CN103981253A - 一种用于检测脆性x染色体综合征的cgg重复数及agg插入信息的pcr试剂盒 - Google Patents

一种用于检测脆性x染色体综合征的cgg重复数及agg插入信息的pcr试剂盒 Download PDF

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CN103981253A CN201410119503.0A CN201410119503A CN103981253A CN 103981253 A CN103981253 A CN 103981253A CN 201410119503 A CN201410119503 A CN 201410119503A CN 103981253 A CN103981253 A CN 103981253A
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潘海波
华琴
邢楠楠
谢阳
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Jiangsu Full Gene Biological Medical Technology Co Ltd In One Hundred Age
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明提供了一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker；所述的引物包括：1）用于检测CGG重复数的引物F、R；2）用于检测AGG插入信息的检测引物M1、R1和验证引物M2、F1。本发明的试剂盒能精确快速分析样品CGG重复数以及AGG插入信息；能够突破现有脆性X染色体综合征检测方法采用荧光探针、MLPA、SouthernBlot、测序等难度高、耗时长、成本高的壁垒；通过凝胶电泳结果可直接分析CGG重复数的范围及AGG的插入个数从而快速诊断样品特征；采用高分辨率设备分离产物得到产物分离度，通过数学模型获得CGG重复数及AGG插入信息。

Description

一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，属于分子生物学及遗传病临床诊断领域，尤其是涉及脆性X染色体综合征及其他因三联、四联核苷酸高度重复引起的遗传疾病临床诊断领域。
背景技术
脆性X染色体综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，也是目前已知自闭症最常见的发病原因之一。发病率占全部儿童的0.05%，呈X连锁遗传，占X连锁智能低下的40%。95%以上的脆性X综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR-1基因(CGG)n结构扩展的动态突变引起的，约5%以下则是由于FMR-1基因的错义突变和缺失型突变影响了脆性X智能低下基因蛋白（FMRP）的正常结构导致的。FMR-1基因是一个高度保守基因，其位于染色体Xq27.3，在基因组序列约38kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码FMRP。在其5’端外显子上的非翻译区有一个(CGG)n三核苷酸串联重复序列，(CGG)n在重复片段长度和AGG嵌入模式上都存在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR-1基因(CGG)n中n介于7-55之间。当n扩展到55-200时，携带者虽表型正常，但在传代过程中易发生进一步扩展，称FMR-1基因的前突变。当n扩展达200以上时，男性表现100%为典型的脆性X综合征，女性也有30%-50%表现轻重程度不等的智能低下。这种FMR-1基因的突变称全突变。(CGG)n重复序列大量扩展，引起FMR-15’(CGG)n侧CpG岛异常甲基化，使FMR-1基因失活，导致FMRP的缺失引起智能低下。已知的FMR-1突变有三种类型。超过99%的脆性X综合征的患者是由三核苷酸重复顺序扩增和超甲基化所致。少于1%的患者因FMR-1基因部分缺失或点突变而致病。影响重复序列扩增的主要因素有三：重复序列的总长度，AGG中断的数目和位置以及重复序列的亲源性别。重复序列的高度扩增只见于母亲向子代的传递，而父亲的不稳定重复序列在向子代传递时，扩增的几率较低。约30%子代的重复序列比其父亲的缩短，这是所谓的重复序列收缩。
脆性X综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律独特，目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。
检测脆性X综合征CGG重复数及AGG插入信息，可得到FMR-1第一个外显子5’端非翻译区的（CGG）n重复序列的信息。正常人群中，CGG重复数在7-55之间，常含有2-3个AGG，称为AGG中断。当CGG重复数超过60个或当AGG中断丢失导致连续的CGG超过35-40个重复后，则可能成为不稳定的三核苷酸重复序列。CGG重复数在55-200之间，通常无CpG岛超甲基化称为（CGG）n重复序列的前突变。约有20%的卵巢早衰患者被检出携带FMR-1前突变，因此，脆性X相关的卵巢早衰和前突变的病理作用有关。本发明适用于疑似卵巢功能早衰的患者的FMR-1前突变的分子检测。
现有脆性X染色体综合征检测方法采用荧光探针、MLPA、SouthernBlot、测序等技术，所述现有技术操作难度高、检测耗时长、耗费成本高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒。
本发明是用于检测脆性X染色体综合征CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒,包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker。
本发明所述的引物包括：用于检测CGG重复数的引物F、R，及用于检测AGG插入信息的检测引物M1、R1和验证引物M2、F1；所述的检测引物和验证引物均包含有搜索探针的第一引物以及位于CGG重复区侧翼相应的退火引物；所述的检测CGG重复数的上游引物F，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-3中的任意一种，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:4-6中的任意一种；所述的检测AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列为SEQIDNO:11-13中的任意一种，下游引物R1的核苷酸序列为SEQIDNO:17-19中的任意一种；所述的验证AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列为SEQIDNO:20-22中的任意一种，下游引物M2的核苷酸序列为SEQIDNO:14-16中的任意一种；所述的引物M1、M2在其5’端包含一段与人类基因组无关的序列S，其中序列S的核苷酸序列为SEQIDNO:7-10中的任意一种，以上引物信息详见表1。
表1引物序列信息
SEQIDNO:1 GCGCTCAGCTCCGTTTCGGTT
SEQIDNO:2 TCACCGCCCTTCAGCCTTCC
SEQIDNO:3 CGACCTGTCACCGCCCTTCA
SEQIDNO:4 GCACTTCCACCACCAGCTCCTC
SEQIDNO:5 AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCC
SEQIDNO:6 TCCACCACCAGCTCCTCCATC
SEQIDNO:7 AATTCGCGCTGGAGAAATTCAT
SEQIDNO:8 AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGC
SEQIDNO:9 TACGCATCCCAGTTTGAGACG
SEQIDNO:10 AGCGTCTACTGTCTCGGCAC
SEQIDNO:11 S+(CGG)4AGG
SEQIDNO:12 S+(GCG)4GAG
SEQIDNO:13 S+(GGC)4GGA
SEQIDNO:14 S+(GCC)4TCC
SEQIDNO:15 S+(CGC)4CTC
SEQIDNO:16 S+(CCG)4CCT
SEQIDNO:17 AGCCCCGCACTTCCACCACCAG
SEQIDNO:18 GCACTTCCACCACCAGCT
SEQIDNO:19 TCCACCACCAGCTCCTCC
SEQIDNO:20 TCACCGCCCTTCAGCCTTCC
SEQIDNO:21 TTCAGCCTTCCCGCCCTCCA
SEQIDNO:22 CGACCTGTCACCGCCCTTCAG
本发明提供一种用于高GC含量复杂模板扩增用的PCR增强剂，其已在另一专利中进行详述。
本发明所采用的检测设备应可以有效分离核苷酸样品，其中结果的表现形式为琼脂糖凝胶电泳图及微流体毛细管电泳分离曲线。所述的检测设备可以为安捷伦2100生物分析仪、HPLC、ABI3730、BECKMANMDQ系列及其他具有同等性能的分离分析设备，优选安捷伦2100生物分析仪。
本发明提供一种用于检测设备校正的校正Marker，检测设备校正曲线的R2应大于0.995。
本发明的检测方法提供一种分析致病基因FMR-1的数学模型，通过该数学模型来分析CGG重复数以及AGG插入信息。
本发明不限于脆性X染色体综合征临床诊断，还可以应用于其他三联、四联核苷酸高度重复引起的遗传疾病临床诊断。
本发明的技术原理如下：
本发明采用一对位于CGG重复区侧翼的引物F、R用于扩增含有CGG重复区的片段，同时利用检测设备对该片段进行结果分析；建立关于CGG重复数的数学模型并依此分析样品的CGG重复数。同时提供另外两对引物，其中一对为检测引物M1、R1，另一对为验证引物M2、F1。所使用的两对引物中都包含有一个作为搜索探针的第一引物M1、M2，包含CGG、GCG、GGC、CCG、GCC、CGC重复及AGG、GAG、GGA、CCT、TCC、CTC。所使用的两对引物中都包含有一个作为搜索探针的第一引物M1、M2，包含CGG、GCG、GGC、CCG、GCC、CGC重复，CGG、GCG、GGC、CCG、GCC、CGC重复区的3’端包含A。所使用的两对引物中都包含有一个作为搜索探针的第一引物M1、M2，包含CGG、GCG、GGC、CCG、GCC、CGC重复，CGG、GCG、GGC、CCG、GCC、CGC重复区的3’端包含T。利用检测设备对该片段进行结果分析；建立关于AGG插入信息的数学模型并依此分析样品的AGG插入信息。
本发明的试剂盒，具有如下技术效果：
1）能够精确快速分析样品CGG重复数以及AGG插入信息；
2）能够突破现有脆性X染色体综合征检测方法采用荧光探针、MLPA、SouthernBlot、测序等难度高、耗时长、成本高的壁垒；
3）通过凝胶电泳结果可直接分析CGG重复数的范围及AGG的插入个数从而快速诊断样品特征；
4）采用高分辨率设备分离产物得到产物分离度，通过数学模型获得CGG重复数及AGG插入信息。
附图说明
图1.CGG重复数精确定量模型图
图2.CGG重复数精确定量扩增产物的琼脂糖凝胶电泳效果图
图3.CGG重复数精确定量扩增产物的安捷伦2100检测结果及修正值
图4.AGG插入数及插入位点模型图
图5.AGG插入数及插入位点中检测引物M1、R1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳效果图
图6.AGG插入数及插入位点中检测引物M1、R1扩增产物的安捷伦2100检测结果及修正值
图7.安捷伦2100生物分析仪校准曲线图
具体实施方式
下例实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
本发明中，安捷伦2100生物分析仪校准曲线绘制方法如下：
1）校正Marker：100bp，223bp，250bp，470bp，635bp；
2）与芯片分离胶混匀后，进行毛细管电泳检测；
3）以标准值作为横坐标，以测量值为纵坐标绘制标准曲线；结果如图7所示。结果显示，CE2100设备校准曲线，y=1.0584x+2.8139。其中R平方值>0.998，表明标准曲线的有效性。
实施例1制备脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒
1、引物设计
提供一对CGG重复区侧翼引物F、R用于扩增CGG重复区；另外提供两对不同的引物，其包括含有搜索探针的第一引物以及位于CGG重复区侧翼相应的退火引物；其中一对为检测引物M1、R1，另一对为验证引物F1、M2。两对不同的引物中都分别包含有一个作为搜索探针的第一引物M1和M2，其中检测引物M1、R1的第一引物M1作为上游引物，验证引物M2、F1的第一引物M2作为下游引物。M1包含CGG、GCG、GGC重复及AGG、GAG、GGA重复，M2包含GCC、CGC、CCG重复及TCC、CTC、CCT重复。M1、M2由位于5’端的一段与人类基因组无关的序列S及特异的搜索引物组成。
其中，所述的CGG重复区侧翼引物的上游引物F的核苷酸序列为SEQIDNO:1-3中的任意一种；所述的CGG重复区侧翼引物的上游引物R的核苷酸序列为SEQIDNO:4-6中的任意一种；所述的检测引物的上游引物M1的核苷酸序列为SEQIDNO:11-13中的任意一种；所述的检测引物的下游引物R1的核苷酸序列为SEQIDNO:17-19中的任意一种；所述的验证引物的上游引物F1的核苷酸序列为SEQIDNO:20-22中的任意一种；所述的验证引物的下游引物M2的核苷酸序列为SEQIDNO:14-16中的任意一种；所述的序列S的核苷酸序列为SEQIDNO:7-10中的任意一种。
2、准备PCR反应液
PCR反应液组分如下：
1）CGG重复数反应体系：10×缓冲液，缓冲液包括浓度为500mMTris-HCl（pH9.0）和20mMMgCl2；浓度为2.5mmol/L的dNTPs；浓度为10μmol/L的目的基因引物的上游引物F；浓度为10μmol/L的目的基因引物的下游引物R；活性为2.5U/μl的DNA聚合酶；PCR增强剂；双蒸水。
2）AGG插入信息反应体系：10×缓冲液，缓冲液包括浓度为500mMTris-HCl（pH9.0）和20mMMgCl2；浓度为2.5mmol/L的dNTPs；浓度为10μmol/L的检测引物的上游引物M1；浓度为10μmol/L的检测引物的下游引物R1；活性为2.5U/μl的DNA聚合酶；PCR增强剂；双蒸水。
实施例2CGG重复数精确定量
1）应用市售基因组DNA提取试剂盒，提取人外周血DNA，其浓度为100ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值大于1.8。
2）准备PCR反应体系：在200ul薄壁PCR试管中配制50μlPCR反应体系，
PCR扩增体系如下：
其中，引物为SEQIDNo:2、SEQIDNo:4。
PCR增强剂组成：甜菜碱（2.5mol/L）5μl、GCEnhancer5μl和DMSO4μl。
PCR反应程序：先95℃预变性8min后，进行30个循环：95℃变性50s，65℃退火45s，72℃延伸1min，然后，72℃终延伸10min。
3）反应结束后采用2%琼脂糖凝胶上样，在10V/cm的电场条件下电泳45min，并利用凝胶成像系统对电泳结果进行拍照分析，如图2所示。
4）利用商业化PCR产物纯化试剂盒对扩增结果进行脱盐处理。
5）将纯化后的样品与安捷伦2100生物分析仪的电泳胶混合后依照设备使用说明进行电泳分析，电泳结果如图3所示。
6）利用校准曲线对电泳结果进行校准，同时建立CGG重复数精确定量数学模型。数学模型如图1所示，其中，黑色横线部分表示CGG重复区的5’UTR及3’UTR；黑色横线部分表示CGG重复区。N为引物F、R扩增的片段大小，是通过CE2100设备校准曲线对安捷伦2100生物分析仪检测结果进行校准后得到的修正值；a为上游引物F到CGG重复区的碱基数；b为下游引物R到CGG重复区的碱基数；n为CGG总数。F、R所对应的a、b分别为：a=100、b=123，则CGG总数信息：n=(N-a-b)/3，即：n=(N-100-123)/3=(N-223)/3。结果如表2所示。
表2CGG重复数毛细管电泳检测结果及修正结果
样品号 测定值 修正值
14 305 286
15 308 288
16 310 290
实施例3AGG插入信息精确定量
1）应用市售基因组DNA提取试剂盒，提取人外周血DNA，其浓度为100ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值大于1.8。
2）准备PCR反应体系：在200ul薄壁PCR管中配制50μlPCR反应体系，PCR扩增体系如下：
其中，引物为SEQIDNo:5，SEQIDNo:11。
PCR增强剂组成：甜菜碱（2.5mol/L）4μl和GCEnhancer4μl。
PCR反应程序：先95℃预变性8min后，进行30个循环：95℃变性50s，68℃退火45s，72℃延伸1min，然后，72℃终延伸10min。
3）反应结束后采用2%琼脂糖凝胶上样，在10V/cm的电场条件下电泳45min，并利用凝胶成像系统对电泳结果进行拍照分析，如图5所示。
4）利用商业化PCR产物纯化试剂盒对扩增结果进行脱盐处理。
5）将纯化后的样品与安捷伦2100生物分析仪的电泳胶混合后依照设备使用说明进行电泳分析；AGG插入数及插入位点中检测引物M1、R1扩增产物电泳效果图如图6所示。
6）利用校准曲线对电泳结果进行校准，同时建立AGG插入数及插入位点数学模型获得AGG插入信息。AGG插入数及插入位点数学模型如图4所示，其中黑色横线部分表示CGG重复区的5’UTR及3’UTR；黑色虚线部分表示CGG重复区；通过M1、R1引物对就CGG重复区进行探针搜索AGG插入数目及位点信息；同时以F1、M2引物对对重复区进行二次搜索，并以搜索结果对M1、R1结果进行验证。
N为引物F、R扩增的片段大小、N1为引物M1、R1扩增的片段大小，N、N1均是通过CE2100设备校准曲线对安捷伦2100生物分析仪检测结果进行校准后得到的修正值；c为上游引物M1的碱基数；d为下游引物R1到CGG重复区的碱基数；P为AGG插入位点。
M1、R1所对应的c、d分别为：c=39、d=100，则AGG插入位点信息：P=(N-a-b)/3-(N1-c-d)/3，即:P=(N-100-123)/3-(N1-39-100)/3=(N-N1-94)/3。结果如表3所示。
表3AGG插入信息毛细管电泳检测结果及修正结果
样品号 测定值 修正值
14 167 155
15 168 156
16 169 157
结论：样品14-16的CGG总数信息和AGG插入位点的计算结果如下：样品14：
CGG总数信息：n=(N-223)/3=（286-223)/3=21
AGG插入位点：P=(N-N1-94)/3=（286-155-94）/3=12
样品15：
CGG总数信息：n=(N-223)/3=（288-223)/3=22
AGG插入位点：P=(N-N1-94)/3=（288-156-94）/3=13
样品16：
CGG总数信息：n=(N-223)/3=（290-223)/3=22
AGG插入位点：P=(N-N1-94)/3=（290-157-94）/3=13
样品14-16的CGG重复数及AGG插入位点如表4。
表4样品14-16的检测结果
样品号 CGG重复数 AGG插入位点
14 21 12
15 22 13
16 22 13
序列表
<110> OrganizationName : 江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司
<120> Title : 一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒
 
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Claims (15)

1.一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒,其特征在于，包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括：用于检测CGG重复数的引物F、R，及用于检测AGG插入信息的检测引物M1、R1和验证引物M2、F1。
3.根据权利要求1、2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测引物和验证引物均包含有搜索探针的第一引物以及位于CGG重复区侧翼相应的退火引物。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测CGG重复数的上游引物F，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-3中的任意一种，下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6中的任意一种，以上引物信息详见表1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列为SEQ ID NO:11-13中的任意一种，下游引物R1的核苷酸序列为SEQ ID NO:17-19中的任意一种，以上引物信息详见表1。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的验证AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列为SEQ ID NO:20-22中的任意一种，下游引物M2的核苷酸序列为SEQ ID NO:14-16中的任意一种，以上引物信息详见表1。
7.根据权利要求1、2所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物M1、M2在其5’端包含一段与人类基因组无关的序列S，其中序列S的核苷酸序列为SEQ ID NO:7-10中的任意一种，以上引物信息详见表1。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶套装为任意商业化PCR试剂盒。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增添加剂在另一专利中进行详述。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒中的校正Marker具有用于检测设备的校正的用途，检测设备校正曲线的R2应大于0.995。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的检测设备，可以有效分离核苷酸样品，其中结果的表现形式为琼脂糖凝胶电泳图及微流体毛细管电泳分离曲线。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的检测设备为安捷伦2100生物分析仪、HPLC、ABI3730、BECKMAN MDQ系列及其他具有同等性能的分离分析设备，优选安捷伦2100生物分析仪。
13.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测方法提供一种分析致病基因FMR-1的数学模型。
14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述检测结果是通过建立数学模型来确定CGG重复数以及AGG插入信息。
15.如权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒应用于不限于脆性X染色体综合征临床诊断，还可以应用于其他三联、四联核苷酸高度重复引起的遗传疾病临床诊断。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107523621A (zh) * 2017-09-04 2017-12-29 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种用于检测脆性x综合征的引物组及其试剂盒
CN108300776A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 金赟懿 脆性x综合征快速筛查试剂盒
CN110923305A (zh) * 2019-11-25 2020-03-27 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准
CN112522384A (zh) * 2020-12-10 2021-03-19 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种用于测定fmr1基因cgg重复序列中agg插入数量和位置的试剂盒及其使用方法
CN113748207A (zh) * 2019-02-26 2021-12-03 诺格拉制药有限公司 脆性x智力低下蛋白干扰寡核苷酸及其使用方法
WO2024001404A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 北京贝瑞和康生物技术有限公司 检测脆性x综合征突变的方法和试剂盒
CN117683876A (zh) * 2023-12-15 2024-03-12 杭州金诺医学检验实验室有限公司 基于多重荧光TP-PCR和毛细管电泳技术检测SCAs9亚型的引物组、方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102869791A (zh) * 2010-04-30 2013-01-09 诺华有限公司 用于脆性x染色体综合征(fxs)治疗的预测标记
WO2014015273A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Asuragen, Inc. Comprehensive fmr1 genotyping

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102869791A (zh) * 2010-04-30 2013-01-09 诺华有限公司 用于脆性x染色体综合征(fxs)治疗的预测标记
WO2014015273A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Asuragen, Inc. Comprehensive fmr1 genotyping

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUA-HSIEN CHIU,ET AL: "The AGG interruption pattern within the CGG repeat of the FMR1 gene among Taiwanese population", 《JOURNAL OF GENETICS》, vol. 87, no. 3, 31 December 2008 (2008-12-31), XP002592255 *
KARL ADLER,ET AL: "A Novel Assay for Evaluating Fragile X Locus Repeats", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》, vol. 13, no. 6, 30 November 2011 (2011-11-30), pages 614 - 620, XP055046596, DOI: doi:10.1016/j.jmoldx.2011.06.002 *
景建洲等: "利用Agilent 2100 Bioanalyzer 检测食源致病性沙门氏菌", 《西北农业学报》, vol. 18, no. 3, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 296 - 299 *
李常贵等: "应用复合增强剂扩增人巨细胞病毒pp65全基因", 《中国生物工程杂志》, vol. 24, no. 1, 31 January 2004 (2004-01-31), pages 42 - 44 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300776A (zh) * 2017-01-13 2018-07-20 金赟懿 脆性x综合征快速筛查试剂盒
CN107523621A (zh) * 2017-09-04 2017-12-29 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种用于检测脆性x综合征的引物组及其试剂盒
CN113748207A (zh) * 2019-02-26 2021-12-03 诺格拉制药有限公司 脆性x智力低下蛋白干扰寡核苷酸及其使用方法
CN110923305A (zh) * 2019-11-25 2020-03-27 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准
CN110923305B (zh) * 2019-11-25 2023-12-29 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准
CN112522384A (zh) * 2020-12-10 2021-03-19 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种用于测定fmr1基因cgg重复序列中agg插入数量和位置的试剂盒及其使用方法
WO2024001404A1 (zh) * 2022-06-27 2024-01-04 北京贝瑞和康生物技术有限公司 检测脆性x综合征突变的方法和试剂盒
CN117683876A (zh) * 2023-12-15 2024-03-12 杭州金诺医学检验实验室有限公司 基于多重荧光TP-PCR和毛细管电泳技术检测SCAs9亚型的引物组、方法及其应用

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