CN110760618A - 一种副肠孤病毒3型实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。本发明针对副肠孤病毒3型特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时采用人内源性Rnase P基因作为内参基因，采用Rnase P特异性引物和探针检测标本中内参基因RNA，利用实时荧光定量PCR技术能够更快速、准确且灵敏地检测出副肠孤病毒3型，特异性强、灵敏度高，在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。
背景技术
人副肠孤病毒(human parechovirus，HPeV)是一种单股正链、无包膜的RNA病毒，属于小RNA病毒科，副肠孤病毒属。迄今为止，人类已经发现了16中不同型别的HpeV(HpeV1～16)。HpeV可在普通人群州农工流行，感染对象主要是儿童。其主要是通过粪口途径和飞沫途径传播，另外还有报道通过亲密接触感染该病毒的病例。多数患者仅出现轻微胃肠道及呼吸道等非特异性症状。3型人副肠孤病毒(human parechovirus 3，HPeV3)是2004年被发现的与儿童脓毒症密切相关的一种病原体，该病毒感染可引起急性缓驰性麻痹、无菌性脑膜炎、脑炎和心肌炎。
但是，目前针对HPeV3的现有检测方法如病毒分离、电镜观察、血清中和、ELISA及免疫荧光等，均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病毒进行鉴定的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括副肠孤病毒3型特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。
一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
进一步地，还包括：
阳性对照品：副肠孤病毒3型标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针。
进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；94℃15sec、60℃30sec，45个循环。
进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为副肠孤病毒3型阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为副肠孤病毒3型阳性，否则判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
如上述的一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测副肠孤病毒3型病毒的试剂盒中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供了供了副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，更够快速、准确且灵敏地检测出副肠孤病毒3型、特异性强、灵敏度高，高达20拷贝。
2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出副肠孤病毒3型，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。本发明采用单管双荧光通道同时检测副肠孤病毒3型和内参基因Rnase P的存在，能检测脑脊液、咽拭子等标本中副肠孤病毒3型RNA的存在。当脑脊液、全血、血浆或鼻咽拭子中的存在反转录或者PCR抑制时，容易造成病毒核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”，针对这个难点与技术问题，本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增这整个过程进行质量监控，能监控RNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。
3、本发明提供了副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。
附图说明
图1是副肠孤病毒3型标准品扩增曲线；
图2是副肠孤病毒3型标准品浓度标准曲线；
图3是4例副肠孤病毒3型阳性标本的病毒荧光定量PCR扩增曲线；
图4是15份标本内参基因Rnase P扩增曲线；
图5是本发明试剂盒检测线性范围分析；
图6是5例副肠孤病毒3型阳性标本扩增曲线；
图7是18份标本内参基因Rnase P扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1试剂盒的开发
本发明在对副肠孤病毒3型核酸序列分析的基础上，选取副肠孤病毒3型特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时，选取Rnase P做内标基因，设计特异性引物和荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术可对副肠孤病毒3型进行检测。引物及探针序列见表1。
表1
试剂盒中还包括阳性对照：副肠孤病毒3型标准品；阴性对照：RNase Free H2O；内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；5×PCR Buffer和Enzyme Mix。其中5×PCRBuffer和Enzyme Mix的配制如下：
5×PCR Buffer配制：
配置混合后于冰箱-20℃保存；
Enzyme Mix配制：
配置混合后于冰箱-20℃保存。
本实施例中还提供了副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测方法，如下：
(1)病毒核酸的提取
①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；
②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；
③将标本(如脑脊液、鼻咽拭子等)取200μl加入此管中，加入5μl内标溶液，充分混匀；
④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；
⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；
⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；
⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；
⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次；
⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；
⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50μl RNase-free H2O，室温静置2min；12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸；
按上述方法提取15份疑似副肠孤病毒3型感染病人疱疹液标本的核酸。
(2)实时荧光定量PCR扩增(每份25μl体系)
取5μl RNA作为模板，同时加入20μl PCR反应液(荧光定量PCR反应液的配制体系如表2所示)至八联管中进行荧光定量PCR扩增。
表2 PCR反应液的配制体系
(3)实时荧光定量PCR反应程序为：40℃15min；95℃5min；94℃15sec、60℃30sec，45个循环。从60℃步骤开始收集荧光信号。本实施例使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。
(4)得到实时荧光定量PCR扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为副肠孤病毒3型阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为副肠孤病毒3型阳性，否则判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
其中，副肠孤病毒3型标准品扩增曲线如图1所示；副肠孤病毒3型标准品浓度标准曲线如图2所示，标准浓度曲线方程为：y＝-3.37x+48.41，其中x是浓度的log值，y是Ct值。
用上述方法检测疑似副肠孤病毒3型感染病人疱疹液标本15份，检测出副肠孤病毒3型阳性4例。图3是4例副肠孤病毒3型阳性标本的病毒荧光定量PCR扩增曲线，根据这4例阳性结果的所述Ct值结合标准曲线方程，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这4例副肠孤病毒3型阳性标本的病毒浓度，具体结果见表3。同时，15份标本的内参基因RnaseP扩增曲线正常，如图4所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表3 4例副肠孤病毒3型阳性标本病毒浓度
| 样品编号 | Ct值 | 副肠孤病毒3型浓度(拷贝/mL) |
| 样品1 | 25.67 | 4.46×10<sup>5</sup> |
| 样品2 | 29.18 | 4.02×10<sup>4</sup> |
| 样品3 | 31.36 | 6.99×10<sup>3</sup> |
| 样品4 | 22.37 | 4.12×10<sup>7</sup> |
实施例2副肠孤病毒3型的实时荧光PCR试剂盒的性能测定
1.准确性验证
病毒核酸检测的金标准是基因组测序，将此试剂盒的检测结果与病毒基因组测序做比较，分析其准确性。本实施例选取了基因组测序确定为副肠孤病毒3型的20例标本，用本发明提供的试剂盒检测后结果如下表4。由结果可见，20份阳性标本全部被检出，表明本发明提供的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR的准确性为100％。
表4本发明的准确性分析
| 病毒型别 | 例数 | 测序阳性 | 此方法阳性 | 准确率 |
| 副肠孤病毒3型 | 20 | 20 | 20 | 100％ |
2.特异性验证
试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了20种常见病原体阳性标本，结果如下表5。经检测，此发明对20种常见病原体阳性标本无扩增，表明本发明提供的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR的特异性为100％。
表5本发明的特异性分析
| 阳性病原体 | 是否有扩增 | 是否有扩增 | |
| 腺病毒 | 无 | 人嗜T细胞病毒 | 无 |
| 巨细胞病毒 | 无 | 人疱疹病毒6型 | 无 |
| 甲型流感病毒 | 无 | 卡波西肉瘤病毒 | 无 |
| 乙型流感病毒 | 无 | 金黄色葡萄球菌 | 无 |
| 乙型肝炎病毒 | 无 | 大肠杆菌 | 无 |
| 丙型肝炎病毒 | 无 | 鲍曼不动杆菌 | 无 |
| EB病毒 | 无 | 铜绿假单胞菌 | 无 |
| 人单纯疱疹病毒1型 | 无 | 白色念珠菌 | 无 |
| 人单纯疱疹病毒2型 | 无 | 耶氏肺孢子菌 | 无 |
| HIV-1 | 无 | 曲霉 | 无 |
3.灵敏度检测
灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，本实施例将副肠孤病毒3型的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表6。经验证，在20拷贝/ml浓度时，检出率为100％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR的灵敏度为20拷贝/mL。
表6本发明的灵敏度分析
4.精确性检测
精确性是指相同阳性样本多次检测，结果判读的一致性，以变异系数(CV)小于5判定为精确性良好。本实施例在每个浓度梯度分3次检测了30份阳性标本，结果如下表7所示。经验证，在20～1×107拷贝范围内，此发明的批内CV<5％，精密度良好；在20～1×106拷贝范围内，此发明的批间CV<5％，精密度良好。
表7本发明的精确性分析
5.线性范围分析
本实施例分析了在10、20、50、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108拷贝/ml范围内，此发明的线性范围，结果如下图5所示，此发明提供的副肠孤病毒3型的实时荧光定量PCR的线性范围为20～1×107拷贝/ml呈良好的线性范围。
实施例3临床检测
用上述方法对另外疑似副肠孤病毒3型感染病人咽拭子标本18份进行检测，其中副肠孤病毒3型病毒检测结果阳性5例，病毒荧光定量PCR扩增曲线见图6，根据这5例阳性结果的Ct值结合扩增曲线，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这5例副肠孤病毒3型病毒阳性标本的病毒浓度，具体结果见表8。同时，这18份咽拭子标本的内参基因Rnase P扩增曲线正常，如图7所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表8 5例副肠孤病毒3型病毒阳性标本病毒浓度
| 样品编号 | Ct值 | 副肠孤病毒3型浓度(拷贝数/mL) |
| 样品1 | 37.01 | 2.06×10<sup>2</sup> |
| 样品2 | 34.68 | 9.95×10<sup>2</sup> |
| 样品3 | 35.10 | 7.47×10<sup>2</sup> |
| 样品4 | 30.53 | 1.63×10<sup>4</sup> |
| 样品5 | 32.34 | 4.82×10<sup>3</sup> |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东龙帆生物科技有限公司
<120> 一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(HPeV3-F)
<400> 1
agttagtcac accagagttg acaac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(HPeV3-R)
<400> 2
aagcaaaaaa ctgtgacrac atgcc 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(HPeV3-FAM)
<400> 3
cgtgacttct catgatttta acaatgggga 30
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P-F)
<400> 4
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P-R)
<400> 5
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Rnase P- HEX)
<400> 6
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
Claims (7)
1.一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括副肠孤病毒3型特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ IDNO.4-6。
2.一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
3.根据权利要求2所述的一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：
阳性对照品：副肠孤病毒3型标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
4.一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；94℃15sec、60℃30sec，45个循环。
6.根据权利要求4所述的一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为副肠孤病毒3型阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为副肠孤病毒3型阳性，否则判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为副肠孤病毒3型阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
7.如权利要求1所述的一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测副肠孤病毒3型病毒的试剂盒中的应用。
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Cited By (1)
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- 2019-11-29 CN CN201911201728.XA patent/CN110760618A/zh active Pending
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