CN102086476A

CN102086476A - 多重荧光定量rt-pcr同时检测新甲型h1n1及人季节性h1n1和h3n2流感病毒

Info

Publication number: CN102086476A
Application number: CN2009102240808A
Authority: CN
Inventors: 马学军; 秦萌; 舒跃龙; 董小平; 李德新; 聂凯; 王淼
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2011-06-08

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院等用于对发热病人咽拭子等标本的人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。具体通过计算机软件分析人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的保守序列，分别设计出两条相对应的引物和探针，进行单管多重(4重)荧光定量RT-PCR(包括内参基因)，整个反应不到2个小时。本发明克服了常规多管多重荧光定量RT-PCR方法操作繁琐，时间较长，成本较高的缺点，对于追踪新甲流和季节性流感可能的共感染和重组提供了良好的工具，其高特异、高灵敏、快速的特点为实现对大量流感疑似病例的快速准确筛查提供了有力的技术支撑。

Description

多重荧光定量RT-PCR同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒

发明领域

本发明属于生物技术应用领域。本发明是用基于多重荧光定量RT-PCR技术同时检测人新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院对人新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的同时检测和监测。

发明背景

新甲型H1N1流感(原称人感染猪流感病毒)是一种新的甲型H1N1病毒引起的急性呼吸道传染病，具有较强的传染性，可通过近距离飞沫和接触传播，这种新型病毒是美国于2009年4月在人体中首次检出的。随后，该病毒在世界范围内蔓延开来。序列研究表明，该病毒是由人、禽和猪源流感病毒重配的产物。目前，人们对该病毒的毒力、传染性等特征有限的认识使得开发快速检测及分型技术来筛查可疑病例，从而实现对疫情蔓延的控制以及及时的抗病毒治疗显得尤为迫切。

早期有关流感病毒分型研究使用荧光定量RT-PCR、芯片、流式细胞仪和测序等方法做为终端检测系统，但这些方法大多不能检测新甲型H1N1流感病毒。尽管有些方法得到进一步发展，但仍依赖于昂贵的设备，并且灵敏度也不高。目前已经开发了四种荧光定量RT-PCR技术包括HPA(H1)v(英国卫生防护机构)、CDC(H1)v(美国疾控中心)、HPA(N1)v(英国卫生防护机构)和S-OIV(国家病毒参比实验室，爱尔兰)虽然可以检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒，但这些方法都是多管多重荧光定量RT-PCR，操作繁琐，时间较长，成本较高。国内达安基因公司和科华公司等开发的荧光定量RT-PCR检测新甲流的试剂已得到了中国FDA的批准，不过这些方法都没有包括检测季节性H3N2，不能实现单管同时检测2种季节性流感和新甲型流感。本专利成功建立了一套4重荧光定量RT-PCR方法可实现单管同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒、人季节性H3N2流感病毒，并对该法的特异性和灵敏度做了分析，整个反应不到2个小时。利用阳性临床标本进行验证，结果表明该方法和WHO推荐的方法的检测结果完全符合。这将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。

发明内容：

1.以WHO公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用CLUSTAL X软件进行序列比对，选取对于针对各个靶病毒高度保守而对于其它型别高度特异的基因区段，由Primer Premier5设计四重引物和探针，如表一：

表一各引物和探针序列

TABLE 1.RT-PCR Primers and probes designed for this study

^a：Degenerate primer abbreviations are as follows：R＝A/G；Y＝T/C；M＝A/C.

2.建立了如下的检测过程，详见如下：

(1)合成探针：使用北京英杰生命技术有限公司合成仪合成并纯化。

(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。

(3)4重荧光定量RT PCR反应。

(4)阳性反应结果以Ct值小于或等于35判定。

具体实施方式

实施方案1：多重荧光定量RT-PCR的反应体系和条件

按Qiagen试剂盒说明提取不同来源和亚型的流感病RNA。建立Bio-Rad荧光定量RT-PCR一步法反应体系(25μl)，组成如下：RTase 0.5μl，itaq mix 12.5μl，itaq酶0.5μl，RNA模板4μl，sH1N1、sH3N2、nH1N1和RnasP的引物和探针浓度分别为1.6μmol/L，1.6μmol/L；0.2μmol/L，0.2μmol/L；0.4μmol/L，0.4μmol/L；0.08μmol/L，0.08μmol/L。反应条件为：50℃ 30min合成cDNA，然后95℃ 5min条件下灭活iScript逆转录酶。50个循环的PCR包括95℃ 15s、60℃ 30s，最后用CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)读板。

实施方案2：多重荧光定量RT-PCR的特异性

以人季节性H1N1、H3N2、HB及A/California/07/2009(H1N1)sw1细胞培养病毒株及按照1∶1比例人为将A/California/07/2009(H1N1)sw1分别和HB、sH1N1、sH3N2混合的样品做为检测对象，提取RNA后进行多重荧光定量RT-PCR的特异性分析。未出现交叉反应，每个反应只出现特异信号，HB的检测结果为阴性。

实施方案3：多重荧光定量RT-PCR的灵敏度

系列稀释纯化和定量后的体外转录的人甲型H1N1流感HA全基因的RNA至2，20，200和2000拷贝，多重荧光定量RT-PCR检测的体系同实施方案1。检测的灵敏度可达到20拷贝RNA的水平。

实施方案4：临床样本分析和验证

以34份经WHO公布的荧光定量PCR新甲型H1N1流感病毒检测方案检测过的阳性样本做为检测对象，利用多重荧光定量RT-PCR方法验证。结果与WHO公布的荧光定量PCR相符，Ct值在25.2～32.73之间，和本实验室建立的等温扩增和GeXP检测结果吻合。检测20份经RT-PCR验证过的季节性流感H3N2的临床标本，结果也完全相符。多重荧光定量RT-PCR检测的体系同实施方案1。

Claims

1.一种用于同时检测人新甲型H1N1流感病毒、人季节性甲型H1N1流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因的多重荧光定量RT-PCR技术，其中包括：用于人新甲型H1N1流感病毒、人季节性甲型H1N1流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因检测的引物和探针及荧光标记。

2.权力要求1所述的多重荧光定量RT-PCR技术的引物和探针包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体和标记的荧光。

3.权力要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测技术包括人新甲型H1N1流感病毒、人季节性甲型H1N1流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒及其变异株。

4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院用于人新甲型H1N1流感病毒、人季节性甲型H1N1流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。

5.权力要求1所述的同时检测人新甲型H1N1流感病毒、人季节性甲型H1N1流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因的多重荧光定量RT-PCR技术的反应程序和检测程序。