CN1840703A - 动物水泡性疾病多重rt－pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物水泡性疾病如猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)的病毒特异和保守的基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对SVDV、VSV、FMDV三种病毒进行同时鉴别检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。本发明系分别选择猪水泡病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒的VP1、N基因和3D基因的保守片段为靶目标，经过精心设计、合成三种病毒各自的特异性引物。本发明所述的动物水泡性疾病多重RT－PCR鉴别检测试剂包含三对特异性引物，SVDV、VSV、FMDV各自的扩增目标片段长度为126bp、301bp和189bp。本检测试剂可在同一反应管中同时对SVDV、VSV、FMDV三种病毒进行鉴别检测。

Description

动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种动物水泡性疾病如猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)的病毒特异和保守的基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对SVDV、VSV、FMDV三种病毒进行同时鉴别检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。

背景技术

猪水泡病(swine vesicular disease，SVD)又名猪传染性水泡病，是由猪水泡病毒(SVDV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，以口和蹄部产生水泡性损伤为特征，其临床症状与猪口蹄疫极为相似。1966年10月首先发现于意大利Lombardy的猪群中，以后在欧洲的许多国家相继发生猪水泡病的流行蔓延，引起严重的经济损失并导致世界肉食市场的混乱。

水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus，VSV)属于弹状病毒科水泡病毒属的病毒。分为两个血清型：新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。它是牛、猪、马的流行性和散发性疾病，还可感染其它许多哺乳动物。人对此病毒易感，可产生类似流感样症状和口腔、手足的水泡。牛、猪、马感染后引起严重的口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，造成巨大的经济损失。临床症状与口蹄疫(FMD)、水泡病(SVD)和水泡疹(VE)很相似，不易区别。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的野生、家畜偶蹄动物的一种高度传染性的疾病。快速和可靠的诊断对于FMD的控制和消灭此病至关重要，为采取有效措施，实验室诊断必须在24小时以前作出快速、准确的结论。动物和肉类产品带病毒引发口蹄疫是多次大流行的主要原因^[1]。对肉食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。

猪水泡病、水泡性口炎和口蹄疫都是猪的多发病，以口和蹄部产生水泡性损伤为特征，其临床症状极为相似，引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国农业部列为动物一类传染病。三种水泡性疾病在其临床症状无法区别，必须通过鉴别诊断，目前对3种疾病的诊断多采用病原的分离及常规的血清学方法，所需时间较长，也有些使用PCR技术单独鉴别的，但还没有建立稳定的能够同时鉴别三种病毒的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够同时鉴别检测猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)的动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供这种检测试剂的应用。

本发明所述的动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂包含三对特异性引物，SVDV、VSV、FMDV各自的扩增目标片段长度为126bp、301bp和189bp，引物序列为：

SVDV引物：FSV-multi-P-SDF：5’-TGGT CCAG TACC CACAAAGG T-3’

          FSV-multi-P-SDR：5’-TATG CGTT GCCT ATGC CAAT G-3’

VSV引物：FSV-multi-P-VF：5’-GGCT TCCC ATCT ACAT CCTA GG-3’

         FSV-multi-P-VR：5’-TGCC CAAA TGTT GCAA GTG-3’

FMDV引物：

         FVP2-F：5’-TTA CAAACC TGT GAT GGC CTC-3’

         FVP3-R：5’-CGC AGG TAAAGT GAT CTG TAG CTT-3’

本发明系分别选择猪水泡病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒的VP1、N基因和3D基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primerprere5.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物进行最佳配对筛选实验和多重RT-PCR试验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到如上所述的可进行三种动物水泡性疾鉴别检测的扩增效率和特异性好的三对引物。

本发明所述的动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂的制备方法由以下步骤组成：

一、选择猪水泡病病毒VP1基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

TGGTCCAGTACCCACAAAGGTAAACAGCTACAGCTGGCAAACGTCCACCAACCCGAGTGTGTTCTGGACGGAAGGGAGCGCACCGCCTCGAATGTCGATACCATTCATTGGCATAGGCAACGCATA：

二、选择水泡性口炎病毒N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACTACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCTCGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCCACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTGCAGCACTTGCAACATTTGGGCA：

三、选择口蹄疫病毒3D基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG

四、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物；

五、引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

六、将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验后，确定并得到扩增效率和特异性好的三对引物。

本发明所述的多重PCR技术是在同一PCR体系中，放入多对引物，对多种目的基因同时扩增的分子生物学诊断方法，它具有快速、敏感、特异等优点。因此，建立对猪水泡病、水泡性口炎和口蹄疫病毒快速有效的多重RT-PCR鉴别诊断方法是十分必要的。本研究通过对各血清型和流行病毒株基因进行全面分析，确定出扩增病毒基因的靶序列，设计出适用于对猪水泡病、水泡性口炎和口蹄疫病毒进行多重RT-PCR检测的特异性扩增引物，并通过PCR实验优化出了引物浓度，建立了稳定、高效、快速地检测猪水泡病、水泡性口炎和口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。

本发明的优点和积极效果为：

1、本多重RT-PCR鉴别检测试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可同时检测和鉴别三种疾病等优点。对肉食品中低含量的SVDV、VSV、FMDV病毒样品、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测。

2、本多重RT-PCR鉴别检测试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种样品中的SVDV、VSV、FMDV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。

3、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后6小时之内作出定性、鉴别检测结果。该多重RT-PCR鉴别检测试剂是一种检测临床样品中SVDV、VSV、FMDV的敏感和可靠的方法。

具体实施方式

1、SVDV VP1、VSV N、FMDV 3D基因重组质粒的构建

按照花群义等《水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析》，中国生物制品学杂志，2004年第1期，第4页至第7页，进行水泡性口炎病毒N基因克隆和测序，构建SVDV VP1、VSV N、FMDV 3D基因基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-VP1、pBAD-VN5、pBAD-3D。

2、设计引物

本发明选择SVDV VP1、VSV N、FMDV 3D基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的SVDV、VSV、FMDV基因的DNA序列和上述1克隆和测序的SVDVVP1、VSV N、FMDV 3D基因DNA序列进行同源性分析比较，分别选定SVDV VP1、VSV N、FMDV 3D基因的保守片段(126bp、301bp和189bp)，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物，引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA引物的合成。将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验和交叉反应试验后，确定三种病毒各自的扩增效率和特异性最好的三对引物，扩增目标片段长度分别为126bp、301bp和189bp。

3、RNA提取

SVDV、VSV、FMDV病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID₅₀。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID₅₀的每个反应管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。

4、多重RT-PCR

引物浓度和其它反应组份的浓度进行精确筛选，以获得扩增效率高、产量高、特异性好、无非特异性条带的各反应组份的最佳浓度和最佳反应条件。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的3个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立不同稀释度的阳性标准品对照；每个样品检测做3管平行试验。在3个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

通过优化确定的主要各反应组份浓度为：MgCl₂终浓度为4mmol/L，FSV-multi-P-SDF/FSV-multi-P-SDR终浓度为2μmol/L，FSV-multi-P-VF/FSV-multi-P-VR终浓度为0.5μmol/L，μmol/L，μmol/L，FVP2-F/FVP3-R终浓度为1.5μmol/L，4dNTP终浓度为0.3mmol/L。

通过优化确定的扩增循环参数条件为：42℃60min反转录；94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min，4℃3min。

按上述方法进行扩增后，检测用2％琼脂糖电泳分析，SVDV、VSV、FMDV阳性扩增结果出现的条带分别为126bp、301bp和189bp。

5、SVDV、VSV、FMDV多重RT-PCR的特异性、敏感性

用SVDV、VSV、FMDV、BVDV、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21细胞、野外采集猪、牛的组织样品和血清进行特异性比较检测。对细胞培养物、人工感染动物组织样品进行10倍系列稀释，用多重RT-PCR进行检测，比较它们的敏感性。

6、多重RT-PCR稳定性和重复性试验

在评估SVDV、VSV、FMDV多重RT-PCR检测方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用相当于1000TCID₅₀的SVDV、VSV、FMDV样品RNA，在同样反应条件下，反复进行多重RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

7、对样品的检测

用多重RT-PCR对SVDV、VSV、FMDV细胞培养物、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测。提取的RNA稀释后进行扩增检测，产物用2％琼脂糖电泳分析，SVDV、VSV、FMDV阳性扩增结果应分别出现126bp、301bp和189bp的特异性条带。多重RT-PCR对SVDV、VSV、FMDV样品的检测特异性强、敏感性高、重复性很好。

8、动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂的标准化试剂和检测程序

8.1 试剂盒组成：根据上述1～7试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件和各组份浓度，配制如下试剂盒组份：

溶液I(TrizoL)	25ml
		溶液II(三氯甲烧)	5ml
溶液III(异丙醇)	12.5ml
		溶液IV(75％乙醇)	25ml
溶液V(RT混合液，含引物)	200μl
		溶液VI(RT酶混合液)	50μl
溶液VII(PCR混合液，含引物)	625μl
		溶液VIII(Taq DNA聚合酶)	25μl
溶液IX(DEPC-H2O)	20ml
		溶液X-1(FMDV阳性cDNA)	50μl
溶液X-2(VSV阳性cDNA)	50μl
		溶液X-3(SVDV阳性cDNA)	50μl
溶液XI(电泳加样缓冲液)	1000μl

8.2 操作方法

8.2.1 总RNA提取(此步须在负压实验室内操作)

(1)取1ml-1.5ml组织样品研磨上清液或液体样品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。

(2)加入1ml溶液I，充分振荡混匀，置室温5min，彻底裂解。

(3)加200μl溶液II，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec，室温放置3min。

(4)12000rpm，4℃，离心15min。

(5)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混匀，室温放置10min。

(6)13000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。

(7)加1000μl溶液IV，充分振荡混匀，12000rpm，4℃，离心5min。小心充上清液。管底部可见有乳白色胶样RNA沉淀。

(8)小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA。

(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA。可直接用于反转录或-70℃保存备用。

8.2.2 反转录

取一支200μl PCR反应管，反应总体积为20μl，向反应管中加入下列反应物：

(1)溶液V	8μl
		(2)RNA模板	10μl
(3)溶液VI	2μl
		反应总体积	20μl
高速离心10sec，42℃60min，94℃5min，置冰盒。

8.2.3 PCR扩增

取一支200μl PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物：

RT产物	5μl	-	-	-	-
						溶液IX	19μl	23μl	23μl	23μl	24μl
总体积	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl
						各反应管经高速离心10s后，置入扩增仪中，循环参数：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min，4℃3min。

8.2.4 结果分析和判定

(1)用TBE或TAE电泳缓冲液配制2％的琼脂糖(含0.5μg/mL EB)平板。

称取2g琼脂糖，加入100ml 1×TAE或TBE(配制方法：三羟甲基氨基甲烷54g，硼酸27.5g，乙二胺四乙酸2.922g，用去离子水1000mL溶解；用5mol/L的盐酸调到pH8.0；使用时用去离子水稀释至1倍的TBE电泳缓冲液)缓冲液中。微波炉中加热融化后加5μl(10mg/ml)溴化乙锭(配制方法：溴化乙锭用去离子水配制成10mg/mL，用时每100mL琼脂中加5μL)，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘平扳中，胶板厚为5mm左右。按照样品数量选择适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子，将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将8μL样品和2μL溶液XI混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用DL2000 Marker或pUCl9 DNA/Msp I(HpaII)。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察有无特异性DNA片段扩增产物。

(2)结果观察和判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪或紫外图像分析仪上打开紫外灯观察。阳性和阴性对照成立，检测样品无非特异性条带产生，则该试验成立。可进行结果判定。

A、FMDV阳性对照：PCR后会出现一条189bp的DNA片段。

B、VSV阳性对照：PCR后会出现一条300bp的DNA片段。

C、SVDV阳性对照：PCR后会出现一条125bp的DNA片段。

D、如某一待检样品扩增产物的DNA带有一条或一条以上与阳性对照相应的DNA带，即在一条直线上，它们与加样孔的距离相同，同时阴性对照无扩增条带，则该样品相应地判定为阳性。

Claims (3)

1、一种动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂，其特征在于包含三对可鉴别检测三种病毒的特异性引物，SVDV、VSV、FMDV各自的扩增目标片段长度为126bp、301bp和189bp，引物序列为：

SVDV引物：FSV-multi-P-SDF：5’-TGGT CCAG TACC CACA AAGG T-3’

          FSV-multi-P-SDR：5’-TATG CGTT GCCT ATGC CAAT G-3’

VSV引物：FSV-multi-P-VF：5’-GGCT TCCC ATCT ACAT CCTA GG-3’

         FSV-multi-P-VR：5’-TGCC CAAA TGTT GCAA GTG-3’

FMDV引物：

         FVP2-F：5’-TTA CAAACC TGT GAT GGC CTC-3’

         FVP3-R：5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’

2、按照权利要求1所述的动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

(一)、选择猪水泡病病毒VP1基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

TGGTCCAGTACCCACAAAGGTAAACAGCTACAGCTGGCAAACGTCCACCAACCCGAGTGTGTTCTGGACGGAAGGGAGCGCACCGCCTCGAATGTCGATACCATTCATTGGCATAGGCAACGCATA；

(二)、选择水泡性口炎病毒N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

GGCTTCCCATCTACATCCTAGGTCTTTACAGAGTGGGCAGATCTAAAGTTACGGATTACAGAAAGAAACTACTGGACGGGCTTGAAAATCAGTGCAAAGTGGCGTCAACCAGATTTGAGAGTCTAGTCGAGGATGGTCTCGACTTCTTTAACATATGGGAGAATGATCCAAATTTCACCAAGATAGTTGCTGCAGTGGATATGTTCTTCCACATGCTCAAAAAGCATGAACGTGCTCCAATCAGATACGGAACCATAGTCTCAAGATTCAAGGACTGTGCAGCACTTGCAACATTTGGGCA；

(三)、选择口蹄疫病毒3D基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：

TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG。

(四)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物；

(五)、引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

(六)、将设计合成的多对引物进行最佳配对筛选实验和多重RT-PCR试验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到如权利要求1所述的三对引物。

3、权利要求1所述的动物水泡性疾病多重RT-PCR鉴别检测试剂在制备试剂盒中的应用。