CN1260370C - 水泡性口炎病毒荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以水泡性口炎病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对水泡性口炎病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。本发明系选择水泡性口炎病毒N基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为97bp。

Description

水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种以水泡性口炎病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对水泡性口炎病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。

背景技术

水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus，VSV)属于弹状病毒科水泡病毒属的病毒。分为两个血清型：新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。它是牛、猪、马的流行性和散发性疾病，还可感染其它许多哺乳动物。人对此病毒易感，可产生类似流感样症状和口腔、手足的水泡。牛、猪、马感染后引起严重的口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，造成巨大的经济损失。临床症状与口蹄疫(FMD)、水泡病(SVD)和水泡疹(VE)很相似，不易区别。

VSV的病原学、病毒持续存在等许多方面尚不完全清楚，比如病毒的贮存者。感染VSV 8年后的牛血清中还可检测到高水平的中和抗体，有迹象表明，临床健康牛的调运可传播VSV。因此，VSV可能持续存在于宿主体内。昆虫和植物也可能成为VSV潜在的贮存者，节肢动物媒介可以传播VSV。由于感染后几天才能产生抗体，或者感染后抗体滴度迅速下降，以及疫苗免疫的影响，血清学检测方法的结果难以作出准确判定。病毒分离方法费时，不能作出快速诊断，且需要选用敏感的宿主或细胞。野外分离病毒很难在细胞培养中繁殖，VSV病毒血症中可检测到病毒，有时只检测到短暂的或低滴度病毒。因此，研究建立特异、敏感、可对低含量VS病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。检测VSV特异性核酸的最好方法是反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，它将高敏感性、高特异性和高准确性结为一体，不像细胞培养分离病毒时易受临床样品中中和抗体的干扰，是研究VSV病原学和持续感染的良好检测方法。近几年发展起来的TaqMan实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，克服了传统PCR费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的VSV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为病原体检测的重要方法。

动物和肉类产品带病毒引发水泡性口炎是多次大流行的主要原因。对肉食品中低含量的水泡性口炎病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。RT-PCR可用于VS的诊断，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用水泡性口炎病毒N基因序列设计合成的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。

本发明系选择水泡性口炎病毒N基因的保守片段为靶目标，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。

本发明所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为97bp，引物和探针序列为

引物：VSV-F-RT-P：5’-ATG GCT CCT ACA GTT AAG AGA ATC A-3’

      VSV-R-RT-P：5’-TGA AGT AAT CAG CCG GGT ATT C-3’

探针：(FAM)5’-CGA AAT TAC CGG CCA ACG AGG ATC-3’(TAMRA)

本发明所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成：

一、选择VSV N基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCATTAACGACTCAATTATTCAGCCGAAATTACCGGCCAACGAGGATCCGGTCGAATACCCGGCTGATTACTTC；

二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；

三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；

五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定并得到扩增效率和特异性好的引物和探针。

本发明的优点和积极效果为：

1、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR可对肉食品中低含量的VS病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种VSV检测的良好方法。

2、本试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种样品中的VSV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。

3、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。

4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。

5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测临床样品中VSV的敏感和可靠的方法。

具体实施方式

1、VSV N基因重组质粒的构建

按照花群义等《水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析》，中国生物制品学杂志，2004年第1期，第4页至第7页，进行水泡性口炎病毒N基因克隆和测序，构建VSV N基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-VN5。

2、设计引物和探针

本发明选择VSV N基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的VSVN基因的DNA序列和上述1克隆和测序的水泡性口炎病毒N基因DNA序列进行同源性分析比较，选定VSV N基因的保守片段(97bp)，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为97bp。

3、RNA提取

水泡性口炎病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID₅₀。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID₅₀的每个反应管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。

4、VSV荧光定量RT-PCR

VSV荧光定量RT-PCR采用25μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：42℃30min反转录；92℃变性3min；92℃变性10min，45℃30sec，72℃1min，预扩增5个循环；然后以92℃10sec，60℃30sec扩增40个循环。

引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的C_T值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID₅₀/每反应管的FMDV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。

5、常规RT-PCR

常规RT-PCR的上游引物和下游引物与荧光定量RT-PCR相同，扩增目标片段长度为97bp，按常规方法进行扩增。检测用2％琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条97bp特异性条带。

6、VSV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性

用FMDV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21细胞、野外采集猪、牛的组织样品和血清进行特异性比较检测。对VSV细胞培养物、人工感染动物组织样品进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏感性。

7、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验

在评估VSV荧光定量RT-PCR检测VSV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用相当于1000TCID₅₀的样品RNA，在同样反应条件下，反复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。

8、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算

上述1构建的重组质粒pBAD-VN5，转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖，碱裂解法提取，经试剂盒纯化，质粒浓度用分光光度计测OD260定量。模板浓度的计算：在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4～10^-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后，可计算出每个PCR管中模板的数量。例如，已知pBAD/Thio TOPO载体长4436bp，插入的VSV N基因片段长1266bp，每个碱基的平均分子量是330，(每对碱基/bp是660，)质粒原液约180μg/mL，阿弗加德罗常数(每mol的微粒数)是6.02×10²³/mol。那么每2μL的绝对模板数量是：(180μg/mL×2μL×6.02×10²³/mol)/[(4436+1266)bp×660g/(mol×bp)]＝5.8×10¹⁹。据此，10^-4～10^-7质粒的模板分子数是5.8×10¹⁵～10¹²。做荧光定量RT-PCR检测，以拷贝数或TCID₅₀的对数为X轴，C_T值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线。

9、引物和探针及其浓度的筛选

选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最低C_T值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品和VSV细胞毒，经系列稀释，制备DNA和RNA不同含量的检测样品。对设计的二对引物和各自的探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。

10、对VSV样品的检测

用荧光定量RT-PCR对VSV细胞培养物、组织、FMDV、BTV17、BVDV、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测。提取的RNA稀释后检测，阳性样品的C_T值均小于或等于32.0，阴性对照样品的C_T值均大于40，试验特异性强。C_T值40可作为是阳性和阴性的临界值。C_T值大于40可判为阴性，C_T值小于或等于32.0可判为阳性，在32.0-40之间为可疑，须重新试验。荧光定量RT-PCR检测VSV的特异性强，敏感性高，重复性很好。

11、VSV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序

11.1试剂盒组成

组成成份(48tests/盒)	体积
		样本处理试剂裂解液核酸扩增试剂DEPC水VSV RT-PCR反应液RT-PCR酶(带盖PCR反应管装)Taq酶(5U/ul)对照品阴性对照阳性对照(非感染性体外转录RNA)	5ml×6瓶1ml×1管750ul×1管1颗/管×12管12ul×1管1ml×1管1ml×1管
定量用标准对照品(重组质粒)	0.5ml×1管

11.2操作方法

11.2.1样本处理(样本处理区)

●取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。

●首先加入600ul裂解液(裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干)，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(一份样本换用一个吸头)；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。

●于12,000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。

●取与步骤1.1.中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中(上清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质)，颠倒混匀。

●12,000g离心15min，(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul 75％乙醇，颠倒洗涤。

●12,000g离心10min，(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。

●4,000g离心10sec(注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免RNA不溶)。

●加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用(注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。

11.2.2扩增试剂准备(PCR前准备区)

●从试剂盒中取出VSV RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000rpm离心5sec。设所管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	VSV RT-PCR反应液	Taq酶
			用量	15ul	0.25ul

●计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个反应管中各分装15ul，转移至样本处理区。

11.2.3加样(样本处理区)

●在各设定的反应管中分别加入上述样本处理步骤1.8.中制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，放入离心机中，于2,000rpm离心5sec。将反应管排好放入PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。

11.2.4RT-PCR反应(检测区)

●循环条件设置

Program	cycles	Temperature(℃)	IncubationTime(min：sec)	TemperatureTransition Rate(℃/sec)	AcquisitonMode	AnalysisMode
							1	1	42	30:0	20	None	None
2	1	92	3:00	20	None	None
							3	5	92	10	20	None	None
45	30	20	None
				72	1:00	20			None
4	40	92	10							20	None	Quantification
				60	30	20	Single
		5	1					40	0	20	None		None

11.2.5结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。

11.2.6质控标准

●阴性对照的检测结果为阴性。

●阳性对照的Ct值应小于等于32.0。

11.2.7结果判断

●Ct值无数值的样本为阴性样本。

●Ct值≤32.0的样本为阳性。

●Ct值大于32.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。

11.2.8定量检测

在作绝对定量检测时，首先制备标准曲线。对试剂盒中提供的定量用标准对照品(重组质粒)，按说明书要求进行序列稀释，与被检样品同时进行荧光定量RT-PCR检测。以标准品的拷贝数的对数为X轴，C_T值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线，即可对被样品进行定量。

Claims (2)

1、一种水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为97bp，引物和探针序列为：

引物：VSV-F-RT-P：5’-ATG GCT CCT ACA GTT AAG AGA ATC A-3’

      VSV-R-RT-P：5’-TGA AGT AAT CAG CCG GGT ATT C-3’

探针：(FAM)5’-CGA AAT TAC CGG CCA ACG AGG ATC-3’(TAMRA)。

2、按照权利要求1所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

(一)、选择水泡性口炎病毒N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCATTAACGACTCAATTATTCAGCCGAAATTACCGGCCAACGAGGATCCGGTCGAATACCCGGCTGATTACTTC；

(二)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；

(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

(四)、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；

(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定并得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。