CN104789694A - 一种水疱性病检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种可同时用于口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。本发明的用于检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的引物基因序列共10条，试剂盒中除主十条引物外还包括2条通用引物。相关实验表明本发明的敏感性高于普通荧光定量PCR技术，与荧光定量PCR相比可大大的节省时间，可以避免非特异性产物的扩增，同时有效地避免了引物的偏好向现象，提高了检测的灵敏性。

Description

一种水疱性病检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种可用于对多种病原微生物进行检测的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，确切讲本发明涉及一种可同时用于口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测的的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。
背景技术
口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由小RNA病毒科( Picornaviridae) 口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）引起的一种偶蹄动物急性接触性传染病，有O型、A型、C型、SATⅠ型（南非Ⅰ型）、SATⅡ型（南非Ⅱ型）、SATⅢ型（南非Ⅲ型）、Asia 1型（亚洲1型）等7个血清型。猪水疱病(Swine vesicular disease,SVD)是由小RNA病毒科(Picornaviridae) 肠道病毒属( Enterovi rus)猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性接触性传染病。水疱性口炎（Vesicular stomatitis，VS）是由水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）引起的多种哺乳动物的一种急性、高度接触性传染病，以马、牛、猪等动物较易感染，绵羊和山羊也可感染。这三种疾病能引起严重的经济损失并导致世界肉类市场的混乱，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国农业部将其列为一类动物疾病。然而，这三种病毒感染的动物均以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，在临床症状上很难进行区分。快速和可靠的诊断对于这三种疾病的控制和消灭至关重要，而且对肉食品中低含量的病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。现有的RT-PCR、竞争PCR 和ELISA-PCR 方法克服了这些方法的不足，可用于这三种疾病的诊断，但也有费时、易污染和每次检测的样品数量少等缺点。由于快速鉴别诊断结果有利于特定型疫苗的选择和控制疫病蔓延，增强预防措施的有效性和实效性。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的同时用于分型鉴别检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的技术，具体讲是联合使用可用于检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的引物，包括有这种引物的检测试剂盒，及其制备方法和这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。
本发明的用于检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的引物基因序列共10条，分别为：
SEQ ID No.1，可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC，在本发明中被命名为FMDV-A-F；
SEQ ID No.2，可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的下游引物GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT，在本发明中被命名为FMDV-A-R；
SEQ ID No.3，可特异性扩增口蹄疫O型病毒核酸的上游引物： AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT，在本发明中被命名为FMDV-O-F；
SEQ ID No.4，可特异性扩增口蹄疫O型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG，在本发明中被命名为FMDV-O-R；
SEQ ID No.5，可特异性扩增口蹄疫Asia 1型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC；在本发明中被命名为FMDV-Asia 1-F；
SEQ ID No.6，可特异性扩增口蹄疫Asia 1型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC，在本发明中被命名为FMDV-Asia 1-R。
SEQ ID No.7，可特异性扩增水疱性口炎病毒病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA，在本发明中被命名为VSV-F；
SEQ ID No.8，可特异性扩增水疱性口炎病毒病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTT AGGGATCTGG，在本发明中被命名为VSV-R。
SEQ ID No.9，可特异性检测猪水泡病病毒的核酸的上游序列为：AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG，在本发明中被命名为SVDV-F；SEQ ID No.10，可特异性扩增猪水泡病病毒核酸的下游引物GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC，在本发明中被命名为SVDV-R。
除以上引物外，本发明还公开两条通用引物：SEQ ID No.11，通用上游引物：AGGTGACACTATAGAATA，在本发明中被命名为UWD-F；和SEQ ID No.12，通用下游引物：GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R。
本发明的口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的检测试剂盒中包括有前述的12条可用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8 、ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，其中SEQ ID No.11的5’端添加有Cy5荧光标签。
本发明的试剂盒非疾病诊断的使用方法是以被检样品的RNA为模板，用引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6 、SEQ ID No.7、SEQ ID No. 8 、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No. 12进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中241bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒A型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒Asia 1型型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中287bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒O型阴阳性。根据毛细管电泳信号分析图中268bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的水疱性口炎病毒阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中196bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的猪水泡病病毒阴阳性。
根据相关实验，本发明的口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测试剂盒内放置的特异性嵌合引物和通用引物的最佳比例为：特异性嵌合引物：通用引物等于1：10。
为方便本发明的试剂盒的使用，本发明的口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测试剂盒内还有甲酰胺溶液、分离缓冲液、分离胶、病毒RNA、PrimrScript One Step Enzyme Mix、2×One Step Buffer和灭菌双蒸水。
本发明工作原理是：GeXP多重PCR反应系统含有两种不同的引物：5’端连接有通用引物标签的特异性嵌合引物，该引物用于合成双链DNA（dsRNA）模板；荧光标记的正向通用引物，荧光标记便于毛细管电泳分析。该反应过程是反向特异性嵌合引物以RNA为模板扩增出含有未荧光标记的通用序列的cDNA模板。随后，多重PCR反应是由通用引物和特异性嵌合引物联合引起的，首先正向特异性嵌合引物以cDNA为模板扩增出两端都含有未荧光标记的通用序列的dsDNA模板，随后反应体系中荧光标记的通用引物占主导地位，扩增出含有荧光标记的产物。PCR产物经GeXP毛细管电泳仪分离，根据片段的大小分离不同的基因类型，荧光强度代表不同分离片段的扩增含量。
GeXP技术有着巨大的优势。第一，高通量基因定量分析。GeXP系统在一个反应中可以分析多达30个基因，然而可升级的GeXP系统在24h内可以自动分析6000多个数据。第二，低成本消耗。GeXP系统可一次分析单个样本中的30个基因，这样大大的降低了单个样本的分析成本以及实验的时间。美国Beckman Coulter公司推荐的操作流程需要6个小时，而优化后的操作流程仅需要5个小时就能完成整个检测过程。第三，低样本消耗。毛细管电泳技术作为GeXP系统的下游数据处理技术，凭借其敏感的基因表达分析技术，该系统可以分析RNA总量低至5ng的样品，特别适用于珍贵的样品分析。第四，高精确性和高灵敏度。GeXP系统中样品RNA的量和该基因的表达量之间具有很高的线性相关，它们之间的相关系数（R2）在0.99以上。因此，该系统可以检测到基因表达过程中0.5个拷贝数的变化。较高的峰值信噪比（SNR）使得实验有着很高的灵敏度和可重复性，并且实验结果更加精确。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1、本发明根据口蹄疫病毒（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病病毒和水疱性口炎病毒保守型以及GeXP检测系统引物设计要求设计了5对特异性嵌合引物和1对含有荧光标签的通用引物，并且扩增片段大小在150bp~350bp之间。
2、本发明的敏感性高于普通荧光定量PCR技术。
3、本发明采用TSP（Temperature Switch PCR）将RT-PCR和多重PCR有效的结合在一起，减少了PCR反应中的交叉污染，且整个反应只需要2h 35min，与荧光定量PCR相比大大的节省了时间。
4、本发明的通用引物序列属于非生物源性的核苷酸序列，可以避免非特异性产物的扩增，同时有效地避免了引物的偏好向现象，提高了检测的灵敏性。
附图说明    
图1是本发明FMDV、VSV、SVDV的PCR扩增产物，图中M：DL500 DNA Marker；1: VSV扩增结果；2: SVDV扩增结果；3: FMDV-O扩增结果；4: FMDV-A扩增结果；5: FMDV-Asia 1扩增结果。
图2是本发明VSV引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker；1：VSV;2: SVDV; 3:FMDV-A; 4: DMDV-O; 5：FMDV-Asia 1，可以看出VSV引物具有很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
图3是本发明SVDV引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker；1：SVDV;2: VSV; 3:FMDV-A; 4: DMDV-O; 5：FMDV-Asia 1，可以看出SVDV引物具有很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
图4是本发明FMDV-Asia 1引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker；1：FMDV-Asia 1;2: FMDV-A; 3: FMDV-O; 4: VSV; 5：SVDV，可以看出FMDV-Asia 1引物具有很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
图5是本发明FMDV-A引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker；1：FMDV-A;2: FMDV-Asia 1; 3: FMDV-O; 4: VSV; 5：SVDV，可以看出FMDV-A引物具有很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
图6是本发明FMDV-O引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker；1：FMDV-O;2: FMDV-A; 3: FMDV-Asia 1; 4: VSV; 5：SVDV，可以看出FMDV-O引物具有很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
图7至图11是本发明GeXP单重PCR引物特异性验证图，图7为VSV扩增结果，图8为SVDV扩增结果，图9为FMDV-Asia 1扩增结果，图10为FMDV-O扩增结果，图11为FMDV-A扩增结果，可以看出5对引物具有高度的特异性，不会与其他病毒产生非特异性扩增。
图12至图15是本发明VSV的GeXP单重PCR灵敏性验证图，从图12至图13中可以看出当模板的拷贝数为104 copies/μL和103 copies/μL时，在268bp的位置有清晰的产物峰出现，其荧光信号强度分别在160000和120000左右；而图13中，当模板的拷贝数为102 copies/μL时，268的峰值荧光信号强度在5000左右；图15中，当模板的拷贝数为10 copies/μL时，在268bp的位置没有检测到任何峰。这说明水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的单重PCR检测灵敏性可达102 copies/μL。
图16至图19是本发明SVDV的GeXP单重PCR灵敏性验证图，从图16至图18中可以看出当模板的拷贝数为104 copies/μL 、103 copies/μL、102copies/μL时在196bp处检测的峰值大约在160000、90000、4500左右；而图19中，当模板的拷贝数为10copies/μL时在在196bp的位置没有检测到任何峰，这说明猪水泡病病毒（Swine Vesicular Disease Virus，SVDV）的GeXP单重PCR灵敏性可达102 copies/μL。
图20至图23是本发明FMDV-Asia 1的GeXP单重PCR灵敏性验证图，从图20至图22中可以看出当模板拷贝数为104 copies/μL 、103 copies/μL、102copies/μL时在280bp处检测的峰值大约在140000、60000、8000左右；而图23中，当模板的拷贝数为10copies/μL时在在280bp的位置没有检测到任何峰，这说明FMDV-AsiaΙ的GeXP单重PCR灵敏性可达102 copies/μL。
图24至图27是本发明FMDV-O的GeXP单重PCR灵敏性验证图，从图24至图26中可以看出当模板拷贝数为104 copies/μL 、103 copies/μL、102copies/μL时在287bp处检测的峰值大约在120000、55000、14000左右；而在图27中，当模板的拷贝数为10copies/μL时在在287bp的位置没有检测到任何峰，这说明FMDV-O的GeXP单重PCR灵敏性可达102 copies/μL。
图28至图31是本发明FMDV-A的GeXP单重PCR灵敏性验证图，从图28至图30中可以看出当模板拷贝数为104 copies/μL 、103 copies/μL、102copies/μL时在241bp处检测的峰值大约在60000、20000、8000左右；而在图31中，当模板的拷贝数为10 copies/μL时在在241bp的位置信号强度不足2000，我们可以认为在该处检测到的该信号为阴性结果。因而，这说明FMDV-A的GeXP单重PCR灵敏性可达102 copies/μL。
图32至图35是本发明GeXP多重PCR灵敏性验证图，从图32至图35中可以看出在105 copies/μL 、104 copies/μL、103copies/μL和102copies/μL水平都能同时检测到5种病毒RNA，其中在102copies/μL水平时，FMDV-O型、VSV和SVDV扩增片段的信号强度低于2000，无法对下一个稀释梯度的混合样品进行检测。因此，GeXP多重基因检测系统同时检测5种病毒的灵敏性为102copies/μL。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明做进一步说明：
本实施例中的方法是一种GeXP多重PCR系统检测猪水泡性病的方法，该方法主要由6对引物、甲酰胺溶液、分离缓冲液、分离胶、病毒RNA、PrimrScript One Step Enzyme Mix、2×One Step Buffer和灭菌双蒸水构成。
根据NCBI已经发表的口蹄疫病毒（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病病毒和水疱性口炎病毒核苷酸全序列 (GenBank的登录号为: AY429470), 参考GeXP多重PCR体系引物设计要求，设计并合成了6对引物，包括5对特异性嵌合引物和1对含有荧光标签的通用引物，具体引物序列如下：
通用引物-F：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA
通用引物-R：GTACGACTCACTATAGGGA
FMDV-A-F: AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC
FMDV-A-R: GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT
FMDV-O-F: AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT
FMDV-O-R: GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG
FMDV-Asia 1-F：AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC
FMDV-Asia 1-R：GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC
VSV-F: AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA
VSV-R: GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTTAGGGATCTGG
SVDV-F: AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG
SVDV-R: GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC
注：“-F”表示上游引物序列，“-R”表示下游引物序列，下划线为通用引物序列。
检测步骤如下：
1.用BHK细胞和IBRS-2细胞分别培养口蹄疫病毒（A型、O型和Asia 1型）、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒液，用QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen, Tokyo, Japan)，按说明操作提取病毒RNA。
2.RT-PCR反应加样：在0.5ml 无RNA酶的PCR 管中加入以下试剂
4.PCR产物的毛细管电泳分析：
用甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS）对PCR产物进行10倍的稀释；配置上样反应体系（40μl），包含38.5μl的甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS），0.5μl的DSS 400（分子量内标-400），1μl的PCR产物稀释液；在漩涡器上震荡30s混匀，或用枪头混匀，并做简易离心以除去气泡，每孔加一滴石蜡油防止样品挥发；在缓冲液板与上样板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；进入GeXP的Set Up程序，输入样品名称，对每个样品指定Frag-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本。
5.结果判定：
毛细管电泳结束，导出实验数据并对实验结果进行分析，图7-11为水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒、口蹄疫病毒O型、A型以及Asia 1型扩增结果。水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒。口蹄疫病毒O型、A型以及Asia 1型阳性样品的分别会在268bp、196bp、287bp、241bp以及280bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时阳性对照结果也会在相应位置出现条带，而空白对照无任何信号峰出现。图32-35为GeXP多重PCR 扩增水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒。口蹄疫病毒O型、A型以及Asia 1型的结果示意图。
此外，在本发明实施例中对本发明的单重和多重灵敏性进行了实验，为本发明试剂用于商业试剂盒的制备，具体应用及其优越性提供了参考。
相关的实验结果如下：
通过对FMDV-O型单重灵敏性实验可知，本发明检测FMDV-O型灵敏性为102copies/μL，参见图24-27。
通过对FMDV-Asia 1型单重灵敏性实验可知，本发明检测FMDV-Asia 1型灵敏性为102copies/μL，参见图20-23。
通过对FMDV-A型单重灵敏性实验可知，本发明检测FMDV-O型灵敏性为10 2copies/μL，参见图28-31。
通过对VSV型单重灵敏性实验可知，本发明检测FMDV-O型灵敏性为102copies/μL，参见图12-15。
通过对SVDV型单重灵敏性实验可知，本发明检测FMDV-O型灵敏性为102copies/μL，参见图16-19。
通过对5种病毒的多重灵敏性实验可知，本发明检测5中病毒灵敏性为102copies/μL，参见图32-35。
通过用本发明的试剂盒对口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎症状类似的水泡性疾病进行检测，本发明的试剂盒能够特异性地对这5种病毒进行鉴别诊断。
实验还证明，本发明具有极高的检测灵敏度，从图12至图31中可见，5种病毒的GeXP单重PCR检测灵敏性均为102copies/μL，而普通单重PCR的检测灵敏性在105 copies/μL至104 copies/μL之间，与该方法相比低100倍~1000倍。从图32-35中可见，GeXP多重基因检测系统同时检测5种病毒的灵敏性为102copies/μL，比常规的多重PCR及荧光定量PCR灵敏度高10倍~100倍。
 
<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>  一种水疱性病检测试剂盒
<160>  12
 
<210>  1
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-A-F）
<400> 
aggtgacact atagaatagg gtgatctagg gtctctcgc                             39
 
<210>  2
<211>  43
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-A-R）
<400>
gtacgactca ctatagggac aggagctgct ttgcaggtgc aat                        43
 
<210>  3
<211>  41
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-O-F）
<400>
aggtgacact atagaatagt gactgaactg ctttaccgca t                          41
 
<210>  4
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-O-R）
<400>
gtacgactca ctatagggag acatgtcctc ctgcatctg                             39
 
<210>  5
<211>  38
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-Asia 1-F）
<400>
aggtgacact atagaataac tgcctaccag aagcaacc                              38
 
<210>  6
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（FMDV-Asia 1-R）
<400>
gtacgactca ctatagggaa gtatgtctcc gcacgcttc                             39
 
<210>  7
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列（VSV-F）
<400>
aggtgacact atagaatatg atacagtaca attattttgg ga                         42
 
<210>  8
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（VSV-R）
<400>
gtacgactca ctatagggag agactttctg ttagggatct gg                         42
 
<210>  9
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列（SVDV-F）
<400>
aggtgacact atagaatatt cagaatgatt gcatatgggg                            40
 
<210>  10
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（SVDV-R）
<400>
gtacgactca ctatagggat cacgtttgtc caggttacc                             39
 
<210>  11
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列（UWD-F）
<400>
aggtgacact atagaata                                                    18
 
<210>  12
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列（UEV-R）
<400>
gtacgactca ctataggga                                                   19

Claims (3)

1.用于检测口蹄疫A型、O型、Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的引物序列，其共10条，引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5和SEQ ID No. 6、SEQ ID No.7 、SEQ ID No8、SEQ ID No9和SEQ ID No10。
2.一种口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有前述的用于GeXP多重基因分析系统的扩增10引物：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6 、SEQ ID No.7、SEQ ID No. 8 、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，还包括通用引物：SEQ ID No.11和SEQ ID No. 12，其中SEQ ID No.11的5’端添加有Cy5荧光标签。
3.权利要求2所述试剂盒非疾病诊断的使用方法，其特征在于以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6 、SEQ ID No.7、SEQ ID No. 8 、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No. 12引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中241bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒A型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒Asia 1型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中287bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒O型阴阳性，根据毛细管电泳信号分析图中268bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的水疱性口炎病毒阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中196bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的猪水泡病病毒阴阳性。
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