CN108179224A

CN108179224A - B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法

Info

Publication number: CN108179224A
Application number: CN201810086232.1A
Authority: CN
Inventors: 朱兆奎; 李晓丹; 赵百慧
Original assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2018-06-19

Abstract

本发明公开了一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法；该方法针对B型流感病毒HA基因基因保守区域设计了一组引物及两条探针SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示，两条探针选择不同的荧光标记，实现了一管反应体系中同时对两种型别的B型流感病毒进行鉴定，简化了疑似B型流感病毒感染病例的确诊流程。同时公开了待检样本的处理、荧光RT‑PCR反应体系及反应条件。本发明可以实现对我国大陆流行的B型流感病毒两种型鉴定，操作简单、应用方便，为呼吸道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。

Description

B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。

背景技术

流感是以一种由A型、B型或C型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，呈季节性流行或局部暴发特征。流感病毒属于正粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组分节段。其中A型流感病毒常引起世界范围内的流感大流行，而B型则是季节型流行趋势。与A型流感不同，人类是B型流感病毒的唯一宿主，B型流感病毒不分HA和NA亚型，而是划分为抗原不同的两个分支，即Victoria系和Yamagata系。

每年B型流感病毒一个或两个分支，与季节性H1N1或季节性H3N2亚型流感病毒共流行，每年全球大概由8％的人感染流感病毒，约2％的人是由B型流感病毒感染引起的，发病率仅次于季节性H3N2亚型流感病毒。有研究报道结果显示，流感病毒感染引起的死亡中有29％是由B型流感病毒导致的。

由于Real-time RT-PCR(rRT-PCR)的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。通过rRT-PCR方法对流感病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于呼吸道病原监测以及临床流行病学研究。应用rRT-PCR方法对病毒核酸进行检测时，其难点之一在于在病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的流感病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物和探针序列进行更新。其二在于对不同的亚型或亚系进行鉴定的探针使用相同的荧光标记，同一检测反应体系中只能对一种亚型或亚系的流感病毒进行分型鉴定，如果需要对多个亚型或亚系进行分型鉴定，则需要更多的标本量，反应体系的配置和鉴定结果报告时间相应的增加。本发明选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，能够快速特异性地检测B型流感病毒，同时选用两种不同的荧光标记探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，实现单次检测即可对两种亚系的B型流感病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提出一种操作简单、应用方便的B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种rRT-PCR引物和探针组合，所述引物和探针包括长度为22～27bp的用于扩增B型流感病毒Victoria系和Yamagta系HA基因的寡核苷酸片段。

优选的，所述rRT-PCR引物和探针组合包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ IDNo.4所示的探针。

优选的，针对B型流感病毒Victoria系的探针两端的标记为FAM、BHQ1荧光素标记；针对B型流感病毒Yamagata系的探针两端的标记为HEX、BHQ1荧光素标记。具体如下：

第一组引物和探针包括：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		FluB-HA-F188(SEQ ID No.1)	AGACCAGAGGGAAACTATGCCC
FluB-HA-R270(SEQ ID No.2)	TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT
		FluB-HA-P-victoria(SEQ ID No.3)	CAGACCAAAATGCACGGGGAAHATACC

探针(SEQ ID No.3)两端分别为FAM和BHQ1标记。

第二组引物和探针包括：

引物名称	引物序列(5’-3’)
		FluB-HA-F188(SEQ ID No.1)	AGACCAGAGGGAAACTATGCCC
FluB-HA-R270(SEQ ID No.2)	TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT
		FluB-HA-P-yamagata(SEQ ID No.4)	CAGRCCAATGTGTGTGGGGAYCACACC

探针(SEQ ID No.4)两端分别为HEX和BHQ1标记。

第二方面，本发明涉及一种B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的rRT-PCR引物和探针组合。

优选的，所述试剂盒用于：鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系。

第三方面，本发明涉及一种本发明所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，包括：

鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；

或制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为B型流感病毒Victoria系或Yamagata系的试剂盒；

或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系；

或制备用于鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系的试剂盒。

第四方面，本发明涉及一种非诊断目的的应用本发明所述的rRT-PCR引物和探针组合进行B型流感病毒分型鉴定的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、利用核酸提取试剂从待测流感病毒样本中提取RNA；

S2、加入所述引物和探针组合进行一步法rRT-PCR核酸扩增反应；

S3、根据Ct值判断是否是B型流感病毒核酸阳性，并根据阳性结果荧光标记的不同判断是Victoria系还是Yamagata系。

优选的，步骤S3中，Ct值小于38的判断为阳性。

优选的，步骤S3中，FAM通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Victoria系；HEX通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Yamagata系。即FAM标记阳性时表示B型流感病毒victoria系阳性，若HEX标记阳性时则表示B型流感病毒yamagata系阳性。

优选的，所述一步法rRT-PCR核酸扩增反应的反应条件为：45℃，10分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃，5秒，60℃，20秒，40个循环。

本发明针对B型流感病毒Victoria系和Yamagata系HA基因保守区域设计了2条引物序列，如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，针对Victoria系和Yamagata系HA基因分别设计了两条Taqman探针，并在采用不同的应该光标记，简化了后续的分型鉴定步骤。同时公开了待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件及结果判定标准。本发明可以实现对我国大陆流行的B型流感病毒的检测及分型鉴定,操作简单、应用方便，为呼吸道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明所述的B型流感病毒rRT-PCR引物位于B型流感病毒两个亚系Victoria系和Yamagata系HA基因的相对保守区域，两个亚系应用相同的引物，而Taqman探针则设计为亚系特异性，即Victoria系和Yamagata系分别应用不同的Taqman探针。同时为了简化检测步骤，减少反应体系配置，两条探针选择不同的荧光标记，因此可在同一管检测反应体系中实现对两种亚系B型流感病毒的分型鉴定。本发明所述的测序方法操作简单，应用方便。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为B型Victoria系流感病毒HA基因质粒10倍梯度稀释，选取10个浓度的模板进行灵敏度和扩增效率检测的检测结果示意图；最低检测限为13copies/μl，扩增效率为91.676％；

图2为B型Yamagata系流感病HA基因质粒10倍梯度稀释，选取10个浓度的模板进行灵敏度和扩增效率检测的检测结果示意图；最低检测限为13copies/μl，扩增效率为97.457％；

图3为B型Victoria系流感病毒HA基因质粒重复检测10孔，计算Ct值的变异系数的结果示意图；CV＝1.3％；

图4为B型Yamagata系流感病毒HA基因质粒重复检测10孔，计算Ct值的变异系数的结果示意图；CV＝1.03％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、B型流感病毒Victoria系和Yamagata系引物和探针的设计与合成

下载GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)中2013至2017年中国地区和GISAID(http://platform.gisaid.org/epi3/frontend)数据库中B型流感病毒的HA基因，软件比对分析不同病毒各个基因序列的一致性，选择相对保守区设计全基因组特异性扩增引物序列。引物设计中允许同一变异位点允许4个及4个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①探针与同链引物位置接近，PCR产物大小在100bp到150bp之间。②引物和探针的GC％在25％到75％之间；③引物长度20bp左右，Tm值在58℃到60℃之间，探针长度20bp到30bp，Tm值比引物高5℃到10℃；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90％；⑦进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4；⑦探针5’端应避免使用碱基G。

得到如下所示的引物和探针序列。

以上所述的2条引物中，其中一条与B型流感病毒HA基因的正向序列互补，另一条与反向序列互补，探针与正向序列互补。

实施例2、检测未知病毒

1.病毒RNA的提取：

取140μL样本(咽拭子，鼻拭子，细胞培养上清液，鸡胚尿囊液，无细胞体液)，加入含有5.6μg Carrier RNA的560μL的AVL裂解液中，按QIAamp Viral RNA MiniHandbook(Qiagen公司，catalog#52904/52906)说明书提取病毒RNA，洗脱体积50μL。

2.rRT-PCR反应

1)体系配置：使用Bioline的SensiFAST^TMProbe No-ROX One-Step Kit(BIO-76001)反应液，配置组分如下表1：

表1

2)rRT-PCR：将加好上述反应体系的反应管放于PCR仪进行rRT-PCR，反应程序如下表2：

表2

4.结果判断：阴阳对照结果成立的情况下判断结果，即阴性参照没有Ct值，而阳性参照有Ct值。一般情况的下Ct值小于38的可以判断为阳性。FAM通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Victoria系，HEX通道阳性的标本可判断分型结果为B型流感病毒Yamagata系。

5.检测评价：

灵敏度评价：将插入B型流感病Victoria系和Yamagata系HA基因的质粒进行10倍梯度稀释，选取10个梯度为模板，进行PCR反应扩增，并重复3次实验，当反应体系中有大于13个质粒的拷贝时，用本发明的两组引物探针对模板进行PCR扩增反应即可得到阳性结果。B型流感病Victoria系引物探针组合检测结果如表3和图1所示，B型流感病Yamagata系引物探针组合检测结果如表4和图2所示。

表3

表4

6.精准度平价：将插入B型流感病Victoria系和Yamagata系HA基因的质粒进行10⁴倍稀释，复检测10孔，计算Ct值的变异系数。检测B型Victoria系流感病毒HA基因引物探针组合的CV＝1.3％,如表5和图3所示；检测B型Yamagata系流感病毒HA基因引物探针组合的CV＝1.03％,如表6和图4所示，均符合CV值低于3％的标准，实验方法重复性好。

表5

表6

7.通用性评价：共选取我国近两年流行B型Victoria系和Yamagata系流感病毒各3株，其它亚型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9各1株，肠道病毒CA6、CA16、EV7各1株进行检测，其中3株B型Victoria系流感病毒FAM通道检测阳性，3株B型Yamagata系流感病毒HEX通道检测阳性，其它样本两个通道检测结果均阴性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海伯杰医疗科技有限公司

<120> B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法

<130> DAG35468

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FluB-HA-F188

<400> 1

agaccagagg gaaactatgc cc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FluB-HA-R270

<400> 2

tccggatgta acaggtctga ctt 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FluB-HA-P-Victoria

<400> 3

cagaccaaaa tgcacgggga ahatacc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FluB-HA-P-Yamagata

<400> 4

cagrccaatg tgtgtgggga ycacacc 27

Claims

1.一种rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.4所示的探针。

2.根据权利要求1所述的rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，针对B型流感病毒Victoria系的探针两端的标记为FAM、BHQ1荧光素标记；针对B型流感病毒Yamagata系的探针两端的标记为HEX、BHQ1荧光素标记。

3.一种B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合。

4.如权利要求3所述的B型流感病毒分型鉴定用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于：

或鉴定待测样本是否感染了B型流感病毒Victoria系或Yamagata系。

5.一种如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，包括：

6.一种应用如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合进行B型流感病毒分型鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、利用核酸提取试剂从待测流感病毒样本中提取RNA；

7.根据权利要求6所述的分型鉴定的方法，其特征在于，步骤S3中，Ct值小于38的判断为阳性。

8.根据权利要求6所述的分型鉴定的方法，其特征在于，步骤S3中，FAM通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Victoria系；HEX通道阳性的可判断分型结果为B型流感病毒Yamagata系。

9.根据权利要求6所述的分型鉴定的方法，其特征在于，所述一步法rRT-PCR核酸扩增反应的反应条件为：45℃，10分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃，5秒，60℃，20秒，40个循环。