador que contém CGG para todas as quatro posições de ligação que abrangem tal trinucleotídeo (lembrar que o iniciador, com a sequência da SEQ ID NO: 39, continha quatro repetições de CGG). O número total de trinucleotídeos foi determinado através da contagem do número total de picos, com o primeiro sendo numerado com 4 como descrito anteriormente. Acredita-se que o pico pequeno à direita de cada painel da figura 2A e no painel esquerdo superior da figura 2B resulta dos eventos de anelamento em que apenas 3 repetições de CGG do iniciador e o molde são anelados e assim não refletem o comprimento real do molde. O conteúdo total de repetições e as localizações de repetições de trinucleotídeos AGG foram confirmados através do sequenciamento das cinco amostras clínicas (ver a Tabela 1) através de técnicas padronizadas. Para todas as cinco amostras clínicas, os resultados obtidos através do método divulgado concordavam com os resultados obtidos através do sequenciamento. Tabela 1
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Exemplo 2: Dificuldade de determinação do número de repetições e da posição em alguns alelos longos de amostras do sexo feminino com ensaio de PCR iniciada com repetição de dois iniciadores
[000102] Para avaliar este ensaio com amostras que compreendem repetições de CGG partindo da faixa de mutação normal até completa, foi testado outro conjunto de oito amostras, a saber, duas amostras clínicas de sangue total (IDs das Amostras 00100 e 00065, que correspondem aos painéis da figura 3 rotulados 69 CGG e 87 CGG) e seis amostras de DNA genômico de linhagem de célula Coriell (com a denominação de Coriells indicando 56, 76, 96, 118, 20/183-193 e 28/336 CGG). As reações de PCR foram realizadas como descrito no Exemplo 1. Os eletroferogramas resultantes são mostrados nas figuras 3A-3B. Nestes eletroferogramas, o pico final a ser contado foi determinado por inspeção visual. Para todas as seis amostras provenientes de indivíduos do sexo masculino (todos os painéis da figura 3A e os dois painéis superiores da figura 3B), este ensaio era capaz de determinar tanto o tamanho (número de repetições) quanto a posição de trinucleotídeos AGG (ver a Tabela 2). Os números de repetições concordavam com as denominações de Coriell ou com o número obtido através do sequenciamento até dentro de 4%. O ensaio não era capaz de detectar o número completo de repetições presente nos alelos mais longos das amostras femininas (painéis inferiores da figura 3B). Tabela 2
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Exemplo 3: Determinação do número de repetições de CGG e da posição de AGG alelos de premutação alta e de mutação completa utilizando um sistema de três iniciadores modificado para PCR iniciada com repetição
[000103] Para aumentar o número de repetições que poderiam ser detectadas, o procedimento foi modificado como descrito na figura 4. Três iniciadores foram utilizados. O primeiro iniciador era um iniciador quimérico que continha 5 repetições de CGG na extremidade a 3' e tinha a sequência da SEQ ID NO: 41. O segundo iniciador era um iniciador inverso em relação ao primeiro iniciador; este segundo iniciador tinha a sequência da SEQ ID NO: 37. O terceiro iniciador ficava orientado para frente em relação ao iniciador quimérico e tinha a mesma sequência que o iniciador quimérico, mas sem as 5 repetições de CGG. O iniciador quimérico era fornecido em uma concentração, 1,5 nM, aproximadamente 1000 vezes abaixo daquela do segundo e do terceiro iniciadores (cada um a 1,5 pM), de forma que o iniciador quimérico fosse eliminado dentro dos primeiros poucos ciclos da PCR. As outras condições eram como no Exemplo 1. Este procedimento, realizado com moldes como indicado na figura 5, resultou em produtos sendo obtidos que tinham até aproximadamente 196-199 repetições no experimento representado pelo painel superior. Este valor era próximo, mas ligeiramente mais alto que a denominação de Coriell de 183-193 repetições de CGG. No experimento representado pelo painel inferior, um pico era observado muito à direita do eletroferograma, rotuladas 336 repetições de CGG de acordo com a denominação de Coriell. O número aparente de repetições ficava entre 250-300 repetições, mas este tamanho aparente não era considerado preciso porque se acredita que o tamanho deste produto não está dentro da faixa em que CE baseado no polímero POP-7 pode resolver produtos que contêm repetições de CGG de forma acurada de acordo com o tamanho. Com CE baseado no polímero POP-7, os produtos que contêm mais que aproximadamente 200 repetições de CGG tendem a ter tamanhos aparentes encurtados artificialmente. Assim, este resultado indicava que o pico representava um produto com um número de repetições não menor que 250. Em ambos os painéis, foram observados picos na posição esperada aproximada para um produto com o número de repetições indicado pelos alelos mais curtos listados nas denominações de Coriell, estas denominações sendo 20 para o painel superior e 28 para o painel inferior (o pico grande mostrado neste painel correspondia a um número de repetições de 29). Em cada painel, o pico correspondente ao alelo mais longo (Números de repetições denominados por Coriell 183-193 e 336) era mais amplo que os picos para produtos contendo números de repetições individuais. A largura do pico 183-193 CGG no painel superior da figura 5 parecia ser de aproximadamente 5-10 repetições de CGG ou 15-30 pb. Observar que o pico mais à esquerda em cada eletroferograma da figura 5 correspondia a 5 CGG, devido ao iniciador quimérico que contém 5 repetições de CGG.
Exemplo 4: Determinação da localização de AGG dentro das repetições de CGG do promotor de FMR1 em alelos masculinos através de um sistema de três iniciadores modificado para PCR iniciada com repetição
[000104] Cinco amostras de DNA genômico contendo alelos com números de repetições de CGG na faixa de premutação normal a baixa (30 CGG, 47 CGG, 61 CGG, 20/31 CGG e 46/97 CGG) foram avaliadas. Para concisão, os números de repetições de CGG listados refletem o número total de trinucleotídeos, isto é, a soma do número de trinucleotídeos CGG e o número de trinucleotídeos AGG interruptores. As amostras foram amplificadas pela PCR através da preparação de uma mistura mestre que contém 11,45 pL de GC-Rich AMP buffer (Asuragen Cat. No. #49387), 1,5 pL de FAM-labeled FMR1 Primers (Asuragen Cat. No. #49386; FMR1_F (SEQ. ID NO: 14), FMR1_R_FAM (SEQ. ID NO: 37 que possui um 5'FAM)), 0,5 pL de FMR1_F_(CGG)n (SEQ. ID NO: 41) (Asuragen Cat. No. #49393), 0,5 pL de água livre de nuclease e 0,05 pL de GC-rich Polymerase Mix (Asuragen Cat. N° #49388) da Asuragen Inc. (Austin, TX, USA). A mistura mestre da PCR foi misturada com vortex antes de distribuir em uma placa para microtitulação (placas de 96 ou 384 poços, Fenix Research Products, Candler, NC, USA). As concentrações de reação finais de FMR_F e FMR_R_FAM eram de 1,3 pM e concentração de reação final de FMR1_F_(CGG)n era de 1,3 nM. Alíquotas das amostras de DNA genômico, tipicamente 1 pL a 20 ng/pL, foram transferidas para cada poço da placa para microtitulação. Folhas de filme de alumínio ABgene (Thermo Fisher Scientific) foram utilizadas para selar as placas. As placas seladas foram misturadas com vortex, centrifugadas e transferidas para um termociclador (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA). As amostras foram amplificadas com uma etapa de desnaturação com calor inicial de 95°C durante 5 min, seguida por 10 ciclos de 97°C durante 35 s, 62°C durante 35 s, 68°C durante 4 min e então 20 ciclos de 97°C durante 35 s, 62°C durante 35 s e 68°C durante 4 min com uma autoextensão de 20 segundos a cada ciclo. A etapa de extensão final ocorria a 72°C durante 10 min. Este sistema de três iniciadores para análise das repetições de CGG é representado esquematicamente na figura 4 e na figura 8A.
[000105] Após a PCR, as amostras foram armazenadas a -15 até - 30°C (protegidas da luz antes da análise) ou utilizadas imediatamente para análise dos produtos de amplificação por eletroforese por capilaridade (CE). Para CE, os produtos da PCR (1 pL) foram misturados com 2 pL de ROX 1007 ladder (preparado de acordo com DeWoody e outros, Biotechniques 37:348, 350, 352 (2004)) em 12 pL de Hi-Di® Formamida (Applied Biosystems® parte no. 4311320) e desnaturados com calor a 95°C durante 2 min antes da eletroforese por capilaridade em um Applied Biosystems® 3130x1 instrument com comprimento do capilar de 36 cm utilizando o polímero líquido POP7 (Applied Biosystems® parte n° 4352759). Os eletroferogramas resultantes são mostrados na figura 6.
[000106] Os picos nos eletroferogramas foram numerados começando com 5, o conteúdo de repetições de CGG mínimo possível de produtos da PCR, com base no planejamento de iniciadores quiméricos. Uma redução grave na intensidade do pico do pico n até n+1 (por exemplo, na figura 6, painel A do pico 9 até 10,) era indicativa da presença de um trinucleotídeo AGG na posição que corresponde ao pico n+1. Um trinucleotídeo AGG resultou em cinco picos de baixa intensidade, acreditados como ocorrendo porque o trinucleotídeo AGG reduziu a afinidade de ligação do iniciador que contém CGG para todas as cinco posições de ligação que abrangem tal trinucleotídeo (lembrar que o iniciador, com a sequência da SEQ ID NO: 41, continha cinco repetições de CGG). O número total de trinucleotídeos CGG/AGG foi determinado através da contagem do número total de picos, com o primeiro sendo numerado com 5 como descrito anteriormente. Por exemplo, o eletroferograma na figura 6, painel A traça o perfil de produtos amplificados partindo de um molde heterozigoto masculino normal com 30 repetições de CGG/AGG. Três conjuntos de picos bem definidos eram evidentes no lado esquerdo do traço, correspondendo aos produtos do iniciador de repetições de CGG. O pico mais à esquerda correspondia a produtos com 5 CGG uma vez que o iniciador quimérico é compreendido de 5 repetições de CGG complementares. O espaço entre os primeiros 5 picos e o conjunto seguinte de 5 picos mais intensos refletia a interferência por uma sequência de AGG interposta. Este espaço era equivalente a 5 repetições de CGG, isto é, a extensão do iniciador quimérico à medida que apura cada posição possível para hibridização (isto é, por sua vez, comprometido em cada unidade de repetição no iniciador por pareamentos errados entre a "C" da repetição do iniciador de CGG e a "T" dentro do complemento inverso (CCT) da sequência interruptora AGG). O conjunto seguinte de 5 picos refletia um aumento notável na intensidade de sinal como o iniciador quimérico ligado aos sítios além da sequência de AGG de interrupção. Um segundo elemento de AGG era então encontrado e após a extensão do iniciador ao longo do último conjunto de sequências de CGG, o sinal do produto de CGG era perdido de forma geral. Os dados de CE indicavam a presença de 30 repetições de CGG/AGG neste alelo. Após os amplicons de repetição, era observado um espaço no eletroferograma e o pico mais à direita era uma banda de produto muito intensa correspondendo ao amplicon de comprimento completo, produzido partindo dos iniciadores FMR1-F e FMR1R-FAM, que abrangiam o trecho de 30 CGG/AGG. Este perfil de CE correspondia a uma sequência 5'- (CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)9-3' (SEQ ID NO: 46).
[000107] Quatro exemplos adicionais de perfis do produto da PCR foram obtidos partindo de alelos FMR1 (figura 6, painéis B-E). Amostras provenientes de indivíduos do sexo masculino são representadas nos painéis B e C e amostras provenientes de indivíduos do sexo feminino nos painéis D e E. Em cada caso, o pico específico ao gene era medido em comparação a uma referência de DNA (isto é, a escala ROX). Esta medida estava de acordo com o método sem calibração da contagem dos picos de produtos de CGG descrito anteriormente. A acurácia da quantificação de CGG utilizando esta abordagem também estava bem correlacionada aos resultados de Wilson e outros, (J Mol Diagn 10:2-12, 2008) utilizando materiais consenso para X Frágil publicados. Utilizando a mesma estratégia de análise, as amostras B e C foram descodificadas como (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)27 (SEQ ID NO: 47) e (CGG)6I (SEQ ID NO: 48) (nenhum AGG), respectivamente.
Discussão de interpretações possíveis dos resultados nas figuras 6D-E e ensaios de reflexo para distinguir os mesmos
[000108] Os resultados com amostras de DNA genômico provenientes de indivíduos do sexo feminino podem ser mais complexos de interpretar. Por exemplo, os resultados das amostras apresentados na figura 6 painéis D e E revelaram uma combinação de picos de intensidade média e alta. Este padrão de produtos refletia a sobreposição de duas populações de produtos de repetição de CGG, um de cada alelo. As posições de AGG podem ser determinadas partindo da posição das duas "depressões" de sinais (isto é, reduções na intensidade de sinais dos picos) no perfil heterozigoto. A única diferença dos perfis dos alelos hemizogotos masculinos é que a intensidade de sinal na "depressão" pode nunca se reduzir até próximo da linha de base na amostra de indivíduos do sexo feminino, porque nestes casos, os dois alelos femininos não tinham trinucleotídeos AGG na mesma posição em relação à extremidade a 3' do amplicon. Para a amostra mostrada no painel D (alelo 20/31 CGG), a primeira "depressão" da intensidade de sinal de AGG, entre os picos 10 e 16, nunca se reduzia à linha de base, porque apenas um alelo tinha um trinucleotídeo AGG em tal posição, enquanto que o outro tinha um trinucleotídeo CGG. Em contraste, a segunda depressão de sinal voltava para a linha de base porque o alelo 20 CGG termina na posição 20 e a segunda depressão de AGG junto com os picos de CGG a jusante no eletroferograma pertencia apenas ao alelo 31 CGG. A única ambiguidade aqui era que de os dois alelos tinham o trinucleotídeo AGG identificado pela primeira depressão de sinal. Com base na incidência de haplotipos de AGG conhecidos, o caso mais provável é que o alelo muito curto (20 CGG) não contém o AGG enquanto que o alelo 31 CGG possui dois AGGs (como mostrado pelas sequências no painel D). O ensaio iniciado com repetições de CGG de três iniciadores sozinho, entretanto, não pode definitivamente relatar qual alelo contribui para a primeira depressão de AGG.
[000109] A análise da amostra seguinte (figura 6, painel E) era mais complexa. O traço de CE mostrava três depressões de AGG aparentes (setas não indicadas). Utilizando o cenário mais provável com base na estatística de haplotipos, as duas depressões de AGG do lado esquerdo do traço de CE seriam atribuídas ao alelo de repetição 46 e a terceira depressão de AGG (seta não indicada mais à direita) seria atribuída ao alelo de repetição 97. Como um resultado, as sequências do alelo seriam (CGG)gAGG(CGG)gAGG(CGG)26 e (CGG)IOAGG(CGG)86. Entretanto, há duas incertezas nesta sequência. Em primeiro lugar, cada um dos trinucleotídeos AGG identificados pelas depressões de sinal, em teoria, pode ser atribuído a cada um dos dois alelos. Se todos os três trinucleotídeos AGG ocorrerem no alelo de repetição 97 e nenhum no alelo de repetição de CGG 46, as sequências deduzidas partindo do traço do eletroferograma seriam (CGG)46 e (CGG)gAGG(CGG)6oAGG(CGG)gAGG(CGG)26. Esta combinação de sequências geraria o perfil de CE idêntico como aquele descrito anteriormente. Em segundo lugar, o pico específico ao gene de comprimento completo do alelo de repetição 46 (o pico de intensidade muito alta próximo ao centro do traço de CE) pode se sobrepor com qualquer depressão de AGG obscura no alelo de repetição 97. Assim, pode haver uma depressão de sinal de AGG adicional dentro do alelo de repetição 97 que migra na mesma posição no eletroferograma de CE que o alelo 46 específico ao gene de comprimento completo.
[000110] Foram desenvolvidos métodos adicionais para diferenciar as possibilidades de mapeamento de AGG específicas para os alelos 20/31 CGG e 46/97 CGG mostrados no Exemplo 4 (figura 6 painéis D e E). O Exemplo 5 a seguir demonstra a utilidade dos métodos da invenção para resolver de forma acurada estas incertezas.
[000111] Para a amostra do alelo 20/31 (figura 6, painel D), duas atribuições possíveis de AGG aos alelos de repetição 20 e 31 são mostradas na figura 7 (painéis esquerdos). É previsto que ambos os cenários resultem em eletroferogramas de CE idênticos quando os produtos de amplificação pela PCR são separados por CE (simulado na figura 7, painel direito inferior). O perfil de CE simulado das duas configurações alélicas possíveis (figura 7, painel direito inferior) estava de acordo com os resultados de CE empíricos (figura 7, painel direito superior).
[000112] Embora o ensaio iniciado com repetições de CGG de três iniciadores padronizado (figura 4, figura 8A) fosse incapaz de distinguir o estado de AGG dos dois alelos, foi desenvolvido um ensaio reflexo, representado esquematicamente na figura 8H, que poderia distinguir entre os dois cenários de alelos possíveis, como mostrados na figura 9. Utilizando o ensaio de PCR mostrado na figura 8H, um eletroferograma de CE para o primeiro cenário de alelos (isto é, cada alelo possui um AGG; figura 9, superior) geraria dois picos adjacentes com equivalentes de tamanhos de 14 CGG e 15 CGG. Um eletroferograma de CE para o segundo cenário de alelos, em que o alelo de repetição 20 mais curto não possui CGG e o alelo de repetição 31 possui dois AGGs (figura 9, inferior), geraria picos com equivalentes de tamanhos de 15 CGG e 25 CGG. Em outro exemplo (figura 6, painel E), o espécime continha dois alelos que possuem as repetições de CGG 46 e 97. Como mencionado anteriormente, o ensaio iniciado com repetições de CGG de três iniciadores padronizado (figura 4, figura 8A) poderia não diferenciar o conteúdo de AGG dos alelos específicos. Os eletroferogramas de CE de simulação de produtos da amplificação de alelos para esta amostra são mostrados na figura 10. Os painéis à esquerda e à direita inferiores da figura 10 revelam que o ensaio de PCR iniciada com repetições de CGG de três iniciadores é incapaz de resolves as duas configurações alélicas possíveis. Entretanto, quando se utiliza um ensaio de PCR (figura 8C) em que a característica de direção do iniciador de repetição é invertida (FMR1_R_(CCG)n; SEQ ID NO: 43), é previsto que os dois cenários de alelos geram perfis de CE diferentes como mostrado na figura 11, painéis inferiores.
Exemplo 5: Ensaios de PCR para a determinação da localização de AGG dentro das repetições de CGG do promotor de FMR1 em alelos femininos complexos
[000113] As condições de PCR e CE foram utilizadas em um ensaio reflexo da amostra de CGG 20/31 da figura 6D que eram idênticas aquelas descritas no Exemplo 4 acima exceto pelo fato de que foram utilizados iniciadores diferentes. A sequência do iniciador para frente era FMR1_F_FAM (SEQ ID NO: 14) e o iniciador inverso era um iniciador ancorado que possui um dT 3' terminal (figura 8H, FMR_R_(CCG)nCCT, quando n=4; SEQ ID NO: 45). O perfil real de CE para a amostra continha os picos de CGG 15 e 25 (figura 9, traço de CE) confirmando que as duas sequências dos alelos eram (CGG)2o (SEQ ID NO: 49) e (CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)IO (SEQ ID NO: 50).
[000114] Quando um ensaio de PCR era realizado na amostra de CGG 46/97 da figura 6E com um planejamento iniciado por repetição de dois iniciadores, representado esquematicamente na figura 8B, apenas três depressões de AGG estavam presentes no perfil de CE (figura 12, painel superior B, setas não indicadas). Estes dados excluíam a possibilidade de uma 4- depressão de AGG que teria se sobreposto pelo pico específico ao gene do alelo de repetição 46 (figura 6E). Ainda, quando o ensaio de PCR ancorado representado esquematicamente na figura 8F era realizado, três picos de alelos de CGG distintos, nas posições de repetições de CGG 32, 42 e 92 foram observados (figura 12, painel inferior F). Este resultado confirmava claramente que apenas 3 AGGs estavam presentes nos dois alelos.
Discussão
[000115] Entretanto, nenhum destes dois ensaios (figura 8B, 8F) podia determinar definitivamente o número de elementos de AGG presente em cada alelo. A figura 13 explica porque isso é assim — o ensaio com o iniciador A ancorado (FMR1_F_(CGG)nA; SEQ ID NO: 44), mostrado na figura 8F e figura 13, geraria resultados de CE idênticos para o cenário de alelos (1) em que o alelo de repetição 46 possui dois AGGs e o alelo de repetição 97 possui um AGG (figura 13, esquema superior) e para o cenário de alelos (2) em que o alelo de repetição 46 não possui AGG e o alelo de repetição 97 possui todos os três AGGs (figura 13, esquema inferior). Entretanto, cada AGG pode ser atribuído de forma acurada ao alelo apropriado utilizando um ensaio em que a característica de direção do iniciador de CGG está invertida. Como mostrado na figura 14, um ensaio de PCR que utiliza um iniciador dT ancorado com orientação inversa (FMR1_R_(CCG)nCCT; SEQ ID NO: 45) (figura 8H, figura 14) deve produzir um eletroferograma de CE com picos de equivalentes de tamanhos de CGG 14, 24 e 15 para o cenário de alelos (1) ou um eletroferograma de CE com picos de equivalentes de tamanhos de CGG 15, 65 e 75 para o cenário de alelos (2). A Tabela 3 lista todas as distribuições de AGG possiveis nos dois alelos, junto com o tamanho de pico de CGG esperado após a separação por CE dos produtos de amplificação pela PCR partindo deste ensaio iniciado com dT ancorado (figura 8H). Tabela 3
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Exemplo 6: Determinação da distribuição de AGG utilizando um ensaio ancorado com um iniciador de CGG orientado de forma oposta
[000116] Um ensaio de PCR que é esquematizado na figura 8H foi realizado na amostra de CGG 46/97 da figura 6E com um iniciador de dT ancorado (FMR1_R_(CCG)nCCT; SEQ ID NO: 45). O perfil de CE resultante (figura 14) confirmou que o alelo de repetição de CGG 46 tinha dois AGGs nas posições de repetição 10 e 20; enquanto que o alelo de repetição de CGG 97 possui um AGG na posição de repetição 11 (contagem de 5' para 3' partindo do primeiro CGG, como por convenção da literatura). Assim, os ensaios de mapeamento da invenção podem ser utilizados para resolver padrões de repetições alélicas de CGG/AGG complexos nos genes FMR cromossômicos.
Exemplo 7: Determinação do número de repetições de CGG e da posição de AGG em alelos normais e de mutação completa de amostras do sexo feminino utilizando um ensaio de PCR iniciado com repetição de CGG com orientação inversa
[000117] O número de repetições de CGG e a presença e a localização de trinucleotídeos AGG foram analisados para 29 amostras clínicas de DNA cromossômico utilizando o ensaio de PCR iniciada com repetições de CGG de três iniciadores (figura 8A) e o ensaio de PCR inversa com dT ancorado (figura 8H). Os métodos de PCR eram como descrito nos Exemplos 4 e 5, exceto pelo fato de que foram utilizados iniciadores apropriados. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Os números das posições de AGG seguem a convenção da literatura para numeração. NA indica que nenhum trinucleotídeo AGG foi detectado em tal alelo. Acredita-se que amostras de indivíduos do sexo masculino que possuem mais de um alelo (1, 4, 17, 19, 25 e 26) e amostras de indivíduos do sexo feminino que possuem mais de dois alelos (6 e 20) derivam de uma população mosaico de células dentro da amostra. Tabela 4
Figure img0007
Figure img0008
[000118] Após a amplificação pela PCR com estes dois ensaios (figura 8A, 8H) e a análise de CE, o número de repetições de CGG e o estado de AGG dos alelos foram determinados positivamente para 26 das 29 amostras. Estes dois formatos de ensaio eram incapazes de determinar positivamente o estado de AGG para apenas cinco alelos deste grupo. Estes alelos estão marcados com "**" na Tabela 4 (alelo 42 CGG na amostra 6; alelos 54 CGG, 90 CGG e >200 CGG na amostra 20; alelo >200 CGG na amostra 27). Métodos de ensaio adicionais da invenção (figura 8) foram utilizados para resolver o número de repetições de CGG e o estado de AGG para tais alelos.
[000119] A análise de CE de produtos da PCR revelou que duas amostras (20 e 27) tinham trinucleotídeos AGG em um dos alelos normais. Por exemplo, na amostra 20, os trinucleotídeos AGG estão presentes nas posições 10 e 20 no alelo 29 CGG. É possível que outros alelos (por exemplo, >200 CGG) que possuem trinucleotídeos AGG nas mesmas posições exatas (10, 20) não fossem detectados pelo ensaio iniciador por repetições de CGG (figuras 4, 8A) porque depressões de AGG que são maiores que ~100 nucleotídeos além da extremidade a 3' podem ser difíceis de detectar devido à baixa intensidade do pico. Ainda, nesta situação, o ensaio com dT ancorado (figura 8H) geraria picos idênticos aqueles para o alelo mais curto, se a localização de AGG em relação à extremidade a 5' da região de repetição de CGG fosse idêntica em ambos os alelos. A amostra 27 apresenta uma situação similar em que trinucleotídeos AGG foram identificados nas posições 11 e 21 para o alelo 30 CGG, mas a presença de um trinucleotídeo AGG no alelo >200-CGG não pode ser determinada de forma não ambígua.
[000120] Para resolver estas questões, outro ensaio reflexo (figura 8C) foi planejado. Em uma prova de experimento de princípio, três moldes de DNA genômico artificiais (Coriell Institute for Medicai Research; Camden, NJ, USA) que possuem repetições de 30 CGG (NA07174), repetições de 645 CGG (NA04025) e repetições de 30/645 CGG (50% NA07174 e 50% NA04025) foram analisados. O ensaio iniciado por repetições de CCG (figura 8C) era realizado na direção inversa com iniciadores FMR1_F_FAM, FMR1_R_(CCG)s e FMR1_R (SEQ ID NOS: 14, 43, 37). A figura 15, painel A mostra um eletroferograma de CE produzido partindo do alelo 30 CGG (NA07174). Dois trinucleotídeos AGG, um na posição 10 e um na posição 20, foram observados. A figura 15, painel B mostra que não havia trinucleotídeo AGG no alelo 645 CGG (NA04025). Quando amostras cromossômicas que possuem estes dois alelos foram combinadas para imitar uma amostra do sexo feminino do alelo 30/645, duas depressões de AGG foram observadas, mas o sinal não era reduzido até a linha de base (figura 15, painel C). Este resultado confirmava que o alelo 30 CGG tinha dois trinucleotídeos AGG nas posições 10 e 20, enquanto que o alelo 645 CGG não continha quaisquer interruptores de AGG em tais posições. Assim, este ensaio de PCR era capaz de apurar a extremidade a 5' de repetições longas, tal como o alelo 645 CGG, para determinar a presença ou a ausência de interruptores de AGG.
[000121] Este ensaio era utilizado para analisar as amostras clínicas 20 e 27, que possuem alelos de mutação completa que contêm >200 repetições de CGG (Tabela 4). A figura 16 mostra os resultados para a amostra 20. A figura 16, painel A mostra um eletroferograma de CE de produtos da PCR após a amplificação com o ensaio iniciado com CGG padronizado (figura 8A) com o iniciador de repetição orientado na direção para frente. Dois AGGs foram observados nas posições 10 e 20 (contando desde a extremidade a 3' das repetições de CGG). Com base na incidência de haplotipos, os AGGs ficam normalmente situados nas posições 10, 11, 20 e 21 contando desde a extremidade a 5' da região de repetição de CGG. Ver, por exemplo, Zhong e outros, Am. J. Hum. Genet. 57:351-61 (1995); Kunst e outros, Am. J. Hum. Genet. 58:513-22 (1996); e Eichler e outros, Hum. Mol. Genet. 4:2199- 208 (1995). A incidência de haplotipos sugere assim que os interruptores de AGG estão presentes no alelo 29 CGG. A figura 16, painel B mostra um eletroferograma de CE de produtos da PCR após a amplificação das mesmas amostras utilizando os ensaio com dT ancorado de dois iniciadores orientados na direção inversa (figura 8H). Estes resultados confirmavam que os dois trinucleotídeos AGG estavam localizados nas posições 10 e 20 contando desde a extremidade a 5' da região de repetição de CGG. A análise dos resultados na figura 16, painéis A e B revelou que dois trinucleotídeos AGG estavam localizados dentro do alelo 29 CGG, cuja região de repetição de CGG tinha, portanto, a sequência (CGG)9(AGG)(CGG)9AGG(CGG)9 (SEQ ID NO: 57). A incerteza remanescente com esta amostra é que o alelo de mutação completa (>200 CGG) pode ter trinucleotídeos AGG nas mesmas posições (10, 20) partindo da extremidade a 5'. Se este for o caso, estas sequências de AGG podem não ser detectadas por um ensaio com T ancorado de orientação inversa e diferenciadas dos AGGs no alelo curto (devido à distância líquida até o iniciador para frente e à redução correspondente na intensidade de sinal observada para o mapeamento de elementos de sequência a 5'). Portanto, o ensaio de PCR mostrado na figura 8D, um ensaio de PCR de três iniciadores com o iniciador de repetição de CCG na direção inversa, era utilizado para resolver esta questão. Os resultados do ensaio (figura 16, painel C) confirmava que o alelo >200 CGG tinha um AGG na posição 10 partindo da extremidade a 5' de repetições de CGG, uma vez que o sinal caía quase completamente até a linha de base em tal posição. Assim, tanto o alelo 29 CGG quanto o alelo 200 CGG tinham trinucleotídeos AGG na posição 10. Nenhum AGG estava presente na posição 20 do alelo de mutação completa (>200 CGG) porque o sinal em tal local não era reduzido até próximo da linha de base (figura 16 painel C).
Discussão
[000122] Estas análises demonstravam a ocorrência de trinucleotídeos AGG nos alelos de mutação completa. Acredita-se que isto contrasta com a posição estabelecida de muitos peritos no campo pelo fato de que os interruptores de AGG não ocorrem nos alelos de mutação completa. Em adição, os métodos e os ensaios da invenção são capazes de detectar interruptores de trinucleotídeos AGG próximos à extremidade a 5' da região de repetição de CGG.
Exemplo 8: Mapeamento de Elementos Interruptores na Amostra 27
[000123] A figura 17 mostra os resultados do mapeamento de AGG obtidos para a amostra 27 (Tabela 4). A figura 17, painel A mostra um eletroferograma de CE após a amplificação com o ensaio iniciado com CGG padronizado na direção para frente (figura 8A), que demonstrava que dois trinucleotídeos AGG estavam presentes. O padrão de picos de CGG revelava dois AGG, um na posição 10 e um na posição 20 (partindo da extremidade a 3' das repetições de CGG). Com base no conhecimento de haplotipos comuns, as interrupções de AGG de repetições de CGG estão caracteristicamente posicionadas nas posições 10, 11, 20 e/ou 21 contando desde a extremidade a 5' das repetições de CGG, o que sugere que as repetições de AGG estão presentes no alelo 30 CGG nesta amostra. A figura 17 painel B apresenta os resultados do ensaio de PCR com dT ancorado de dois iniciadores orientado na direção inversa (figura 8H). Este ensaio confirmava que os dois trinucleotídeos AGG estavam nas posições 11 e 21, contando desde a extremidade a 5' das repetições de CGG - (CGG)IOAGG(CGG)9AGG(CGG)9 (SEQ ID NO: 46). Uma incerteza remanescente com esta amostra é que o alelo de mutação completa (>200 CGG) pode ter trinucleotídeos AGG nas mesmas posições que aquelas no alelo de repetição de CGG 30. A figura 17, painel C fornece os resultados do ensaio de PCR iniciador com CCG de três iniciadores (figura 8D) orientado na direção inversa. Este ensaio confirmava que o alelo >200 CGG não possui AGG na posição 11 ou 21, porque a depressão de AGG não era reduzida até próximo a linha de base nestas duas posições.
Exemplo 9: Resolução de posições de AGG para alelos com baixa abundância em amostras mosaico utilizando um ensaio de PCR ancorado com orientação para frente
[000124] A análise do DNA cromossômico proveniente de algumas amostras na Tabela 4 revelava a presença de alelos com baixa abundância nas amostras 6 e 20. Acredita-se que estes são alelos derivados de uma população de mosaico de células presente nestas amostras. O ensaio de PCR com ancorado dA orientado para frente da invenção (figura 8F) era suficientemente sensível para detectar trinucleotídeos AGG na sequência de estes alelos menos importantes. Os resultados do ensaio com dA ancorado de dois iniciadores para as amostras 6 e 20 são mostrados na figura 18. A amplificação de DNA cromossômico partindo da amostra 6, utilizando o ensaio de PCR mostrado na figura 8F e a análise de CE subsequente dos produtos da PCR revelavam quatro picos principais, com comprimentos de repetições de CGG 15, 25, 48 e 56 e dois picos menos importantes, com comprimentos de repetições de CGG 30 e 38 (figura 18, painel A). Estes comprimentos incluem as cinco repetições de CGG no iniciador, o interruptor de AGG e o número de repetições entre o interruptor de AGG e a extremidade a 3' da região de repetição de CGG. Os quatro picos principais confirmavam as posições de AGG para os dois alelos principais (posições 10 e 20 para o alelo 29 CGG e posições 10 e 18 para o alelo 60 CGG - todas partindo da extremidade a 5' das repetições de CGG). Os dois picos menos importantes confirmavam que o alelo menos importante (42 CGG) possui dois AGG, um na posição 10 e um na posição 18 (partindo da extremidade a 5' das repetições de CGG). Embora ambos os alelos 42 CGG e 60 CGG tivessem trinucleotídeos AGG nas posições 10 e 18 partindo da extremidade a 5', uma vez que o ensaio com dA ancorado é posicionado na direção para frente, o tamanho dos amplicons de PCR iniciada com dA ancorado foi determinado pelo número de repetições de CGG contado partindo da extremidade a 3' até qualquer AGG que podem estar presentes (por exemplo, 24 para o alelo 42 e 42 para o alelo 60 CGG). Estes produtos da PCR foram bem separados por CE (30, 38 vs 48, 56 unidades de repetição).
[000125] A amplificação do DNA cromossômico partindo da amostra 20 utilizando o ensaio de PCR mostrado na figura 8F e a análise de CE subsequente dos produtos da PCR revelavam dois picos primários (figura 18B) para o alelo principal (anteriormente definido como o alelo 29 CGG com base nos dados mostrados na figura 16). Entretanto, o ensaio também revelava dois picos de alelos menos importantes na posição 50 CGG e 86 CGG indicando que havia dois AGGs nestes dois alelos menos importantes, ambos na posição 10 quando contados desde a extremidade a 5' (isto é, posições 45 e 81 se contados desde a extremidade a 3').
[000126] Em conclusão, as combinações apropriadas dos quatro ensaios descritos acima permitiram o mapeamento de trinucleotídeo interruptores de AGG nas regiões de repetição de CGG de cada alelo das 29 amostras clínicas mostradas na Tabela 4.
Exemplo 10: Fluxo de trabalho das amostras
[000127] Um exemplo de um mapeamento de AGG e CGG contando o fluxo de trabalho utilizando os métodos da invenção é mostrado na figura 19 e combina alguns dos formatos de ensaio mostrados na figura 8. O fluxo de trabalho mostrado aqui é apenas um exemplo. As denominações de letras do ensaio referem-se àquelas mostradas na figura 8A-H. Alguns ensaios utilizados neste fluxo de trabalho podem ser substituídos por outros formatos de ensaio para atingir o propósito da amostra.
[000128] As modalidades dentro do relatório descritivo fornecem uma ilustração das modalidades da invenção e não devem ser interpretadas como limitantes do âmbito da invenção. O versado na técnica reconhece facilmente que muitas outras modalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações e as patentes citadas nesta descrição são incorporadas como referência em sua totalidade. Até a extensão em que o material incorporado como referência contradiz ou é incoerente com este relatório descritivo, o relatório descritivo irá substituir qualquer tal material. A citação de quaisquer referências aqui não é uma admissão de que tais referências são a arte anterior da presente invenção.
[000129] A não ser que seja indicado de outra maneira, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação e outros utilizados no relatório descritivo, incluindo as reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "aproximadamente". Consequentemente, a não ser que seja indicado de outra maneira ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas para serem obtidas pela presente invenção. No mínimo e não como uma tentativa de limitar o pedido de patente da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado considerando o número de dígitos significativos e abordagens de arredondamento comuns.
[000130] A não ser que seja indicado de outra maneira, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar utilizando não mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descrita aqui. É pretendido que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.
[000131] Quando os métodos que compreendem várias reações de amplificação (por exemplo, PCR) são citados em uma reivindicação, deve ser entendido que a referência às reações como "primeira", "segunda" etc., não se refere à ordem cronológica em que as reações são realizadas e que tais reivindicações abrangem métodos em que as reações citadas são realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente, incluindo, por exemplo, a realização da "segunda" reação antes, ao mesmo tempo ou após a "primeira" reação.

Claims (14)

1. Método de analisar se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, em que a região rica em CGG é uma 5' UTR de FMR1 ou 5' UTR de FMR2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos dois iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG; (b) a realização de PCR com os pelo menos dois iniciadores diferentes e o pelo menos um molde que compreende pelo menos uma região rica em CGG, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância do produto; e (d) a derivação de informação com relação se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em CGG ou onde dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência de interrupção da dita representação.
2. Método de analisar se uma sequência de interrupção está presente em pelo menos uma região rica em CGG compreendida por pelo menos um molde em uma amostra, em que a região rica em CGG é uma 5' UTR de FMR1 ou 5' UTR de FMR2, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento de pelo menos três iniciadores diferentes, incluindo um primeiro iniciador que compreende repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC e um flap a 5', um segundo iniciador que se anela a uma posição fora da região rica em CGG e um terceiro iniciador que possui uma sequência compreendida pela flap a 5' do primeiro iniciador, em que o primeiro iniciador é fornecido em uma concentração menor que o terceiro iniciador; (b) a realização de PCR com os pelo menos três iniciadores diferentes e o pelo menos um molde, em que a PCR produz um conjunto de produtos; (c) a resolução do conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma representação de tamanho e abundância do produto; e (d) a derivação de informação com relação se uma sequência de interrupção está presente na pelo menos uma região rica em CGG ou de que dentro da pelo menos uma região rica em CGG fica localizada uma sequência de interrupção partindo da dita represem- tação.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de interrupção é um elemento AGG.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende derivar informação em relação ao número de repetições de CGG partindo da dita representação, que determina se a região de repetições ricas em CGG compreende mais ou menos que 200 repetições de CGG e opcio-nalmente determina o número de repetições de CGG presentes na região rica em CGG.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que com a condição de que um padrão externo ou um calibrador não é utilizado na derivação de informação em relação ao fato se uma sequência de interrupção está presente na região rica em CGG ou onde dentro da região rica em CGG fica localizada uma sequência de interrupção partindo da dita representação.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a derivação de informação com relação se uma sequência de interrupção está presente na região rica em CGG ou onde dentro da região rica em CGG fica localizada uma sequência de interrupção compreende a determinação de um ou mais comprimentos do produto em que a quantidade de produto é reduzida em pelo menos 50% comparada com a quantidade de produtos de comprimentos próximos, ou em que a derivação de informação com relação se uma sequência de interrupção está presente na região rica em CGG ou onde dentro da região rica em CGG fica localizada uma sequência de interrupção partindo da dita representação compreende a determinação de um ou mais comprimentos do produto em que a quantidade de produto é reduzida em pelo menos 25% comparada com a quantidade de produtos de comprimentos próximos, em que a região rica em CGG é proveniente de um heterozigoto individual para o alelo que compreende a região rica em CGG.
7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o método é um ensaio ancorado e o primeiro iniciador compreende uma subsequência escolhida de A, T, AG, CT, AGG e CCT entre ou na extremidade 3' das repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC.
8. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o fornecimento de pelo menos um primeiro iniciador adicional e opcionalmente um segundo iniciador adicional, o primeiro iniciador adicional compreendendo repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de uma segunda PCR com pelo menos o primeiro iniciador adicional, um iniciador escolhido do segundo iniciador da etapa (a) e o segundo iniciador adicional, e o pelo menos um molde, em que a segunda PCR produz um segundo conjunto de produtos; e a resolução do segundo conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma segunda representação de tamanho e abundância do produto; em que o primeiro iniciador da etapa (a) possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem um elemento de interrupção e em que o primeiro iniciador adicional possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem um elemento de interrupção.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a determinação de pelo menos um comprimento da pelo menos uma região rica em CGG, em que a amostra compreende material genético de células que possuem uma ploidia de pelo menos 2 em relação à região de CGG, e o método compreende a determinação de pelo menos dois comprimentos das pelo menos duas regiões ricas em CGG.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende determinar se a amostra compreende alelos principais e de menor importância com elementos de interrupção posicionados de forma diferente.
11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o fornecimento de pelo menos um terceiro iniciador adicional e opcionalmente um quarto iniciador adicional, o terceiro iniciador adicional compreendendo repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de uma terceira PCR com pelo menos o terceiro iniciador adicional, um iniciador escolhido do segundo iniciador adicional e o quarto iniciador adicional e o pelo menos um molde, em que a terceira PCR produz um terceiro conjunto de produtos; e a resolução do terceiro conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma terceira representação de tamanho e abundância do produto; em que o terceiro iniciador adicional está orientado de forma oposta em relação ao primeiro iniciador da etapa (a) e é diferente do primeiro iniciador adicional.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a determinação da presença ou da ausência de elementos de interrupção dentro de 150 pb de qualquer extremidade de pelo menos um alelo compreendido pela amostra.
13. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o fornecimento de pelo menos um primeiro iniciador adicional e um segundo iniciador adicional, o primeiro iniciador adicional compreendendo repetições de CGG, CCG, GCG, CGC, GCC ou GGC; a realização de uma segunda PCR com pelo menos o primeiro iniciador adicional e o segundo iniciador adicional e o pelo menos um molde, em que a segunda PCR produz um segundo conjunto de produtos; e a resolução do segundo conjunto de produtos com uma técnica de alta resolução para produzir uma segunda representação de tamanho e abundância do produto; em que o primeiro iniciador adicional está orientado de forma oposta ao primeiro iniciador da etapa (a).
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que não compreendem elementos de interrupção, o primeiro iniciador adicional possui uma atividade de ligação preferencial por sítios na região rica em CGG que compreendem elementos de interrupção, e a amostra compreende pelo menos dois alelos que compreendem regiões ricas em CGG de comprimentos diferentes, método compreendendo ainda a determinação dos comprimentos dos pelo menos dois alelos e a detecção de pelo menos um elemento de interrupção e a deter- minação do comprimento do alelo pelo qual o pelo menos um elemento de interrupção é compreendido.
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