CN114807360A

CN114807360A - 检测脆性x综合征突变的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN114807360A
Application number: CN202210732815.3A
Authority: CN
Inventors: 孟万利; 詹嘉晗; 毛爱平; 李佳琪; 卢玉林; 张丽; 任志林
Original assignee: Berry Genomics Co Ltd
Current assignee: Berry Genomics Co Ltd
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN114807360B; WO2024001404A1; TW202400807A

Abstract

本发明涉及一种检测脆性X综合征突变的方法和试剂盒。其中所述试剂盒包括以下试剂：（1）用于长片段PCR扩增的试剂；（2）用于高GC区域PCR扩增的试剂；和（3）用于构建三代测序文库的试剂。其中所述方法包括以下步骤：（1）获取受试者样本；（2）对所述样本进行长片段PCR扩增和高GC PCR扩增；（3）构建三代测序文库；（4）测序并分析FMR1基因突变类型。

Description

检测脆性X综合征突变的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种利用三代长读长测序平台检测FXS多种突变的引物和方法，以及适用于此方法的试剂盒。

背景技术

脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）是一种X连锁不完全外显性遗传病，也是常见的染色体病之一，因细胞中X染色体末端在特殊培养基中经诱变剂作用后可显示如同断裂的脆性部位而得名。

FXS是最常见的遗传性智力缺陷的原因，男性的发病率为1/4000，而女性的携带率为1/8000-1/4000。在大多数情况下，FXS是由X染色体上FMR1基因5’-UTR区域三核苷酸（CGG）重复扩张引起的（Crawford D C等，Genetics In Medicine, 2001, 3(5): 359-371）。三核苷酸（CGG）根据重复数可分为前突变（55-200）和完全突变（>200）；前突变是非甲基化的，可以产生表达量略低于正常值的FMR1蛋白，完全突变的患者中高CGG重复将伴随着高甲基化，这通常会造成FMR1基因转录沉默和FMR1蛋白的缺失（Kenneson A等，Hum MolGenet, 2001; 10:1449–1454；Pieretti M等，Cell, 1991, 66(4): 817-822）。除此之外，也有报道其他影响FMR1基因表达的突变：如FMR1基因点突变和大片段的FMR1基因缺失也将造成FXS的症状（Gedeon A K等，Nature Genetics, 1992, 1(5): 341-344；Handt M等，MCB, 2014, 28(5-6): 279-283；Collins S C等，AM J MED GENET A, 2010, 152(10):2512-2520）。FXS临床表型广泛：包括智力发育迟缓，发育和语言迟缓，身体异常；FXS的行为表型还以大约25%至33%的自闭症症状为特征，包括社交和沟通障碍，对感官刺激的异常反应等（Hagerman RJ等，Baltimore: Johns Hopkins University Press; 2002. p3–109）。

完全突变的传播只发生在携带完全突变或者前突变的母亲身上，并且母亲携带前突变CGG重复数越高，遗传给后代完全突变的几率越大（Fernandez-Carvajal I等，JMD,2009, 11(4): 306-310）。大多数携带前突变的人智力正常，但男性容易出现注意力问题、执行功能障碍、社交缺陷和强迫症行为；完全突变的成年男性平均智商（IQ）约为40，因为FXS为X连锁疾病，因此女性通常比男性收到更轻微的影响，完全突变的女性通常智商正常或接近正常，大多数人会有相关的学习障碍和情绪问题（Merenstein S A等，AM J MEDGENET, 1996, 64(2): 388-394；Freund L S等，Pediatrics, 1993, 91(2): 321-329；Garber K B等，EJHG, 2008, 16(6): 666-672）。

目前分子检测FXS的CGG重复扩张最常见的方法是通过毛细管电泳法（CE）的聚合酶链式反应（PCR）来检测是否含有大于200的CGG重复扩张，该方法还可以判断小于200的CGG重复数（Filipovic-Sadic S等，Clinical Chemistry, 2010, 56(3): 399-408）。可是该方法受检测长度的影响无法确认更高的CGG重复数；由于CE只能从PCR产物的长度去推断CGG重复数，因此该方法的准确性主要取决于标准品选取的准确性，同时检测信号中的噪音也会对结果判断造成不利的影响（Grasso M等，JMD, 2014, 16(1): 23-31）。除此之外，FMR1的DNA印迹杂交法（Southern blot）即用于检测CGG重复性太大而无法通过PCR的样品，也用于确定FMR1基因的甲基化状态，可是该方法工作流程复杂，成本高，需要更多的时间和精力，并且需要更多的样品DNA量，因此无法适应于大批量样品的检测（Hagerman RJ等，Baltimore: Johns Hopkins University Press; 2002. p3–109）。

一代测序（Sanger）和二代测序（Next-generation sequencing, NGS）无法检测FXS中CGG的重复扩张，但是可以检测FMR1基因的点突变（Collins S C等，AM J MED GENETA, 2010, 152(10): 2512-2520）；Sanger测序检测FMR1点突变通量低，且无法检测未知的突变；而NGS需要对FMR1基因构建NGS测序文库才能检测FMR1基因的点突变，不能与其他基因检测兼容，且流程比较繁琐。多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependentprobe amplification, MLPA）可以检测FMR1基因的大片段缺失，可是该方法需要同时检测FMR1基因上下游不同的位点，操作繁琐且无法检测大批量样本（Hayward B E等，HumanGenetics, 2017, 136(10): 1313-1327）。

目前基于CE、Southern blot、Sanger测序或二代测序以及MLPA的方法，可以实现FXS的部分CGG重复扩张检测以及FMR1基因点突变和大片段缺失检测，但检测存在有以下几方面局限性：

1、无法实现在同一体系内同时检测所有的突变类型；

2、由于FXS的CGG重复扩张可能存在一定比例的嵌合体，因此CE和Southern blot可能会漏掉一些低比例的嵌合；

3、CE和Southern blot只能检测大于200的CGG重复数，无法确定更高的CGG重复数数目；

4、CE对于小于200的CGG重复数目的判断依赖于已知结果的标准品，无法直接准确判断CGG重复数；

5、无法准确判断CGG重复中的AGG插入类型；

6、MLPA无法判断大片段缺失的准确位点；

7、目前的方法无法直接检测未知的CGG重复区域附近的微缺失。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种基于长片段PCR和高GC PCR扩增和三代测序的方法来检测FXS相关的多种突变。长片段PCR扩增和高GC PCR扩增被分在一个或者两个反应管中实现；其中长片段PCR扩增用于检测FMR1基因的点突变和大片段缺失；高GC PCR扩增FMR1基因5’-UTR的CGG重复区域用于检测由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入以及5’-UTR区域发生的微小缺失。结合读长测长的三代测序平台读长测长等特点，可以实现准确、快速并高通量地检测FXS相关基因突变。本发明涉及的方法操作简便，长片段PCR以及高GC PCR和三代文库质量可靠且重复性强，有利于三代测序技术在临床检测上的应用。

本发明的目的在于解决现阶段FXS致病基因检测覆盖不全、CGG重复扩张和CGG重复中的AGG插入无法准确判断、无法确定低比例的嵌合突变会导致临床上存在漏检和误检的问题。通过长片段PCR和高GC PCR相结合同时扩增FXS相关的致病基因FMR1以及FXS中易发生CGG重复扩张和缺失的FMR1的5’-UTR区域及制备三代测序文库，实现全面、精确和快速检测多个样品FXS多种突变的目标。

本发明的第一方面，本发明涉及一种用于FXS多种突变的引物组，包括选自以下的一对或多对引物：

（1）FMR1-E1-F与FMR1-E1-R，其中所述FMR1-E1-F选自SEQ ID NO：1-4，FMR1-E1-R选自SEQ ID NO：5-8；

（2）FMR1-E2-F与FMR1-E9-R，其中所述FMR1-E2-F选自SEQ ID NO：9-11，FMR1-E9-R选自SEQ ID NO：12-14；

（3）FMR1-E10-F与FMR1-E17-R，其中所述FMR1-E10-F选自SEQ ID NO：15-17，FMR1-E17-R选自SEQ ID NO：18-20；

（4）FMR1-Gap-Mix，其中所述FMR1-Gap-Mix选自SEQ ID NO：21-220；

其中，所述FXS多种突变至少包括以下的一种或多种：FMR1的由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入、大片段缺失、点突变和微缺失。

其中，所述引物位置如图1 A至图1B所示。所述引物可以扩增基因组上引物范围内的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物约为2.7kb（FMR1-E1）、11.6kb（FMR1-E2-9）和15.2kb（FMR1-E10-17）。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。

根据一个优选的实施方案，所述引物组包括以下多对引物：

（3）FMR1-E10-F与FMR1-E17-R，其中所述FMR1-E10-F选自SEQ ID NO：15-17，FMR1-E17-R选自SEQ ID NO：18-20；和

（4）FMR1-Gap-Mix，其中所述FMR1-Gap-Mix选自SEQ ID NO：21-220。

根据一个优选的实施方案，所述FXS多种突变至少包括以下的一种或多种：FMR1的5’-UTR区域内由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入和微缺失；FMR1的FMR1-Gap-Mix引物范围内的大片段缺失和所有点突变。

根据一个优选的实施方案，本发明的引物组可以同时检测FXS的由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入、确定5’-UTR区域的微小缺失的准确位点；检测FMR1的全部SNV和FMR1-Gap-Mix引物范围内的大片段缺失。

在一个实施方案中，可以在所述引物的5’端加上5-50nt不同序列的DNA，即DNA条形码（Barcode），用于区分不同的样本；优选地，F和R引物的5’端的Barcode可以相同或者不同，本领域技术人员可以根据需要选择。

根据一个优选的实施方案，其中所述引物组可以用于1个或2个体系的PCR扩增包括FMR1基因和FMR1基因5’-UTR区域的所有范围内突变类型的FXS相关致病基因片段。再结合后续的PacBio或Nanopore测序平台，可以检测FMR1基因和FMR1基因5’-UTR区域内所有基因片段的突变类型。

本发明第二方面提供了本发明第一方面的引物组在制备用于检测FXS多种突变的试剂盒中的用途，其中所述FXS多种突变至少包括以下的一种或多种：FMR1的由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入、大片段缺失、点突变和微缺失。

本发明第三方面提供了一种用于检测FXS多种突变的试剂盒，包括以下试剂：

（1）用于长片段PCR扩增的试剂；

（2）用于高GC PCR扩增的试剂；

（3）用于构建三代测序文库的试剂。

在一个实施方案中，其中所述用于长片段PCR扩增和高GC PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物组。

根据一个优选的实施方案，所述试剂盒中的引物组选自以下的一对或多对引物：

（4）FMR1-Gap-Mix，其中所述FMR1-Gap-Mix选自SEQ ID NO：21-220；

根据一个优选的实施方案，本发明的引物组可以同时检测FXS的由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入、确定5’-UTR区域的微小缺失的准确位点、检测FMR1的全部SNV和FMR1-Gap-Mix引物范围内的大片段缺失。

在一个实施方案中，可以在所述试剂盒中的引物的5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），用于区分不同的样本；优选地，F和R引物的5’端Barcode可以一样或者不一样，本领域技术人员可以根据需要选择。

在一个实施方案中，对于所述试剂盒， PCR扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。

在一个实施方案中，其中所述试剂盒中，用于构建三代测序文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。

在一个实施方案中，其中对于所述试剂盒，长片段PCR扩增和高GC PCR扩增在一个或两个反应管中完成。

在一个实施方案中，三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。

根据一个优选的实验方案，其中所述用于构建三代PacBio测序文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇、反应缓冲液和外切酶。

根据一个优选的实施方案，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。

根据一个优选的实施方案，PacBio通用平末端接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’（SEQ ID NO: 221），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。

根据一个优选的实施方案，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’（SEQ ID NO: 222），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。

根据一个优选的实施方案，PacBio接头可以带或者不带Barcode。优选地，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。

根据一个优选的实施方案，所述PacBio文库与Pacific Biosciences公司测序平台匹配。

根据一个优选的实施方案，其中所述用于构建三代Nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。

根据一个优选的实施方案，Nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。

根据一个优选的实施方案，Nanopore接头可以带或者不带Barcode。优选地，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。

根据一个优选的实施方案，所述Nanopore文库与ONT公司测序平台匹配。

本发明第四方面提供了一种用于检测FXS多种突变的系统，包括以下模块：

（1）采集模块：获取受试者样本；

（2）扩增模块：对所述样本进行长片段PCR扩增和高GC PCR扩增；

（3）文库构建模块：构建三代测序文库；

（4）测序模块：测序并分析FMR1基因突变类型。

其中，所述步骤（2）中的PCR扩增采用本发明第一方面所述的引物组进行；

在一个实施方案中，其中所述长片段PCR扩增为扩增样本中的FMR1 E2-9、FMR1E10-17片段。

在一个实施方案中，其中所述高GC PCR扩增为扩增样本中的FMR1 E1片段。

在一个实施方案中，其中所述方法中，长片段PCR和高GC PCR扩增在一个或两个反应管中完成。

在一个实施方案中，其中所述样本选自生物样本或样本提取的gDNA。其中生物样本选自培养的细胞系、血液、羊水、绒毛、配子、囊胚细胞、关节液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液等。

在一个实施方案中，其中所述方法的三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。

根据一个优选的实施方案，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’（SEQ ID NO: 222），通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子，带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。

根据一个优选的实施方案，PacBio接头可以带或者不带Barcode。在优选的实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode。本领域技术人员可以根据需要选择。

根据一个优选的实施方案，Nanopore接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。优选地，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。

本发明第五方面提供了一种用于检测FXS多种突变的方法，包括以下步骤：

（1）获取受试者样本；

（2）对所述样本进行长片段PCR扩增和高GC PCR扩增；

（3）构建三代测序文库；

（4）测序并分析FMR1基因突变类型。

基于长片段PCR和高GC PCR扩增和第三代高通量测序特定组合的本发明所述的方法可高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个样品FXS相关致病基因的多种突变。

本发明所述方法和试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面：

（1）检测范围广：本发明可以同时检测目前已研究发现的FXS的CGG重复扩张类型，以及可以检测发生在CGG重复区域的缺失；可以检测FMR1基因的全部SNV和FMR1基因上下游约2MB区域内的大片段缺失。

（2）多种突变类型单个试剂盒检测：传统的方法针对每种突变类型都需要设置一种检测体系，而本发明在两个反应引物体系里同时检测多种突变，包括由CGG扩张引起的前突变和全突变、判断CGG重复中的AGG插入、微缺失、SNV和大片段缺失。

（3）检测误检和漏检率低：目前通用的检测FXS的CGG扩张最常见的方法是结合CE的PCR反应检测，对于一些低比例的嵌合突变由于信号噪音的影响容易判断为阴性，或者将阴性判断为突变患者，而本发明的高GC PCR体系结合三代测序的方式可以排除噪音的影响，更准确的确认FXS中的CGG扩张类型；而目前并没有对FMR1基因5’-UTR区域的微缺失和FMR1基因的SNV检测形成有效的方案，因此，一些由于这些原因造成的突变无法被检测发现，本发明的两个反应引物体系可以同时检测上述突变类型。

（4）样本多样化：用于PCR的模板可以是外周血、干血斑或经提取的基因组DNA，也可以是人源细胞系或其他特定的组织。

（5）高通量检测：三代测序可实现384种Barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种Barcode接头。或者利用引物带Barcode和接头带Barcode的双Barcode系统实现更多种Barcode组合。三代测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测。

（6）精确度高：PacBio的哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，矫正后测序结果碱基精确度大于99%。而且PacBio测序错误是随机的，再通过测序深度矫正碱基精确度大于99.9%。因此可以精确解读引物检测范围内的基因突变。

（7）检测时间灵活：Nanopore平台可在数分钟内产生数据，可根据实际数据量需求在数分钟或数小时内开启数据分析。当对检测时效要求比较高时，Nanopore平台具有时间优势。

附图说明

图1A-1B：PCR引物设计示意图，其中图1A表示FXS相关FMR1 E1检测引物设计示意图，和图1B表示FXS相关FMR1基因和大片段缺失检测引物设计示意图。

图2A-2B：FXS扩增片段凝胶电泳示意图，其中图2A表示长片段PCR扩增FMR1 E2-9和FMR1 E10-17的DNA凝胶电泳示意图，和图2B表示高GC PCR扩增FMR1 E1的DNA凝胶电泳示意图。

图3A-3L：代表性的FXS相关基因突变样本PacBio测序结果图，其中图3A表示正常人样本CGG扩张（29），图3B表示前突变携带者样本CGG扩张（29/87），图3C表示全突变携带者样本CGG扩张（36/439），图3D表示正常人样本CGG扩张（30），图3E表示前突变携带者样本CGG扩张（29/118），图3F表示全突变样本CGG扩张（203/342/725），图3G表示前突变携带者样本CGG扩张（29/61），图3H表示全突变样本CGG扩张（335/659），图3I表示前突和全突变嵌合样本CGG扩张（69/191/221/336），图3J表示FMR1点突变样本，图3K表示FMR1 5’-UTR微缺失样本，和图3L表示FMR1大片段缺失样本。

具体实施方式

实施例1：利用本发明涉及的PCR方法扩增并构建PacBio测序文库

步骤1：长片段和高GC PCR扩增

按照下表1（长片段PCR）和表2（高GC PCR）制备反应体系，扩增外周血、干血斑和基因组DNA样本：

在PCR仪上，按照下表3所示条件进行预扩增：

扩增完成后，每个样本取5 ul，在1%的DNA凝胶上检测，结果如图2A和图2B所示，以不同样本为模板，FMR1基因不同片段均能得到有效地扩增；同时，将扩增产物放入离心机中，10000rpm，离心20min。离心结束后水平静置放置，取4μL上清加入新的管内，进行下一步实验。

步骤2：构建PacBio测序文库

按照下表4制备反应体系：

在PCR仪上，按如下条件进行反应：37ºC 20 min; 25ºC 15 min; 65ºC 10 min。反应完成后，加入0.5 μL Exonuclease III（NEB, Cat#M0206L）和0.5 μL Exonuclease VII（NEB, Cat#M0379L），继续在37ºC反应1小时。用0.6x Ampure PB磁珠（PacBio, Cat#100-265-900）依照制造商的说明书纯化两次，最后用10uL Elution Buffer洗脱DNA。所得DNA洗脱液即是目标DNAPacBio测序文库。用Qubit dsDNA HS试剂（ThermoFisher, Cat# Q32851）在Qubit 3 Fluoromter （ThermoFisher, Cat#Q33216）上测定DNA浓度。当有多个样本PacBio测序文库时，可以取等量的文库混合在一起，制备成混合文库。

步骤3：PacBio上机测序和分析

根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂（PacBio，Cat#101-820-200）和引物（PacBio, Cat#100-970-100）反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如下所示，图3A表示正常人样本（CGG重复数为29），图3B表示前突变携带者样本（CGG重复数为29和87）, 图3C表示全突变携带者样本CGG扩张（36/439）。

实施例2：利用本发明涉及的PCR方法构建PacBio测序文库

步骤1：长片段和高GC PCR扩增

按照下表5（长片段PCR）和表6（高GC PCR）制备反应体系，扩增不同类型FXS相关基因突变的外周血样本：

在PCR仪上，按照下表7所示条件进行预扩增：

扩增完成后，将扩增产物放入离心机中，10000rpm，离心20min。离心结束后水平静置放置，取4μL上清加入新的管内。

步骤2：构建PacBio测序文库

按照下表8制备反应体系：

步骤3：PacBio上机测序和分析

根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂（PacBio，Cat#101-820-200）和引物（PacBio, Cat#100-970-100）反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如下所示，图3D表示正常人样本CGG扩张（30），图3E表示前突变携带者样本CGG扩张（29/118），图3F表示全突变样本CGG扩张（203/342/725）。

实施例3：利用本发明涉及的PCR方法构建PacBio测序文库

步骤1：长片段和高GC PCR扩增

按照下表9（长片段PCR）和表10（高GC PCR）制备反应体系，扩增不同类型FXS相关基因突变的外周血样本：

在PCR仪上，按照下表11所示条件进行预扩增：

步骤2：构建PacBio测序文库

按照下表12制备反应体系：

步骤3：PacBio上机测序和分析

根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂（PacBio，Cat#101-820-200）和引物（PacBio, Cat#100-970-100）反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如下所示，图3G表示前突变携带者样本CGG扩张（29/61），图3H表示全突变样本CGG扩张（335/659），图3I表示前突和全突变嵌合样本CGG扩张（69/191/221/336），图3J表示FMR1点突变样本，图3K表示FMR1 5’-UTR微缺失样本，图3L表示FMR1大片段缺失样本。

实施例4：FXS基因突变的检测和验证

收集24个受试者的外周血基因组DNA作为验证样品24例，参照实施例3，利用本发明方法（和试剂盒）同时检测FXS相关基因的多种突变。同时用PCR-CE的方法检测FXS的CGG重复扩张，结合Sanger测序的方法检测相关基因的点突变和缺失。利用本发明得到的结果和对照结果相对比，结果如表13所示，24例样本结果完全一致。

因此，利用本发明方法检测的结果，经过与PCR-CE结合PCR-Sanger测序方法对比，特异性和灵敏度均达到100%。本发明方法可以直接检测CGG重复序列，而不是通过其他方式进行推测；因此，本发明方法的准确性优于PCR-CE法；而且24例样本中，有7例样本通过本发明的方法确定全突变样本的CGG重复数。本发明方法可以直接检测未知的FMR1的全部SNV和大片段缺失，而PCR-sanger法只能对已知结果进行验证。

应当理解，尽管本发明已根据其优选实施例进行了示例性描述，但不应限于上述实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。长片段PCR和高GCPCR反应和三代测序文库构建中所涉及的反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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序列表

<110> 北京贝瑞和康生物技术有限公司

<120> 检测脆性X综合征突变的方法和试剂盒

<130> CID220036

<160> 222

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggaccctgta gggactgata tgacaatg 28

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caacacaggt tgagtgtggc ttgtag 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gagttgagga aaggcgagta cgtgg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acctgtcacc gcccttcagc cttcc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggtgccgact accgcttctt actac 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccgaaatcca caaagagaag ccac 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tttagacgct gaagcatgtg cattcc 26

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctgaaaggtg ttagttgatc tgcaatgg 28

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ctggactttt tagtgttgtt tgcagc 26

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caatatatgg ctgatatatg gttctggaac 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggagagaaag gtaggttaca atatatggct g 31

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gctgggcaag atttatcctt tcagg 25

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ccttctgaaa atgtaacctt tgagcatc 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tttgtatgct gtaagaacag atcgattg 28

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gcaagtatta atcaactctg gtacctgacc 30

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cctgaccaaa ggagtttaaa caatgatg 28

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cagattaacc atcttgttga aaagagtctc 30

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ggtagaacac tgacactgtc acctctcc 28

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aggaggctgt ctagcatcat tttgg 25

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ccaggcacat tctacctaca aacctctc 28

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gcatttgatt tcccacgcca ctgag 25

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gaactggttg caggatgtct gagg 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gtatcagtcc tcctgtccat gcag 24

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gccattgagt tgcatacctt cagatgat 28

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

tccatcctat ggtctagtgg ctagga 26

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

caccaaggcc ataaatattg caacact 27

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

cctagtgaaa tgtgtaccag agcact 26

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

gtggcttgag gctcttaaga aagttgac 28

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

gtatccgtat ccgtgtacct gcttg 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

cggcaagctt gatagagtca ttgtg 25

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

ccagttgtta cctccatgac cttgag 26

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ctactatctg tgttggccaa gcatagc 27

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gcaggaagtg ccatactcag cac 23

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

ctgaaggagc agtgagagtg tgtattc 27

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

gtgtctgcta tgctcctgat tcagc 25

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

gtcgctgaga ttgtggagct acc 23

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ccactagaca catgtagcag agcac 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

ctctccagag tcctgcatgt ggtac 25

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

cagttctgag aattggagct gcttgac 27

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

gaagtgacgg aaccagaagg tagac 25

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

cagcatctct cgatcctcat tgcc 24

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

cagcatatac ctatcacacc aacagctc 28

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

ccaagcattg ctatgtgtgg ttgtag 26

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

cttgtgtctc cacgtcattg gagc 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

ctgctcttca cctcattgat gagg 24

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

cagtcacctg tagcaccagc tac 23

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

gagcagatga ctgatgggtg tagtag 26

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

ccatcaattc cactgcttgg cac 23

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

cggtgatcaa ggcaacatca gtag 24

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

caggcagtat gagtgagtga gcattc 26

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

ctgtagtgcc caaggtctca cttac 25

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

cttactacat gaggcagaat aggatcac 28

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

gcctgagcac catctagtgt aaatgc 26

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

gctcatgatg tgtcattagg gaactgc 27

<210> 55

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

cagcatttga ttggaggctg tactag 26

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

cagcagtaga gtgaggcaga gag 23

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

gtgatgtggg agagtagtgt ggac 24

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

catccagttc gtagcatggt gtctg 25

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

gccttaatgt cagagcctgc ctg 23

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

ccatgacaag catcagtact aggtttag 28

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

caactcatga gtgtgcatca ctttc 25

<210> 62

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

catatgccag tcactaggcc agatag 26

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

ctaaatacat cccgactaat acagcctg 28

<210> 64

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

gctgcagtat gtgtagcatg aatatgtg 28

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

cctagttcct ctagatacgg tgttagg 27

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

cacaagggca tgacccagga ac 22

<210> 67

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

cttatggcaa tagcaatgtg aggagg 26

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

ggataacctc gcttgctggg tc 22

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

acaggtagtt acacagccat gagc 24

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

tgaacatcga acgccagcaa cac 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

cagacagcat cgttctgagg tgc 23

<210> 72

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

gtgtatttgt gtggctcaag gtaacttc 28

<210> 73

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

gctgatgcaa ttgtgtgtaa gtactgac 28

<210> 74

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

ggcccacatg caccaattag aagg 24

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

cccatctata tgccctttat ttggc 25

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

cgtccacagg ccataggtgc caac 24

<210> 77

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

taatgtgtac acatgggcct acagag 26

<210> 78

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

gaggtgttag taaactctaa aatgcc 26

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

ccagtaccca tagtgacccc caagg 25

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

ctagttcata tctgaatgga gagctgt 27

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 81

ctggctggga atctggtaat ggctg 25

<210> 82

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 82

gcaatgcata aagggataag actagagac 29

<210> 83

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 83

ggatattagc ttcagcttgg gtccaag 27

<210> 84

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 84

ctgtgcacag ccacaatcag tttaacag 28

<210> 85

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 85

cctgttcccc tatctcctaa tcaagag 27

<210> 86

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 86

gagtccctct aagtcttgag ttatgc 26

<210> 87

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 87

cacttgcttt gtatgaaaca gttaagag 28

<210> 88

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 88

gccactttga atgtctgaca gctt 24

<210> 89

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 89

gccaggagaa ataagctagg ccaa 24

<210> 90

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 90

gagtgggtgc acaggatgca aaac 24

<210> 91

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 91

gcgattttgg gactgagata tttccc 26

<210> 92

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 92

ccaaaacagc atggtactgg taccaaaac 29

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 93

ggcatttcag acacctctgc agt 23

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 94

gaccagggtg tctgggctgc a 21

<210> 95

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 95

cagcctctgg atattaagcc actgg 25

<210> 96

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 96

cctggagaat gttctttgtg ctgatga 27

<210> 97

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 97

ctgaacttct ctctccgtgg agcaag 26

<210> 98

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 98

ggtatctttt gtgtgatgag acagtcag 28

<210> 99

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 99

gtttggcata tgtcaaggaa tgaacaagg 29

<210> 100

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 100

gcaagtcaag acaaccacac atttaag 27

<210> 101

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 101

gcaatcctac agtagtagtg ggagac 26

<210> 102

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 102

ccaggaatcc cacttacaat tgcc 24

<210> 103

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 103

cactctatta acgcttgtgt ctgcacc 27

<210> 104

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 104

cccaccacat accttaagca tcttgg 26

<210> 105

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 105

gtggtggtaa caatgagata gtcatgtag 29

<210> 106

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 106

cagggaaaaa taaatgaaaa ccgcgatg 28

<210> 107

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 107

tccagcaact tgggccaaat tatg 24

<210> 108

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 108

ggaacagttt gcagggctca aaag 24

<210> 109

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 109

ttccaccatc ctgccttcac agtg 24

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 110

ggttcaagcg attctttagt ctcaacc 27

<210> 111

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 111

tgtaagcaat caatctttgg atcttgc 27

<210> 112

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 112

ggcatagaat tatgcaagct caatgc 26

<210> 113

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 113

gtagtgacag aactaaacca tgtttctc 28

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 114

ggttcagctc tgctggcaat gatacc 26

<210> 115

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 115

gggaaactgc cacacagtct ttc 23

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 116

gaagtgctgg tacggaaggt cg 22

<210> 117

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 117

ctggacaagc aagagaagtc caagc 25

<210> 118

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 118

gaggtttagc tggacttaca gttcaatatg 30

<210> 119

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 119

gagaccagca taatcccatt gtcaaag 27

<210> 120

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 120

gagctaagcc cttacctggg aaatcg 26

<210> 121

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 121

ctaccagtct ggtgactagg tacag 25

<210> 122

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 122

ggagatcaac taagcaagct caatgttc 28

<210> 123

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 123

ctcttgtgca tgacttgatc gcctag 26

<210> 124

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 124

caatgccaac tctatcaaca ttccaatg 28

<210> 125

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 125

ctctttgact gtgggtggac cttg 24

<210> 126

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 126

caatttcaca atactgggtc agtgactg 28

<210> 127

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 127

ggaaatatgg aacaggtaga ggtgaag 27

<210> 128

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 128

cttcattaac gacttgatga ggcagg 26

<210> 129

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 129

gacgactaga tctagggctc taagg 25

<210> 130

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 130

gcatgcctac gagatctaca aactag 26

<210> 131

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 131

ggagggtcta atccttcacg ttcttg 26

<210> 132

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 132

gctaaggttg cctgattact tgcca 25

<210> 133

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 133

caccatacca caacatatgg gattcagtg 29

<210> 134

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 134

cttggcactc aaagctgcag ag 22

<210> 135

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 135

ccagtgcaat cactgatgtt cagaatg 27

<210> 136

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 136

gactaataca agcaggtcca gagcc 25

<210> 137

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 137

ggccacaaga acagctaaca tttatg 26

<210> 138

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 138

gccacgctga actcattaag tgttg 25

<210> 139

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 139

ccaagagggc aggtattcaa gac 23

<210> 140

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 140

ctcgagtaag tcacttttac ctcttcg 27

<210> 141

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 141

gtatccctgg gagttgtgat gaaag 25

<210> 142

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 142

ctcaagctta caggctgatg cttgc 25

<210> 143

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 143

gtcccatcca agttcagaca catg 24

<210> 144

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 144

gtcctcaact acgatttgct tacaagac 28

<210> 145

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 145

ctatggttct ccattgattt gcagattg 28

<210> 146

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 146

gtctctcagt gacacatcca tgac 24

<210> 147

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 147

gcattgttct aggtactaca gactgc 26

<210> 148

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 148

gctctaaggt ggcagaggag atag 24

<210> 149

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 149

ggctgtccct agtgactttt ctcc 24

<210> 150

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 150

gcaacccaca taagcatcat ttctctg 27

<210> 151

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 151

gcctgtgctt gtgagctatt actc 24

<210> 152

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 152

ctgtctctca aaggagttct gggttc 26

<210> 153

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 153

ctgtagcaac ctactgcctg gac 23

<210> 154

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 154

gcatgaaacc ctccttgtga caga 24

<210> 155

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 155

gtgctgtgct gtgagatacc tttg 24

<210> 156

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 156

cttgaggcag cctgcctact tcc 23

<210> 157

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 157

gtatcaggca gagaaggcag aagc 24

<210> 158

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 158

ggctagagta gctgggaagc ag 22

<210> 159

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 159

gctgatggca tgatattact cattccac 28

<210> 160

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 160

cttccattct acaaactctg ccagg 25

<210> 161

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 161

gtgcgtgcta tggcacaatc tc 22

<210> 162

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 162

gacatgtcac aaatgtgggc aagg 24

<210> 163

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 163

ggttctgcct tctactccat tggtc 25

<210> 164

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 164

gtgagttgta gttcattcac aatttggc 28

<210> 165

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 165

gaaccatcaa actgcatgac accttg 26

<210> 166

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 166

gcgtggatag ggtaacctga cac 23

<210> 167

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 167

ccagcccaga gactctagtg atg 23

<210> 168

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 168

cattgctgct atatagaagt gctgctg 27

<210> 169

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 169

gacagctaat gcagaagaat gcatacag 28

<210> 170

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 170

ggacttgcta gaggatagca tgtagg 26

<210> 171

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 171

gtaagagagg atggttgtct tgtgatg 27

<210> 172

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 172

ctcatgtctc tacccattca gctg 24

<210> 173

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 173

gtcatgtcct tcatcatcct atctcaag 28

<210> 174

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 174

catgggcagt acacagagta gc 22

<210> 175

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 175

atctatgcct ggacatttcc actgcc 26

<210> 176

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 176

ccttggggaa cgatggcaga gag 23

<210> 177

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 177

cctaagtact catgggtcaa ctcaggc 27

<210> 178

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 178

gcaggtgagg aaaccaaggc ttcaag 26

<210> 179

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 179

gaaataaagc tgccccttta agagttcc 28

<210> 180

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 180

ggtcaccaag tgaaccagta tctgc 25

<210> 181

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 181

cacactgata gtcaaggtgg ctctc 25

<210> 182

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 182

gaagaaagaa atcaacagga gaaatggg 28

<210> 183

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 183

gaatggatct cggtaaaagg tcctgg 26

<210> 184

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 184

agcatagtaa ctggcccaca gtg 23

<210> 185

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 185

gggatttacc ttcagctaca gttagg 26

<210> 186

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 186

ccaagcaaac agaattgccc tccatc 26

<210> 187

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 187

gatactcaag acagtgagtg gtctatgc 28

<210> 188

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 188

gcctacccca ttagattgaa tgaagag 27

<210> 189

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 189

gatatatcac atcccctgag gagttagtc 29

<210> 190

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 190

catgatccag aggtattgca aagtcctg 28

<210> 191

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 191

caaggagtaa acataaggcg agtgtg 26

<210> 192

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 192

accttcagaa tccagtcctt cctatc 26

<210> 193

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 193

ctgagccact agccaatctg agcac 25

<210> 194

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 194

cattggtcac ctttccttag gactgc 26

<210> 195

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 195

gactaatgtg ctaggaggct attgtacc 28

<210> 196

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 196

gcaactggat ggccttccat tcattg 26

<210> 197

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 197

gctttacaac aagaagcact gtgc 24

<210> 198

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 198

gatgctttgc acatctgaat gtagtcag 28

<210> 199

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 199

gaagtggcag tctacccaaa aattgcc 27

<210> 200

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 200

caaatgtgag ttgcattcat gaactatgg 29

<210> 201

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 201

ctgcatttag aaatcccctc tgatatgc 28

<210> 202

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 202

gtctgggcac ttgactggta aacag 25

<210> 203

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 203

gatgcggtga ccagggaaca cttc 24

<210> 204

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 204

gtctgcctat agcactatca cacattac 28

<210> 205

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 205

gtttcaactt cagttgttct gccccac 27

<210> 206

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 206

cttaggaagg aaatctacaa ccttcacaag g 31

<210> 207

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 207

gcttcactgg caaatggggc taacc 25

<210> 208

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 208

cgaaagcaaa aacagctgaa ttcagtc 27

<210> 209

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 209

ctagagccat agcaatccag gagac 25

<210> 210

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 210

gccagttttt aagtaagtct cctggtc 27

<210> 211

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 211

agcatttaga gcatgctgct ctcc 24

<210> 212

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 212

ataatccaga tctcaagccc ctgtgc 26

<210> 213

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 213

gaactagtta aaatgtggga aacaagcc 28

<210> 214

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 214

gcagcatgaa acatccagaa acatgc 26

<210> 215

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 215

caactaacag tgaaaagcat ccctgc 26

<210> 216

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 216

gaggtgcaca ctgcctggat tgc 23

<210> 217

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 217

catttcattc cacttcttcc ctgacc 26

<210> 218

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 218

cagtgtgcat cacaggtatc agg 23

<210> 219

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 219

aagtctgttc tagaagactt aggttatcac 30

<210> 220

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 220

gagggtgcct cattatcttg aaatgag 27

<210> 221

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 221

atctctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gagat 45

<210> 222

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 222

atctctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gagatt 46

Claims

1.一种用于扩增FXS多种突变的引物组，包括选自以下的一对或多对引物：

（4）FMR1-Gap-Mix，其中所述FMR1-Gap-Mix选自SEQ ID NO：21-220；

2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物在5’端包括5-50nt不同序列的DNA条形码。

3.权利要求1-2任一项所述的引物组在制备用于检测FXS多种突变种的试剂盒中的用途，其中，所述FXS多种突变至少包括以下的一种或多种：FMR1的由CGG扩张引起的前突变和全突变、CGG重复中的AGG插入、大片段缺失、点突变和微缺失。

4.一种用于检测FXS多种突变的试剂盒，包括以下试剂：

（1）用于长片段PCR扩增的试剂；

（2）用于高GC PCR扩增的试剂；

（3）用于构建三代测序文库的试剂；

其中，所述用于PCR扩增的试剂包含权利要求1-2任一项所述的引物组；

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述长片段PCR扩增和高GC PCR扩增在一个或者两个反应管中完成。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述用于长片段PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述用于高GC PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述用于构建三代测序文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies公司的Nanopore测序。

10.一种用于检测FXS多种突变的系统，包括以下模块：

（1）采集模块：获取受试者样本；

（3）文库构建模块：构建三代测序文库；

（4）测序模块：测序并分析FMR1基因突变类型；

其中，所述模块（2）中的PCR扩增采用权利要求1-2任一项所述的引物组进行；

11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述长片段PCR扩增样本中的FMR1 E2-9、FMR1E10-17片段。

12.根据权利要求10所述的系统，其中，所述高GC PCR扩增样本中的FMR1 E1片段。

13.根据权利要求10所述的系统，其中，所述长片段PCR扩增和高GC PCR扩增在一个或者两个反应管中完成。

14.根据权利要求10所述的系统，其中，所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies公司的Nanopore测序。