CN110157782A - 一种用于快速检测fmr1基因cgg重复序列的引物群及pcr试剂盒 - Google Patents

一种用于快速检测fmr1基因cgg重复序列的引物群及pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的引物群，所述引物群包括特异性扩增FMR1基因CGG重复区的上游引物F SEQ ID NO.1和下游荧光引物R SEQ ID NO.2，以及针对CGG序列进行动态扩增的位于FMR1基因CGG序列内部的第三引物TP SEQIDNO.3和增强动态扩增所用的第四引物FP SEQ ID NO.4，本发明还公开了用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的PCR试剂盒，本发明的有益效果：高效的扩增FMR1基因的CGG重复序列，使用第三、第四引物，对较长的CGG序列进行动态扩增，克服了由于短片段优势扩增引起的假阴性问题，提高了FMR1基因CGG序列判读的准确性和可靠性。

Description

一种用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的引物群及PCR试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体来说，涉及一种用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的引物群及PCR试剂盒。
背景技术
脆性X综合征(MIM#30955)是发病率仅次于唐氏综合征的第二大导致智力障碍的疾病，同时也是最常见的导致男性智力障碍的遗传病。位于X染色体长臂的脆性X智力低下1号基因(Fragile X Mental Reterdation 1，FMR1)5’端非编码区存在着一段以CGG为单位的三联核苷酸重复序列。随着CGG重复次数的增加，患者可能表现出一系列的临床症状。按照临床症状和发病风险，美国医学与遗传学会(American College of Medical Geneticsand Genomics，ACMG)将CGG重复序列分为四个等级：1：6-44之间被称为非受累型；2：45- 54之间称为中间型或灰区；3：55-200之间称为前突变型；4：大于200时被称为全突变型。当CGG重复数扩增至200以上时，FMR1基因5’端的CGG序列和基因上游的CpG 岛被超甲基化修饰，从而导致基因转录被沉默。FMR1编码的蛋白FMRP是一类RNA绑定蛋白，在神经元细胞中作为一种通用型的调节因子，对神经突触的形成有重要作用。因此全突变者在临床上表现出重度的智力障碍和发育迟缓，常常伴随有自闭症的倾向，也被称为脆性X综合征(Fragile XSyndrome，FXS)。
FMR1基因的前突变携带者一般没有重度智力障碍的表现，但由于该基因在RNA转录和蛋白质翻译过程中起到关键的调控作用，前突变FMR1基因被认为与一系列脆性X相关的临床症状有关，包括脆性X综合征、脆性X相关的原发性卵巢功能不全(Fragile Xassociated primary ovarian insufficiency，FXPOI)、脆性X相关的共济失调(Fragile Xassociated tremor and ataxia syndrome，FXTAS)。
脆性X综合征是一种X染色体连锁的智力低下遗传疾病，其在男性中的发病率约为1：4000，在女性中约为1：6000。临床症状复杂多样，包括中度到重度的智力障碍、常常伴有自闭症倾向、发育迟缓、癫痫、长脸、大耳朵、关节松弛、平足及男性患者特有的巨型睾丸。一直以来脆性X综合征的诊断需要神经科医生对患者的智力水平和体貌特征进行鉴定，并且需要Southern Blot对患者进行确诊。然而，使用Southern Blot诊断FXS需要约 10ml血量，两周时间，其实验流程复杂，需要操作人员具备一定的经验，而且结果往往只能定性，而不能定量。因此Southern Blot虽然被作为诊断工具一直沿用了下来，但其作为筛查手段则明显不足。传统的PCR方法在扩增大片段的CGG重复序列时常常遇到困难，无法得到准确的目标产物。对于携带一条全突变FMR1基因的女性，一般的PCR方法只能扩增另一条X染色体上正常的FMR1基因，全突变的FMR1基因由于高重复的CGG序列形成的二级结构无法得到有效扩增。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述问题，本发明提出了一种用于快速检测FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列的引物群及PCR试剂盒，能够准确定量的确定CGG重复数，可以快捷的查出致病基因的携带者以及病人并且有效降低了假阴性的可能性，可以用于孕前筛查、产前诊断、和辅助生殖领域，帮助阻断FXS患儿出生从而降低脆性X综合症的发病率。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于快速检测FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列的引物群，所述引物群包括特异性扩增FMR1基因CGG重复区的上游引物F SEQ ID NO.1和下游荧光引物R SEQ ID NO.2，以及针对CGG序列进行动态扩增位于FMR1基因内部5’端的第三引物TP SEQIDNO.3，和增强第三引物TP动态扩增效果所用的和第三引物5’端序列重合的第四引物FP SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.1F:CCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAG
SEQ ID NO.2R:TGCCCTAGAGCCAAGTACCTTGTAGA
SEQIDNO.3TP:AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGCGG
SEQ ID NO.4FP:AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGC。
正向和反向引物杂交于FMR1基因两侧(即上下游两端)，第三引物的3’端含有5 个CGG重复序列，可以和目的基因中的任意五个CGG重复序列的反向序列进行杂交，第三引物的5’端含有一段非特异性序列，不会和任何片段杂交，第四引物的序列和第三引物 5’端的非特异性序列相同。
第三引物和反向引物配对后，扩增出大小不一的各种CGG重复序列，这些长短不一的CGG序列可以覆盖多个CGG重复数的区间范围，并且在第四引物和反向引物的配对扩增中，成指数的翻倍增长，使这些扩增产物可以被清晰的观测到，最终在片段分析界面呈现出“毛细现象”。
检测结果并不取决于单个信号峰值，而是通过一系列大小不一的片段去排除假阴性的情况，如果检测中只有一个CGG序列扩增峰值，并且在其右边仍然存在一系列的“毛细峰值”，那么说明该样本中存在一个较大的CGG重复序列，并且该CGG重复序列在PCR中扩增失败。
一种用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒含有特异性扩增FMR1基因CGG重复区的上游引物F和下游荧光引物R，以及针对CGG序列进行动态扩增位于5’端的第三引物TP，和增强动态扩增所用位于5’端的第四引物FP。
进一步的，所述试剂盒还含有适用于毛细管电泳的一系列长短不同的特定DNA分子片段(ROX标记)。
所述适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段(ROX标记)包括20条大小不同的 DNA片段：小于100bp，1条；100bp-200bp，4条；201bp-300bp，2条；301bp-400bp，3 条；401bp-500bp:，2条；501bp-600bp，3条；601bp-700bp，1条；701bp-800bp，2条； 901bp-1100bp，2条，以上DNA分子片段的GC含量均在80％以上。
进一步的，所述试剂盒还包括反应缓冲液、特定比例的dNTPs、氯化镁、DNA聚合酶、UNG酶中的一种或多种组合。
进一步的，所述试剂盒还包括FMR1基因全突变质控品FMR1基因正常型质控品，所述FMR1基因全突变质控品含有长度等于300个CGG重复的DNA模板；所述FMR1基因正常质控品含有长度等于30个CGG重复的DNA模板。
所述试剂盒检测FMR1基因CGG重复序列的应用，包括下述步骤：
四引物扩增PCR：将受检DNA样本加入装有PCR反应体系的PCR管中，得到样品PCR反应管，所述PCR反应体系中含有PCR检测专属引物群；
PCR反应体系如下：
PCR反应：反应管置于PCR仪上进行PCR反应得到PCR产物，反应程序设置为：98℃ 5min；97℃ 35s→57℃ 35s→68℃ 4min，30个循环；72℃ 10min；4℃；
片段分析：将PCR产物和适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段(ROX标记)、Hi-Di甲酰胺按混合，使用毛细管电泳仪进行分析；
Hi-Di甲酰胺 11.5μL
ROX标记 1μL
PCR产物 1.5μL
结果分析：分析对象的分子大小标记为Peaki，将Peaki代入以下公式进行计算，得出CGGi的值，c0取值264.2，m0取值2.92
进一步的，所述扩增产物呈现出多样性的动态非均一性扩增：包含有200-1000bp的目的片段，以及50-800bp的连续片段。
检测结果，当目标片段大小处于为400-650bp时，样品为阴性样本；当目标片段大小处于650bp-1100bp之间为前突变阳性样本；当目标片段大于1100bp时，样本为全突变阳性样本；当CGG连续片段超过目标片段时，表示有一较大CGG片段的扩增失败，为假阴性。
结果标准如下：(1)当CGG重复数大于或等于200时，受检样本为脆性X综合征患者；(2)当CGG重复数小于200时，受检样本为非脆性X综合征患者。
本发明的有益效果：
(1)高效的扩增FMR1基因5’端的CGG重复序列，并利用毛细管电泳仪对CGG重复数进行定量判读。
(2)使用第三、第四引物，对较长的CGG序列进行动态扩增，克服了由于短片段优势扩增引起的假阴性问题，提高了CGG序列判读的准确性和可靠性。
(3)能够准确定量的确定CGG重复数，可以快捷的查出致病基因的携带者以及病人，可以用于产前诊断、阻止患儿出生从而降低脆性X综合症的发病率。
附图说明
图1是根据本发明实施例1所述的引物PCR试剂盒的检测结果图；
图2是根据本发明实施例2所述的引物PCR试剂盒的检测结果图；
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取样本DNA；
四引物扩增PCR：所述PCR反应体系中含有的PCR检测专属引物群，SEQ ID NO.1F:CCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAG；SEQ ID NO.2R: TGCCCTAGAGCCAAGTACCTTGTAGA；SEQ IDNO.3TP: AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGCGG；SEQ ID NO.4FP:AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGC；PCR缓冲液22.4μL、专属引物群1.2μL、DNA聚合酶0.4μL、样本DNA或质控品1.0μL；
PCR反应：反应管置于PCR仪上进行PCR反应得到PCR产物，反应程序设置为：98℃ 5min；97℃ 35s→57℃ 35s→68℃ 4min，30个循环；72℃ 10min；4℃；
片段分析：将PCR产物和适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段(ROX标记)、Hi-Di甲酰胺按混合，Hi-Di甲酰胺11.5μL、ROX标记1μL、PCR产物1.5μL，使用毛细管电泳仪进行分析；
结果分析：分析对象的分子大小标记为Peaki，将Peaki代入以下公式进行计算，得出CGGi的值，c0取值264.2，m0取值2.92
分析结果如图1所示，从图中可以得出，从左至右表示片段逐渐增长，bp数逐渐增多，片段越长，CGG重复数就越大；纵坐标表示信号值，信号值越高，表示同一片段长度的分子越多；
在345bp附近有一个很高的峰值，说明有大量的长度约345bp的DNA片段被成功扩增，说明CGG重复数大于两百，受检者为脆性X综合征患者。
①和②所示分别为两个完整CGG片段，由于后者的扩增效率较低，导致其扩增产物的信号值较小。扩增扩出不同长度的CGG片段，数目最小为5个CGG重复，最大相当于受检者较长的完整CGG片段；
以上两对引物产生了一系列大小不等的毛细峰现象，如③所示，由于两条染色体上的CGG 序列存在拷贝数的差异以及AGG的中断，会形成断裂的峰谷，③处的小峰持续走低，延伸至信号峰②的右边，一直延伸至信号峰①处，毛细峰的延伸，说明在受检者体内存在一个更大的CGG重复序列，而这个序列产生的毛细峰是由众多的不同反应生成，延伸至信号峰②右边的毛细峰，证明了信号峰①的真实性，可以帮助实验者排除潜在的假阴性风险。
实施例2
取样本DNA；
四引物扩增PCR：所述PCR反应体系中含有的PCR检测专属引物群，SEQ ID NO.1F:CCGCAGCGGGCCGGGGGTTCGGCCTCAG；SEQ ID NO.2R: TGCCCTAGAGCCAAGTACCTTGTAGA；SEQ IDNO.3TP: AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGCGG；SEQ ID NO.4FP:AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGC；PCR缓冲液22.4μL、专属引物群1.2μL、DNA聚合酶0.4μL、样本DNA或质控品1.0μL；
PCR反应：反应管置于PCR仪上进行PCR反应得到PCR产物，反应程序设置为：98℃ 5min；97℃ 35s→57℃ 35s→68℃ 4min，30个循环；72℃ 10min；4℃；
片段分析：将PCR产物和适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段(ROX标记)、Hi-Di甲酰胺按混合，Hi-Di甲酰胺11.5μL、ROX标记1μL、PCR产物1.5μL，使用毛细管电泳仪进行分析；
结果分析：分析对象的分子大小标记为Peaki，将Peaki代入以下公式进行计算，得出CGGi的值，c0取值264.2，m0取值2.92
分析结果如图2所示，从图中可以得出，不存在较大的CGG片段时，毛细峰②不会延伸至信号峰①的右侧，说明信号峰①已经代表最大的CGG片段，实验结果排除假阴性的风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华瑞康源生物科技发展有限公司
<120> 一种用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的引物群及PCR试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccgcagcggg ccgggggttc ggcctcag 28
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgccctagag ccaagtacct tgtaga 26
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
agcgtctact gtctcggcac ttgccggcgg cggcggcgg 39
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
agcgtctact gtctcggcac ttgc 24

Claims (6)

1.一种用于快速检测FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列的引物群，其特征在于，所述引物群包括特异性扩增FMR1基因CGG重复序列的上游引物F SEQ ID NO.1和下游荧光引物RSEQ ID NO.2，以及针对CGG序列进行动态扩增位于FMR1基因内部CGG序列5’端的第三引物TP SEQIDNO.3和增强动态扩增所用的位于与第三引物TP 5’端重合的第四引物FP SEQ IDNO.4。
2.一种权利要求1所述引物群的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒含有权利要求1所述用于快速检测FMR1基因CGG重复序列的引物群。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有适用于毛细管电泳的一系列长短不同的特定DNA分子片段。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段包括20条大小不同的DNA片段：小于100bp，1条；100bp-200bp，4条；201bp-300bp，2条；301bp-400bp，3条；401bp-500bp:，2条；501bp-600bp，3条；601bp-700bp，1条；701bp-800bp，2条；901bp-1100bp，2条，以上DNA分子片段的GC含量均在80%以上。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、特定比例的dNTPs、氯化镁、DNA聚合酶、UNG酶中的一种或多种组合。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括FMR1基因全突变质控品和FMR1基因正常质控品，所述FMR1基因全突变质控品含有长度等于300个CGG重复的DNA模板；所述FMR1基因正常质控品含有长度等于30个CGG重复的DNA模板。
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