CN105316429A

CN105316429A - 检测牛腺病毒的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105316429A
Application number: CN201510666824.7A
Authority: CN
Inventors: 王洁如; 胡雅灵; 李晶; 宋俐霏; 张星星
Original assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明提供了检测牛腺病毒试剂盒及其应用，属于PCR检测技术领域。本发明首先通过对牛腺病毒基因组序列的比对，确定了在牛腺病毒各个血清型均保守的区域，并以该保守区为靶序列设计了用于检测牛腺病毒多有血清型的引物对和探针，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1，SEQ？ID？NO.2，SEQ？ID？NO.3所示，本发明还提供了对牛腺病毒进行实时荧光定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能够对各个血清型的牛腺病毒进行定量检测，且成本低廉，既可用于临床检测也可用于生物制品的质量控制，具有良好的经济价值和应用前景。

Description

检测牛腺病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测各血清型牛腺病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行牛腺病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

牛腺病毒(Bovineadenovirus,BAV)属腺病毒科哺乳动物腺病毒属，为双链DNA病毒，可导致牛犊的呼吸道、消化道感染。BAV的感染较为普遍，许多国家从病牛及外表健康的犊牛的分泌物及粪便中分离发现，BAV不仅感染牛，还能使羊和鹿发病。BAV分为两个群，9个血清型，其中血清3型的感染较为普遍，研究最多。牛血清是生物制品行业不可缺少的原材料，外源因子的污染严重影响生物制品的质量，因此，对生物制品中牛病毒的检测非常重要，其中包括对牛腺病毒的检测。

目前生物制品行业各生产厂家普遍采用细胞培养法，血吸附法，免疫荧光法进行检测，但这些方法存在敏感度低，检测周期长，检测精度低，结果判定易受多种因素影响，客观性不足，劳动量大等问题；常规PCR检测法虽然敏感性、稳定性、特异性较好，但容易污染，造成假阳性结果；已有的荧光定量PCR法虽然克服了上述方法的缺陷，但是仅能检测牛腺病毒3型，具有检测的局限性，并且仅能够进行牛腺病毒的定性检测，无法定量，检测特异性、灵敏度、检测范围等参数均未经验证。因此迫切需要一种能够同时检测各血清型的牛腺病毒的方法，以降低生物制品企业的生产成本，提高企业经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测各血清型牛腺病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法以及检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明通过对NCBI数据库已报道的牛腺病毒基因序列比对，搜索到牛腺病毒3型全基因序列，序列号为AF030154.1，GI:2935210，使用NCBI在线BLAST中的conserveddomains分析功能，基因组606-1348bp为保守区基因序列E1A，该序列在牛腺病毒所有血清型中高度保守，找到了牛腺病毒各血清型特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该靶序列是检测各血清型牛腺病毒的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测牛腺病毒的遗传标记物。该基因组保守区的遗传标志物在牛腺病毒各个血清型中高度同源，本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。本发明引物和探针不但适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8个血清型牛腺病毒的检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的特异性引物对的序列为：

上游引物序列为：5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'

下游引物序列为：5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'

荧光探针序列为：

(FAM)5’-CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3’(TAMRA)。

本发明提供了在制备检测牛腺病毒试剂盒中的应用。

进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。

含有上述特异性引物对的试剂盒，可通过普通PCR方法实现对各血清型牛腺病毒的特异、快速检测，当扩增的目的条带为120bp左右时(如图1所示)，将PCR扩增产物进行基因测序，并将测序结果与该保守区基因序列(SEQIDNO.4)进行同源性比对，若与该保守区基因序列一致(如图2所示)，则说明待测样品含有牛腺病毒。

含有上述特异性引物对的试剂盒，可通过SYBRGreen法荧光定量PCR实现对各血清型牛腺病毒的特异、快速检测。

在本发明的一个实施例中，SYBRGreen法荧光定量PCR检测牛腺病毒的50μl反应体系为：反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合物，25μl；10μM上、下游引物，各2μl；ROXDyeⅡ，1μl；RnasefreeddH₂O，14μl，病毒基因组模板：4μl。然后采用AB7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置SYBRGreen荧光信号采集条件，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)，40个循环；熔解曲线分析，95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec(收集荧光信号)。根据标准品扩增结果建立定量检测标准曲线。阳性组扩增曲线的CT值应小于30，熔解曲线峰形单一，且熔解曲线峰值高于80℃，证明引物特异性较好，无非特异性扩增；阴性对照组和空白对照组扩增曲线CT值均大于30，熔解曲线出现双峰且峰值低于80℃，则为阴性扩增。

进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒。

含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒可通过Taqman法荧光定量PCR实现对各血清型牛腺病毒的特异、快速检测。

具体地，该试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，对待测样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量PCR，检测待测样本中的牛腺病毒。

在本发明的另一个实施例中，Taqman法荧光定量PCR检测牛腺病毒的50μl反应体系为：反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合物，25μl；10μM上、下游引物，各1μl；10uM荧光探针，2μl；ROXDyeⅡ，1μl；RnasefreeddH₂O，14μl；病毒基因组模板，4μl。然后采用AB7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置5’端FAM荧光信号采集，3’端TAMRA荧光信号采集，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)，40个循环，建立定量检测标准曲线，根据样品扩增曲线判定结果。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于40的标本为阳性结果；

Ct值大于40或无CT值的标本为阴性结果；

Ct值在35-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40或无CT值判定为阴性扩增。

本发明提供了上述两种试剂盒在生物制品质量检测中的应用。

本发明提供了一种检测生物制品中牛腺病毒的方法，对待测生物制品样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行Taqman荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的牛腺病毒；

或对待测生物制品样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对进行SYBRGreen荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的牛腺病毒。

本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为无菌水，所述阳性模板为牛腺病毒基因组DNA。

本发明对基于上述两种荧光定量PCR方法的试剂盒的检测灵敏度进行了研究：实验发现采用本发明的特异性引物对和/或探针运用Taqman荧光定量PCR和SYBRGreen荧光定量PCR检测牛腺病毒，检测范围为10²-10⁸拷贝/μl，灵敏度均能达到10²拷贝/μl。

现有技术中采用SYBRGreen法荧光定量PCR检测牛腺病毒的特异性较差，检测时常有非特异性扩增，由引物二聚体、引物发卡结构等造成，容易造成假阳性，无法保证检测的准确性。本发明所设计引物经普通PCR检测，无引物二聚体等结构。进行SYBRGreen法荧光定量PCR、Taqman法荧光定量PCR检测应均无非特异性扩增，证明本发明的引物和探针具有很好的特异性。此外采用本发明的引物和探针检测其他几种牛病毒和无菌水，均无检出目的信号，证明本发明的引物和探针具有基因模板特异性、牛腺病毒检测的特异性。

本发明根据牛腺病毒基因组保守区序列设计通用引物和探针，该基因组保守区在牛腺病毒各个血清型中高度同源，因此本发明引物和探针可以检测牛腺病毒所有血清型；且通过牛腺病毒基因组制备标准品，建立标准曲线，可以进行牛腺病毒基因组的定量检测，检测范围、灵敏度、特异性、专属性均经过验证；本发明设计的引物进行SYBRGreen法荧光定量PCR，极大的缩减了检测成本，同时也能保证较好的特异性和灵敏度；本发明设计的引物和探针的组合也可进行Taqman法荧光定量PCR，均可以达到同样的检测效果，克服了现有方法的缺陷，不但适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8个血清型牛腺病毒的检测，极大地降低了检测成本，提高了检测效率。

基于本发明的技术方案，本发明至少取得以下优异效果：

(1)广谱性：与其他荧光定量PCR检测方法相比，克服了同类技术只能检测牛腺病毒3型的局限性，本发明可以对牛腺病毒所有血清型进行检测，极大的提高了该技术的检测效率和使用范围。

(2)特异性：采用本发明设计的引物(或引物和探针组合)分别进行普通PCR，SYBRGreen法荧光定量PCR、Taqman法荧光定量PCR检测牛腺病毒，均无非特异性扩增。说明本发明设计的引物具有较好的特异性，可以应用于不同的PCR检测方法中，并且可以达到相同的检测效果。采用本发明设计的引物扩增其他病毒：牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腹泻病毒、呼肠孤病毒时，均无非特异性扩增，说明本发明设计的引物具有非常好的病毒检测特异性。

(3)灵敏度更高、检测范围更广：本发明对灵敏度和检测范围进行了验证，牛腺病毒基因组的检测范围能够达到10⁸-10²拷贝/μl，10²拷贝/μl的病毒模板即可检测出。

(4)定量检测：相比同类技术仅可进行牛腺病毒的定性检测，本发明通过牛腺病毒基因组标准品构建标准曲线，R²能够达到0.999，可以进行牛腺病毒基因拷贝数的定量检测，检测结果精确。

(5)节省成本：现有荧光定量PCR检测牛腺病毒，为了增强特异性，通常采用Taqman法荧光定量PCR，但设计探针的费用昂贵。本发明设计的引物可以进行SYBRGreen法荧光定量PCR，不需要荧光探针，省去了设计探针的高昂费用，更为经济节约，且能够达到与Taqman法荧光定量PCR相同的检测效果。如有需要，采用本发明的引物和探针组合，也可进行Taqman法荧光定量PCR，使用者可以根据自身经济情况进行自主选择合适的方法。

附图说明

图1为采用本发明的引物对的普通PCR检测牛腺病毒电泳结果图。其中，泳道1为DNAMarker，泳道2为模板为牛腺病毒基因组的PCR检测结果，泳道3-5分别为模板为牛细小病毒、牛副流感病毒、无菌水的PCR检测结果。

图2为采用本发明的引物对的普通PCR检测牛腺病毒后阳性结果的测序结果图。

图3为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法的标准品不同浓度的扩增曲线。其中，1、2、3、4、5、6、7分别为浓度10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝/ul标准品扩增曲线。

图4为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法的标准曲线图。

图5A和5B为本发明SYBRGreen法荧光定量PCR方法引物特异性验证的扩增曲线图，图5C和5D分别为5A和5B对应的熔解曲线图。图5A中，1为牛腺病毒扩增曲线，2、3分别为牛细小病毒、牛副流感病毒扩增曲线。图5B中，1为牛腺病毒扩增曲线，4为水的扩增曲线。5C中，1为牛腺病毒熔解曲线，2、3分别为牛细小病毒、牛副流感病毒熔解曲线。图5D中，1为牛腺病毒熔解曲线，4为水的熔解曲线。

图6为本发明Taqman荧光定量PCR方法的标准品不同浓度的扩增曲线。其中，1、2、3、4、5、6、7分别为浓度10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝/μl标准品扩增曲线。

图7为本发明Taqman荧光定量PCR方法的标准曲线图。

图8为本发明Taqman荧光定量PCR方法的扩增曲线图。其中，1为牛腺病毒扩增曲线，2、3、4分别为牛细小病毒、牛副流感病毒、水的扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例采用AllprepDNA/RNAMiniKit(QIAGEN)提取牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腹泻病毒、呼肠孤病毒的基因组，提取方法采用试剂盒推荐步骤。

实施例1牛腺病毒保守序列的选择与特异性引物的设计

通过对NCBI数据库已报道的牛腺病毒基因序列比对，搜索到牛腺病毒3型全基因序列，序列号为AF030154.1，GI:2935210，使用NCBI在线BLAST中的conserveddomains分析功能，基因组606-1348bp为保守区基因序列E1A，该序列在牛腺病毒所有血清型中高度保守，找到了牛腺病毒各血清型特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该靶序列是检测各血清型牛腺病毒的遗传标记物。该基因组保守区的遗传标志物在牛腺病毒各个血清型中高度同源，本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。本发明引物和探针不但适用于3型牛腺病毒的检测，还适用目前已知的其他8个血清型牛腺病毒的检测。

本发明的引物设计遵循以下原则：避免引物自身或之间形成4个以上连续配对，无环状发卡结构；18-24bp长；Tm值55-65℃，GC含量在40％-60％之间，两个引物Tm值相差不超过2℃；3’端不出现A，且不出现三个或三个以上连续相同碱基；引物后5个核苷酸不能有超过2个G和C；扩增片段长度在50-150bp最佳。

本发明探针设计遵循以下原则：尽量靠近上游引物；长度20-30bp；检测折叠和二级结构；Tm值65-70℃，GC含量40％-70％，5’端无G，C含量高于G；

本发明通过筛选获得的用于扩增牛腺病毒各血清型特异性的保守靶序列的特异性引物对的序列为：

上游引物序列为：5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'(SEQIDNO.1)

下游引物序列为：5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'(SEQIDNO.2)

特异性探针序列为：

5’-CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3’。(SEQIDNO.3)，标记探针的荧光标记为5’端FAM，3’端TAMRA。

实施例2采用本发明的特异性引物对进行牛腺病毒的普通PCR检测

采用病毒基因组提取试剂盒进行牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒基因组的提取，提取方法参照试剂盒推荐步骤。以实施例1的特异性引物对为上下游引物，对上述样品的基因组进行PCR扩增。

首先配制PCR反应体系：反转录后病毒基因组模板1.5μl，上下游引物各1μl，双蒸水9μl，TaqMix酶混合物(强欣博瑞EP0301)12.5μl，共25μl。然后采用Bio-RadMyCyclerPCR仪进行PCR反应，反应程序设置：94℃：2min，1个循环；94℃：30sec，60℃：30sec，30个循环；4℃保存。最后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳结果如图1所示。由结果可知，仅牛腺病毒有扩增，且扩增条带清晰且单一，其他牛病毒均无扩增，说明引物特异性好。

将PCR产物进行测序，将测序结果与目的序列进行Blast比对，基因同源性为100％，比对结果如图2所示。证明扩增产物即为目的序列，本发明实施例1的特异性引物对具有较好的特异性。

实施例3SYBRGreen法荧光定量PCR检测牛腺病毒

1、基因组标准品的制备：

提取牛腺病毒总DNA，采用分光光度计测定OD₂₆₀，牛腺病毒为双链DNA，将核酸浓度换算为核酸拷贝数，推算公式如下：1A₂₆₀吸光光度值＝dsDNA50ug/m，核酸浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×50，拷贝数计算公式＝6.02×10²³(拷贝数/mol)×浓度(g/ul)/平均分子量(g/mol)。根据核酸浓度换算为核酸拷贝数为5.5×10⁸拷贝/μl，将病毒基因组进行连续10倍梯度稀释，稀释浓度分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²拷贝/μl，-20℃保存备用。

2、SYBRGreen法荧光定量PCR：

以牛腺病毒基因组为模板作为阳性实验组，以牛细小病毒、牛副流感病毒基因组为模板作为阴性对照组，以水代替模板作为空白对照组。采用实施例1的特异性引物对和本发明试剂盒所带试剂进行检测。首先配制反应体系：每个样品检测体系为50μl，其中反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合物，25μl；10uM上游引物，2μl；10uM下游引物，2μl；ROXDyeⅡ，1μl；RnasefreeddH₂O，14μl，各病毒基因组：4μl。然后采用AB7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置SYBRGreen荧光信号采集条件，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)，40个循环；熔解曲线分析，95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec(收集荧光信号)。

3、建立定量检测标准曲线：

由结果可知，标准品不同浓度的扩增曲线之间平行性和间隔较好(如图3所示)，以起始模板对数为横坐标，每个浓度模板的扩增曲线CT值为纵坐标制作标准曲线(如图4所示)。模板7个稀释度的CT值呈良好的线性关系，R²＝0.999，检测范围为10⁸-10²拷贝/μl，灵敏度最高能达到10²拷贝/μl。

4、特异性验证结果：

经扩增曲线(如图5A和图5B所示)和熔解曲线(如图5C和5D所示)结果可知，牛腺病毒基因组检测CT值为12.712，熔解曲线峰值为81.5℃，为阳性扩增，且熔解曲线峰形单一，证明无非特异性扩增。牛细小病毒、牛副流感病毒、水的扩增曲线CT值均大于30，熔解曲线峰值在75℃左右，均为阴性扩增。结果证明本发明的引物有较好的模板特异性。

实施例4Taqman法荧光定量PCR检测牛腺病毒

1、特异性引物和探针设计：

采用实施例1中设计的特异性引物对和荧光探针对牛腺病毒实现定量检测，引物和探针均由华大基因合成。

2、基因组标准品制备参见实施例3。

3、Taqman法荧光定量PCR

以牛腺病毒基因组为模板作为阳性实验组，以牛细小病毒、牛副流感病毒基因组为模板作为阴性对照组，以水代替模板作为空白对照组。采用本发明实施例1的引物、探针和本发明试剂盒所带试剂进行检测。首先配制反应体系：每个样品的PCR反应体系为50μl，其中反转录酶，2μl；扩增酶和底物混合物，25ul；10uM上游引物，1μl；10μM下游引物，1μl；10μM荧光探针，2μl；ROXDyeⅡ，1μl；RnasefreeddH₂O，14μl；各病毒基因组模板，4μl。然后采用AB7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，设置5’端FAM荧光信号采集，3’端TAMRA荧光信号采集，循环程序：42℃反转录5min，95℃预变性10sec，1个循环；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec(收集荧光信号)，40个循环后反应结束。

3、建立定量检测标准曲线：

不同浓度模板扩增曲线之间平行性和间隔较好(如图6所示)，以起始模板对数为横坐标，每个浓度模板扩增曲线CT值为纵坐标制作标准曲线(如图7所示)。模板7个稀释度的CT值呈良好的线性关系，R²＝0.999，检测范围为10⁸-10²拷贝/μl，灵敏度最高能达到10²拷贝/μl。

4、特异性验证结果：

经扩增曲线(如图8所示)结果可知，阴性对照组和空白对照组无扩增曲线，说明其他病毒扩增结果均为阴性，阳性组扩增曲线CT值22，为阳性扩增。由此可见，本发明的引物和探针均有较好的模板特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于检测牛腺病毒的遗传标记物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或其特异性片段。

2.权利要求1所述的遗传标记物在制备检测各血清型牛腺病毒试剂盒中的应用。

3.用于检测牛腺病毒的特异性引物对，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。

4.与权利要求3所述特异性引物对配合使用的荧光探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

5.权利要求3所述的特异性引物对和/或权利要求4所述的荧光探针在制备检测牛腺病毒试剂盒中的应用。

6.含有权利要求3所述的特异性引物对的试剂盒。

7.含有权利要求3所述的特异性引物对和权利要求4所述的荧光探针的试剂盒。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，对待测样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量PCR，检测待测样本中的牛腺病毒。

9.权利要求6-8任一所述的试剂盒在生物制品质量检测中的应用。

10.一种检测生物制品中牛腺病毒的方法，其特征在于，对待测生物制品样本提取基因组DNA后以其为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的牛腺病毒；