CN103103287B - 基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量rt-pcr检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR（real-time RT-PCR，rRT-PCR）检测试剂,包括对丙型流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和针对丙型流感病毒NS基因相对保守区的4套特异性引物对及探针序列，同时公开了待检测样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析，能快速通过rRT-PCR法检测丙型流感病毒，且在丙型流感病毒变异较小的情况下，4套引物及探针检测均为阳性，如果丙型流感病毒发生较大变异，可能仅出现1套～3套引物及探针阳性，可以有效的为临床诊断、检验检疫等领域的预警机制提供可行的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种rRT-PCR检测技术，具体涉及一种基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
流感病毒基因组由8条（甲、乙型）或者7条（丙型）负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同分为甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒广泛分布于自然界，偶能引起局部地区和学校暴发。
丙型流感病毒普遍感染健康人群，婴儿出生时由母体带来的抗体，在6个月时基本消失。从1岁起，个体血清阳性百分比逐渐增加，大约在20～30岁达到最高水平。根据日本调查，所有10岁儿童基本上都有丙型流感病毒抗体。
丙型流感病毒跟A型流感病毒一样，能引起婴儿和老人流涕、发烧（腋下体温≥38℃），出现感冒症状。中国曾于1981年和1982年由郭元吉教授在猪群中分离到2株丙型流感病毒，但中国到目前为止人群中没有丙型流感病毒的监测数据。日本对丙型病毒的监测比较完善，通过RT-PCR检测，人群感染丙型流感病毒的阳性率高达2.5％，可见丙型流感病毒的感染率并不比甲型和乙型的阳性率低。
丙型流感病毒可以通过鸡胚或者细胞分离，但分离率比较低，灵敏度不高。已有的普通RT-PCR检测技术容易引起环境污染，检测灵敏度低，易导致假阳性结果，不适于临床标本的快速检测和鉴定。另外鉴定病毒还可以通过基因测序的方法，但耗时长，成本高，普通实验室难于完成。因此，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测丙型流感病毒及其变异株。
上述现有技术至少存在以下缺点：
（1）操作费时、成本高；
（2）对实验室的软硬件要求也比较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、应用方便的基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂克服现有技术中常规基因测序的方法，耗时长，成本高且对实验室软硬件要求高的缺陷。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，
所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种；
所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区；
所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18～27bp的寡核苷酸片段；
其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。
本发明的有益效果是：本发明基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，由于包括针对流感病毒HE基因相对保守区域；针对丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区所述丙型流感病毒NS基因和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测丙型流感病毒，操作简单、应用方便。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针为：
正向引物（SEQ ID NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，
反向引物（SEQ ID NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，
探针（SEQ ID NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；
所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为：
正向引物（SEQ ID NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，
反向引物（SEQ ID NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，
探针（SEQ ID NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为：
正向引物（SEQ ID NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，
反向引物（SEQ ID NO.8）：5'-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3'，
探针（SEQ ID NO.9）：5'-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针为：
正向引物（SEQ ID NO.10）：5'-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3'，
反向引物（SEQ ID NO.11）：5'-CTCCACGATGATGATACA-3'，
探针（SEQ ID NO.12）：5'-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3'。
采用本发明进一步的有益效果是：采用上述的四套引物对和探针，在丙型流感病毒变异较小的情况下，4套引物及探针检测均为阳性，如果丙型流感病毒发生较大变异，可能仅出现1套～3套引物及探针阳性，显著提高检测率。
本发明提供还提供基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括检测溶液，所述检测溶液包括权利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。
本发明提供还提供基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；
（2）反应体系：总体积25ul,取5ul步骤（1）制得的病毒RNA溶液，12.5ul2×RT-PCR Buffer,1ul25×RT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为20uM，RNase Free H2O加至25ul；
（3）步骤（2）反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测：
45℃/10min，1个循环，95℃/10min,1个循环，95°/15s,60°/45s，40个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果，根据扩增曲线和Ct判定结果。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的丙型流感病毒rRT-PCR（real-time RT-PCR）检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，
包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种；
所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区；
所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18～27bp的寡核苷酸片段；
其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。
所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
正向引物（SEQ ID NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，
反向引物（SEQ ID NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，
探针（SEQ ID NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；
所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
正向引物（SEQ ID NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，
反向引物（SEQ ID NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，
探针（SEQ ID NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
正向引物（SEQ ID NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，
反向引物（SEQ ID NO.8）：5'-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3'，
探针（SEQ ID NO.9）：5'-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针包括以下二条引物序列和一条探针序列：
正向引物（SEQ ID NO.10）：5'-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3'，
反向引物（SEQ ID NO.11）：5'-CTCCACGATGATGATACA-3'，
探针（SEQ ID NO.12）：5'-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3'。
上述探针序列两端的标记FAM、BHQ1为荧光素标记。
本发明应用上述的丙型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测丙型流感病毒的试剂盒，包括检测溶液，所述检测溶液所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。
本发明应用上述的丙型流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测丙型流感病毒的方法：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；
再建立r-RT-PCR反应体系：总体积25ul,取5ul步骤（1）制得的病毒
RNA溶液，12.5ul2×RT-PCR Buffer,1ul25×RT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为20uM，RNaseFree H2O加至25ul；
再将步骤（2）反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测：
45℃/10min，1个循环，95℃/10min,1个循环，95°/15s,60°/45s，40个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果，根据扩增曲线和Ct判定结果。
本发明中的引物和探针的序列（5'→3'）及检测的靶序列片段如下：
本发明具体实施例包括了寡核苷酸引物的设计、待检样本的处理、检测和分析。下列实施例详细说明流感病毒rRT-PCR检测引物及检测方法。
一、丙型流感病毒rRT-PCR寡核苷酸引物的设计与合成
从GenBank流感数据库（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genomes/ FLU/FLU. html）中下载丙型流感病毒HE、NP、MP和NS所有序列，使用MEGA5.1进行比对，构建进化树，查找与C/pig/Beijing/115/81毒株进化距离最近，分离时间最晚的病毒作为模板设计引物。选择相对保守区设计引物和探针；引物和探针设计中同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。
将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①探针长度L在18～27bp之间；②Tm值在42～59℃之间；③GC%在25～75%之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90%；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4。最佳Tm值设定在59℃，最佳探针长度为18-25bp。
二、本发明检测未知病毒的应用举例
1.病毒RNA的提取：
取病毒采样液200μL，加入500μL裂解液，按RNeasy Mini Kit（Qiagen公司，catalog#74104）说明书提取病毒RNA50μL。
2.rRT-PCR反应
1)体系配置：使用Ag Path-IDTM One-step RT-PCR kit（#4387424）反应液如表1所示。
表1：rRT-PCR反应体系
2)rRT-PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT-PCR，反应程序如表2所示。
表2：反应程序条件
3.结果判断：
阴阳对照结果成立的情况下判断结果，要求阴性对照没有Ct值或者为0，阳性参照有Ct值20～30之间。一般情况下Ct小于38的可以判断为阳性。
本发明提供了针对丙型流感病毒HE基因、丙型流感病毒NP基因、丙型流感病毒MP基因及丙型流感病毒NS基因设计特异性寡核苷酸引物及探针序列，在丙型流感病毒变异较小的情况下，4套引物及探针检测均为阳性，如果丙型流感病毒发生较大变异，可能仅出现1套～3套引物及探针阳性。
本发明基于丙型病毒多基因的检测方法确保能够检测到发生较大变异的丙型流感病毒。本发明并提供了rRT-PCR的检测体系及其在丙型流感病毒快速检测试剂盒中的应用。
检测评价：
特异性评价：选取国内近三年流行季节性流感病毒H1N1亚型,H3N2亚型，乙型流感，腺病毒，副流感病毒共90株进行检测，四对引物检测均为阴性。对丙型流感病毒基因进行检测，为阳性。
灵敏性评价：用C/Yamagata/15/2004病毒HE序列合成的模板进行灵敏性实验，1号引物灵敏性达到100拷贝/μL；用C/Yamagata/2/2010病毒NP序列合成的模板进行灵敏性实验，4号引物灵敏性达到1拷贝/μL；用C/Miyagi/5/2000病毒MP序列合成的模板进行灵敏性实验，8号引物灵敏性达到100拷贝/μL；用C/Hiroshima/251/2000病毒NS序列合成的模板进行灵敏性实验，9号引物灵敏性达到1拷贝/μL。
本发明可以将rRT-PCR技术应用于丙型流感病毒的甄别。为丙型流感病毒的实验室诊断提供了快速有效的检测技术，为丙型流感病毒的早发现、早预防和早治疗以及公共卫生策略的制定提供技术手段和检测依据。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，其特征在于，
所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针；
其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致；
所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针为：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，
探针(SEQ ID NO.3)：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；
所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为：
正向引物(SEQ ID NO.4)：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，
反向引物(SEQ ID NO.5)：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，
探针(SEQ ID NO.6)：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为：
正向引物(SEQ ID NO.7)：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，
反向引物(SEQ ID NO.8)：5'-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3'，
探针(SEQ ID NO.9)：5'-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3'；
丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针为：
正向引物(SEQ ID NO.10)：5'-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3'，
反向引物(SEQ ID NO.11)：5'-CTCCACGATGATGATACA-3'，
探针(SEQ ID NO.12)：5'-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3'。
2.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于，所述检测溶液包括权利要求1所述基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针。
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