CN101633964A - 一种甲型h1n1流感病毒rna检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒，根据荧光PCR技术原理，设计甲型H1N1流感病毒的特异引物和TaqMan探针，通过全自动荧光定量PCR检测仪进行检测，从而实现对甲型H1N1流感病毒RNA的定性检测。试剂盒以人上皮细胞中核糖核酸酶P(RNase P)基因为内标，对提取过程进行监控。本发明试剂盒检测样本为鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液。

Description

一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种流感病毒RNA检测试剂盒，特别涉及甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒。

背景技术：

流感病毒共有三个型别，即甲(A)、乙(B)和丙(C)型流感病毒。甲型流感病毒：感染哺乳动物(人类、猪、雪貂、马)以及鸟类。乙型流感病毒：只感染人类。它表面突起的只有一种蛋白质，较为简单。但蛋白质的顺序会有不同。乙型病毒爆发时也会引起地区流行，但是疾病的产生通常较甲型病毒温和。丙型流感病毒：只感染人类，并不会引起严重的疾病。

甲型流感病毒是一种分节段RNA病毒，共含有7条结构蛋白基因和1条非结构蛋白基因(NS)，结构蛋白分别为核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、HA、NA、PA、PB1和PB2，其中前4种蛋白为病毒粒体的组成成分，后三种蛋白均为功能性多聚酶，参与病毒基因的转录和复制，在病毒粒体中属于分子量最大但含量极少的蛋白。根据美国疾病预防控制中心和世界卫生组织公布的甲型H1N1流感病毒的基因组成信息，研究人员将甲型H1N1流感病毒的基因与之前医学界已经掌握的部分猪流感病毒的基因进行了对比，利用流感病毒信息库和快速分析平台，对已报道的22株在病毒序列进行分析，各地分离株的核苷酸序列的同源性达到99％以上，属于同一株病毒。对HA基因和NA基因进行分析，确认引起本次疫情的病原体属于A/H1N1亚型流感病毒。同时对整个病毒的8条基因进行进一步分析，发现此次流行的病毒株包含一种较为独特的基因片段组合，是来自北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体。

本次流行的流感毒株的HA基因核苷酸序列与早期从美国分离到的H1N2的猪流感病毒株的同源性达到93％以上，其中与印第安纳州的H1亚型猪流感病毒(A/Swine/Indiana/P12439/00(H1N2))具有95％的同源性。提示本次A/H1N1流感病毒的HA基因由北中美洲本地的猪流感病毒变异而来。

NA基因没有发生核苷酸缺失，其序列具有欧亚株系猪流感病毒的特征，同源性在90％以上的病毒都是来源于欧亚地区的H1N1猪流感病毒，其中与A/Swine/England/195852/92(H1N1)，A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1)的核苷酸同源性达到了94％。M基因的核苷酸序列也与欧亚株系的猪流感病毒的同源性最高，达到96％。提示NA和M基因来源于欧亚株系的猪流感病毒。

PB1、PB2、NP、NS基因的核苷酸序列与美韩等国分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96％；PA基因的核苷酸序列与美国本土分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96％。其中PB2和PA基因与2007年部分从南达科他州分离到的H3N2禽流感病毒的同源性也有96％。

这种来自北中美和欧亚两种猪流感病毒的混合体是一种新型的A/H1N1病毒，以前从未发现这种重组病毒在猪群中感染和流行，也从未在美国以及其它国家的猪流感和人流感病毒分离株中出现，人类从未感染过此类病毒，机体对该病毒缺乏免疫保护能力，从而显示出其较强的致病能力。

荧光PCR法即实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

TaqMan荧光探针的工作原理为：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

RT-PCR能准确检测到新甲型H1N1流感病毒多个特异性基因，区分出季节性H1N1流感病毒，适用于普通医务和检验检疫人员使用；多重RT-PCR检测试剂盒，能够多点、全面检测到新甲型H1N1流感病毒的多个特异基因，适用于流感监测机构和医院；实时RT-PCR检测试剂盒，能够对检测到的基因片段直接进行序列测定，在最短时间内得出准确结果。

本发明通过甲型H1N1流感病毒RNA的检测，以辅助判定流感样症状病例是否感染甲型H1N1流感病毒。

发明内容：

本发明提供一种甲型H1N1流感病毒RNA的检测试剂盒。

本发明的试剂盒，包括8种试剂，这8种试剂如下：

H1N1反应液FluA，H1N1反应液SWH1，H1N1反应液SWFluA1，内标反应液RNP，DNA聚合酶，逆转录酶，H1N1阳性对照试剂，H1N1阴性对照试剂。本发明的试剂盒，8种试剂分别包装，优选使用包装管，每个包装管中装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

本发明的试剂盒，优选的组成如下：

H1N1反应液FluA            1.0ml/管

H1N1反应液SWH1            1.0ml/管

H1N1反应液SWFluA          11.0ml/管

内标反应液RNP             1.0ml/管

DNA聚合酶                 200μl/管

逆转录酶                  68μl/管

H1N1阳性对照              100μl/管

H1N1阴性对照              1.0ml/管

其中4种反应液优选的组成如下：

(1)H1N1反应液(FluA)

(2)H1N1反应液(SWH1)

(3)H1N1反应液(SWFluA1)

(4)内标反应液(RNP)

本发明的试剂盒，4种反应液中涉及的引物和探针的核苷酸序列如下：

本发明的试剂盒，各试剂配制方法如下：

1.H1N1反应液(FluA)的制备

1.1引物和探针代码和核苷酸序列

1.2根据已知的FluA样本的DNA序列，采用现有常规技术制备FluA引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

1.3按照如下比例配制H1N1反应液(FluA)。

1.4将配置好的H1N1反应液(FluA)按照每管1ml进行分装。

2.H1N1反应液(SWH1)的制备

2.1引物和探针代码和核苷酸序列

2.2根据已知的SWH1样本的DNA序列，采用现有常规技术制备SWH1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

2.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWH1)。

2.4将配置好的H1N1反应液(SWH1)按照每管1ml进行分装。

3.H1N1反应液(SWFluA1)的制备

3.1引物和探针代码和核苷酸序列

3.2根据已知的SWFluA1样本的DNA序列，采用现有常规技术制备SWFluA1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

3.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWFluA1)。

3.4将配置好的H1N1反应液(SWFluA1)按照每管1ml进行分装。

4.内标反应液(RNP)的制备

4.1引物和探针代码和核苷酸序列

4.2根据已知的RNP样本的DNA序列，采用现有常规技术制备RNP引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

4.3按照如下比例配制H1N1反应液(RNP)。

4.4将配置好的H1N1反应液(RNP)按照每管1ml进行分装。

5.DNA聚合酶和逆转录酶的制备

均为外购成品试剂，DNA聚合酶按照200μl/管进行分装，逆转录酶按照68μl/管进行分装。

6.H1N1阴阳性对照品的制备

6.1阳性对照品

提取甲型H1N1流感病毒的全基因组RNA，用DEPC水稀释至1×10⁴拷贝/ml。经过5次反复测定，Ct值在20-25之间，作为试剂盒阳性对照。按照100μl/管进行分装。

6.2阴性对照品

用试剂盒的反应液对DEPC水进行20复管测定，每管的CT值都为40，，所以本试剂盒的阴性对照选择DEPC水。按照1.0ml/管进行分装。

7.按照本发明试剂盒的组成进行成品组装、贴签。

本发明的试剂盒，其使用方法如下：

【适用仪器】全自动荧光定量PCR检测仪。

【样本要求】鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液。样本采集后如不立即进行检测，应于-65℃以下贮存，运输时加干冰冷冻。

本发明的试剂盒针对的是如下病症患者：急性发热(体温≥37.5℃)呼吸道感染患者(部分患者可伴有腹泻、恶心、呕吐等消化道症状)，并具有以下流行病学史中的任何一项：

(1)发病前7天曾与疑似、临床诊断或确诊甲型H1N1流感患者密切接触，包括照顾患者、与患者共同居住或直接接触过其呼吸道分泌物或体液，与患者有过近距离(2米内)接触(如与患者说话时，患者打喷嚏、咳嗽等)，以及其他可能接触过患者呼吸道分泌物或体液污染的环境或物体的情形；

(2)居住在确诊病例发生的社区或村庄；

(3)发病前7天曾到过有甲型H1N1流感流行的国家或地区。

【检验方法】

1.核酸提取：

取不少于200μl鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液样本进行核酸提取。病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等微量病毒RNA提取试剂盒，并按相应说明书操作要求进行。

本品中的H1N1阴性对照和H1N1阳性对照不参与核酸提取。

2.PCR扩增：

(1)实验设计：

A.检测标本：每份样本均需同时使用本品的4种反应液分别进行检测。

B.对照品检测：每次试验都应设置H1N1阴性对照和H1N1阳性对照，H1N1阴性对照和H1N1阳性对照不做内标检测。

(2)反应体系的配制：

A.准备工作：将各种H1N1反应液溶解后振荡混匀，离心2000rpm 10秒，使管壁上沾有的H1N1反应液离心下来。

B.按照样本数量配制荧光PCR反应液，其中每一份样本的一种反应液体系配制如下：

(3)反应液分管：以20μl/管将反应液依次分装至0.2ml/PCR管中。

(4)加样：每管分别加入5μl待测样本RNA或阴性对照、阳性对照。

(5)扩增检测：荧光PCR扩增程序如下：

A.逆转录及变性：50℃30分钟，95℃3分钟；

B.预扩增：95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，共5个循环；

C.扩增及荧光收集：95℃10秒，55℃40秒，共40个循环，在55℃收集FAM荧光信号。(对于Lightcycler荧光PCR扩增仪，将变性温度由95℃改为93℃，其余条件不变；对于ABI系列荧光PCR仪：报告基团(reporter)设置为FAM。淬灭基团(Quencher)设置none，背景荧光(passive)设置为none)

【参考值(参考范围)】

每次试验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则试验结果不成立。

1.阴性对照无Ct值或Ct值为0。

2.阳性对照Ct值小于30。

【检验结果的解释】

1.选择F1(Fam)通道分析结果，基线范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰。阈值线高度应高于荧光背景和阴性对照或可根据具体情况进行调整，阴性对照无Ct值或0，阳性对照Ct值小于30为准。

2.本品中有四种反应液，用途如下：

(1)H1N1反应液(FluA)用于检测甲型流感病毒RNA。

(2)H1N1反应液(SWH1)用于检测甲型H1N1流感病毒RNA。

(3)H1N1反应液(SWFluA1)用于检测猪H1N1流感病毒RNA。

(4)内标反应液(RNP)用于对提取过程进行监控。

3.内标反应液(RNP)检测患者的鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物中RNA，而对于本品的H1N1阴性对照、H1N1阳性对照、非人体组织样本和稀释的RNA样本，内标反应液(RNP)检测结果不确定。

4.在阴性、阳性对照均成立的情况下，Ct值小于37.0时报告样本为该反应液检测呈阳性。

5.H1N1反应液(FluA)和内标反应液(RNP)检测结果均为阳性，同时H1N1反应液(SWH1)和H1N1反应液(SWFluA1)有一种或两种为阳性，则可以判断该检测样本为甲型H1N1流感患者样本，应及时送国家流感中心复核。

6.除内标反应液(RNP)检测外，其他三种反应液检测均为阴性，则不能判断为甲型H1N1流感患者样本。

【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，6个月。

本发明试剂盒的工作原理如下：

1.工作原理：

本产品根据核酸聚合酶链式反应原理(PCR)，通过设计甲型H1N1特异性TaqMan探针及配套引物组成的荧光PCR反应系统，实现对甲型H1N1核酸的检测。

2.试验设计：

试剂盒中包括三对针对流感病毒的检测引物和探针(FluA，SWH-FluA，和SWH1-1)，分别针对流感病毒M基因、NP基因及HA基因，用于甲型流感病毒、猪的H1N1亚型和此次的甲型H1N1的HA基因的区别。

M基因编码流感病毒的基质蛋白，是甲型流感病毒中高度保守的区域。同源性分析显示，在不同亚型的甲型流感病毒株(H1N1、H3N2、H5N1等)中，M基因的135-240区域高度保守，为引物(FluA)的靶扩增区及探针(FluA)的结合区(附件1&2)，可用于区别甲、乙、丙型流感病毒。

NP基因编码流感病毒的核蛋白，是病毒中主要的结构蛋白。对来源于猪、人、及禽类的H1N1病毒的NP基因序列的对比分析显示该基因中1312-1421区域的同源性较好，可作为引物(SWH-FluA)的靶扩增区及相应探针(SWH-FluA)的结合区域(附件1&2)，用于特异性的区分甲型流感病毒的H1亚型。

HA基因编码流感病毒的血凝素蛋白，与病毒的致病力相关。在不同物种(猪、人、及禽类)的H1N1病毒的同源性分析显示HA基因的772-881区域具有较高的保守性，作为引物(SWH1-1)的靶扩增区及相应探针(SWH1-1)的结合区(附件1&2)。引物SWH1-1作为甲型H1N1流感病毒的特异性引物之一，与引物SWH-FluA一起，保证了新型H1N1流感病毒检测的特异性。

3.引物探针设计原则：

PCR引物和TaqMan荧光探针设计时主要遵循下列原则：GC含量在30-80％之间，不能有连续出现的6个相同碱基；避免形成二级结构；扩增产物长度控制在75-200之间，引物Tm值比探针Tm值低10℃左右。

4.内标设计

本检测试剂盒是用于检测咽拭子、鼻拭子和鼻咽抽提物等呼吸道标本的检测，内标是一对针对人上皮细胞中核糖核酸酶P(RNase P)基因设计的引物探针，用于临床采集标本质量的控制。

本发明的试剂盒原材料的来源如下：

1.各种RNA模板：

阳性RNA模板：为提取的美国加利福尼亚(California CA)新型H1N1毒株的RNA。

特异性RNA：为提取的季节性流感(P35和H3N2)、B型流感病毒(B+)和高致病性禽流感(H5N1)四份特异性标本RNA。

2.PCR引物和荧光探针

使用多种分子生物学软件设计，经过反复的引物探针筛选试验验证，委托国内的专业DNA合成公司制备，PAGE纯或HPLC纯化。

共合成4套引物，分别命名为FluA、SWH1、SWFluA1和RNP。

3.DNA聚合酶和逆转录酶

DNA聚合酶和逆转录酶均为外购。

4.用于保存引物、探针、反应液及其他试剂所用的包装材料

使用低吸附、无RNase和DNase残留的一次性实验室耗材，进行荧光PCR扩增反应的反应管分别选用不同型号的全自动荧光定量PCR分析仪的专用耗材。

5.其他化学原料

均来自国产或进口试剂，为分析纯或优级纯。分子生物类试剂均为无核酸酶的分子生物专用试剂。

本发明的试剂盒的制备工艺研究：

1.研制过程中阳性模板的建立

1.1第一次引物探针筛选用RNA模板

使用QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit分别对地区H1N1型病毒和猪源H1N1以及美国加利福尼亚(California CA)甲型H1N1毒株进行抽提；同时对甲型H1N1RNA进行1000倍稀释，作为第一次引物探针筛选的模板，分装后于-70℃保存备用。

1.2第二次引物探针筛选用RNA模板

选取几种猪流感病毒和美国加利福尼亚(California CA)新型H1N1毒株分别提取的RNA，同时把新型H1N1毒株提取的RNA梯度稀释到10^-8作为第二次引物探针筛选用模板，分装后于-70℃保存。

1.3反应体系优化用RNA模板

经过对比研究，以美国加利福尼亚(California CA)新型H1N1毒株提取的RNA，用DEPC水梯度稀释作为PCR引物筛选的灵敏度模板及荧光PCR反应体系优化用模板。

2.PCR引物及探针的筛选

2.1PCR引物及探针的第一次筛选

本试验所使用的PCR引物和荧光探针由大连宝生物公司合成。均要求HPLC纯化，纯度在99％以上。到货时为引物或探针干粉，重新对干粉进行含量测定后方可使用。

由于针对M基因的引物及探针FluA，为甲型流感病毒的通用引物，故不在筛选范围内。针对HA基因和NP基因的引物/探针SWH-FluA及SWH1为针对此次新型H1N1流感病毒的特异性引物/探针，我们共设计了6组上下游引物及荧光探针，其中有SWH-FluA 4组和SWH1两组。使用1.1中制备的RNA模板，根据Ct值最小和荧光信号增幅最大原则进行筛选。初步筛选显示各个组合的特异性都很高，同时SWH1-1、SWH1-2、SW-FluA1、SW-FluA4的组合检测灵敏度较高，而SW-FluA2、SW-FluA3组合的检测灵敏度比较差。所以用SWH1-1、SWH1-2、SW-FluA1、SW-FluA4四组进入第二轮的筛选研究。

2.2PCR引物探针的第二次筛选

使用1.2中制备的RNA模板对初步筛选出的4组引物/探针的特异性及灵敏度进行进一步的筛选。第二次筛选结果显示SW-FluA4组合对H3N2毒株的特异性比较差，所以排除SW-FluA4组合，SWH1-1、SWH1-2两个组合的特异性和灵敏度都比较好，但是由于两个组合都是检测同一个基因(HA)位点，所以选择略优的SWH1-1组合作为试剂盒首选引物探针组合，SWH1-2作为备用引物探针组合。

2.3质控品的建立

取体外转录的甲型H1N1 RNA，用DEPC水稀释液进行10倍系列梯度稀释至5×10⁰稀释度，作为评价试剂盒灵敏度的质控品。分装后于-70℃保存备用。

取3株临床阳性标本，提取标本的全基因组，进行100倍稀释后分装作为阳性质控品。

取季节性流感、高致病性禽流感、B型流感等6份标本提起标本的全基因组100倍稀释后分装作为特异性质控品。

3.PCR荧光探针用量的优化

探针量主要决定了背景荧光的高低，为了保证体系的灵敏，一般探针用量控制在背景荧光在5F到20F之间(以rotor gene3000仪器检测为准)，通过对几组探针不同用量的本底荧光的检测，探针量在终浓度为4pmole的时候荧光本底控制的比较好，所以探针用量选择为0.8ul×5pmole/ul。

4.PCR引物用量的优化

用1.3稀释好的10^-4和10^-6RNA作为引物量优化的模板；分别对引物的上下游的用量在1-8pmol范围内进行梯度稀释优化结果进行第一次引物用量的优化，在使用美国加利福尼亚(California CA)甲型H1N1毒株抽提的RNA进行梯度稀释取(10^-6、10^-7、10^-8)作为第二次引物量优化的模板，对各组引物在第一次优化基础上进一步进行优化。

PCR引物用量优化的结果如下：

FluA组合上下游引物量为(0.8ul×5pmole/ul、0.8ul×5pmole/ul)。

SW-FluA1组合上下游引物量为(0.8ul×5pmole/ul、0.8ul×5pmole/ul)。

SWH1-1组合上下游引物量为(1.6ul×5pmole/ul、0.8ul×5pmole/ul)。

5.试剂盒线性范围和灵敏度的确定

人工合成甲型H1N1流感基因，并插入质粒载体pMD20，按试剂盒说明书，体外转录并纯化后，Multiskan spectrum紫外分光光度法进行定量，并根据分子量计算每μL的copy数。

使用DEPC水将体外转录甲型H1N1病毒RNA进行10倍系列梯度稀释，至5拷贝/ml，使用本试剂盒进行检测。结果显示，本试剂盒可检测出5×10⁷-5×10¹拷贝/ml的RNA假病毒，检测范围跨越7个数量级。其中最低可检测出浓度为5×10¹拷贝/ml的体外转录甲型H1N1病毒RNA。取5×10⁴-5×10⁰拷贝/ml做为灵敏度检测指标。

6.试剂盒对照品的研究

6.1阳性对照品

提取甲型H1N1流感病毒的全基因组RNA，用DEPC水稀释至1×10⁴拷贝/ml。经过5次反复测定，Ct值在20-25之间，作为试剂盒阳性对照。

6.2阴性对照品

用试剂盒的反应液对DEPC水进行20复管测定，每管的CT值都为40，，所以本试剂盒的阴性对照选择DEPC水。

7.质控品的建立

7.1阳性质控品

收集2份甲型H1N1流感病毒患者咽拭子样本，所提取的RNA经核酸序列测定确认后，取纯化的RNA用DEPC水进行适当稀释，经检测H1N1 RNA阳性，分别作为试剂盒阳性质控品(P1-P2)。按20μl/管分装冷冻保存。

7.2特异性质控品

收集季节性流感病毒RNA提取物2支、B型流感病毒RNA提取物1支、H5N1高致病性禽流感病毒RNA提取物1支，用DEPC水适当稀释，作为特异性质控品(N1-N4)，按20μl/管分装冷冻保存。

7.3灵敏度质控品

取体外转录甲型H1N1病毒RNA，使用DEPC水进行稀释至5×10⁵拷贝/ml、5×10³拷贝/ml、5×10²拷贝/ml和5×10¹拷贝/ml，分别编号L1-L4作为灵敏度质控品。同时用于对原料及半成品进行质控。

经过反复检测，L1-L3能稳定的落在Ct值19-23、24-27、28-33上，确定为企业灵敏度质控品，而L4波动较大，在不同实验室不同操作人员不同荧光PCR检测仪上结果波动较大，Ct值在33以上，有时出现阴性，由于本试剂在扩增中增加5个预循环，Ct值在33时相当于在38个PCR循环时的扩增情况，扩增效率已大大降低，因此L4不作为灵敏度参考。

7.4精密性质控品

取体外转录甲型H1N1病毒RNA，使用DEPC水进行稀释至1.0×10⁴拷贝/ml作为灵敏度质控品(J)。

经过5次重复检测，精密性质控品的Ct值的CV％＜10％。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1本发明甲型H1N1甲型流感RNA检测试剂盒的制备

本发明的试剂盒组成如下：

H1N1反应液(FluA)            1.0ml/管

H1N1反应液(SWH1)            1.0ml/管

H1N1反应液(SWFluA1)         1.0ml/管

内标反应液(RNP)             1.0ml/管

DNA聚合酶                   200μl/管

逆转录酶                    68μl/管

H1N1阳性对照                100μl/管

H1N1阴性对照                1.0ml/管

1.H1N1反应液(FluA)的制备

1.1引物和探针代码和核苷酸序列

1.2委托国内专业DNA合成公司制备FluA引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

1.3按照如下比例配制H1N1反应液(FluA)。

1.4将配置好的H1N1反应液(FluA)按照每管1ml进行分装。

2.H1N1反应液(SWH1)的制备

2.1引物和探针代码和核苷酸序列

2.2委托国内专业DNA合成公司制备SWH1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

2.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWH1)。

2.4将配置好的H1N1反应液(SWH1)按照每管1ml进行分装。

3.H1N1反应液(SWFluA1)的制备

3.1引物和探针代码和核苷酸序列

3.2委托国内专业DNA合成公司制备SWFluA1引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

3.3按照如下比例配制H1N1反应液(SWFluA1)。

3.4将配置好的H1N1反应液(SWFluA1)按照每管1ml进行分装。

4.内标反应液(RNP)的制备

4.1引物和探针代码和核苷酸序列

4.2委托国内专业DNA合成公司制备RNP引物和荧光探针，HPLC纯化，纯度在99％以上。

4.3按照如下比例配制H1N1反应液(RNP)。

4.4将配置好的H1N1反应液(RNP)按照每管1ml进行分装。

5.DNA聚合酶和逆转录酶的制备

均为外购成品试剂，DNA聚合酶按照200μl/管进行分装，逆转录酶按照68μl/管进行分装。

6.H1N1阴阳性对照品的制备

6.1阳性对照品

提取甲型H1N1流感病毒的全基因组RNA，用DEPC水稀释至1×10⁴拷贝/ml。经过5次反复测定，Ct值在20-25之间，作为试剂盒阳性对照。按照100μl/管进行分装。

6.2阴性对照品

用试剂盒的反应液对DEPC水进行20复管测定，每管的CT值都为40，，所以本试剂盒的阴性对照选择DEPC水。按照1.0ml/管进行分装。

7.按照本发明试剂盒的组成进行成品组装、贴签。

实施例2本发明甲型H1N1甲型流感RNA检测试剂盒对样本的检测

1.核酸提取：

取10份正常人咽拭子样本各300μl进行核酸提取。病毒RNA提取采用硅胶膜吸附法，并按相应成品说明书操作要求进行。

2.PCR扩增：

(1)实验设计：

A.检测标本：每份样本均需同时使用本品的4种反应液分别进行检测。

B.对照品检测：每次试验都应设置H1N1阴性对照和H1N1阳性对照，H1N1阴性对照和H1N1阳性对照不做内标检测。

(2)反应体系的配制：

A.准备工作：将各种H1N1反应液溶解后振荡混匀，离心2000rpm 10秒，使管壁上沾有的H1N1反应液离心下来。

B.按照样本数量配制荧光PCR反应液，其中每一份样本的一种反应液体系配制如下：

(3)反应液分管：以20μl/管将反应液依次分装至0.2ml/PCR管中。

(4)加样：每管分别加入5μl待测样本RNA或阴性对照、阳性对照。

(5)扩增检测：荧光PCR扩增程序如下：

A.逆转录及变性：50℃30分钟，95℃3分钟；

B.预扩增：95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，共5个循环；

C.扩增及荧光收集：95℃10秒，55℃40秒，共40个循环，在55℃收集FAM荧光信号。

3.试验结果

阴性对照Ct值为0，阳性对照Ct值19，试验有效。根据Ct值的判定方法，本试验的10份正常人咽拭子样本均为阴性。

实施例3本发明甲型H1N1甲型流感RNA检测试剂盒的临床试验结果

临床试验由四家省级CDC分别独立进行样本收集和检测，共对296例甲型H1N1流感患者呼吸道样本进行检测，对于62例甲型H1N1流感患者呼吸道样本，本发明试剂盒全部检出，阳性率100％。对于季节性流感样本和其他无流感症状样本的检测结果表明，本发明试剂盒特异性达到100％。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京金豪制药股份有限公司

<120>一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒

<140>2009101624285

<141>2009-08-04

<160>12

<170>

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaccratcct gtcacctctg ac       22

<210>2

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gggcattytg gacaaakcgt ctacg    25

<210>3

<211>24

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tgcagtcctc gctcactggg cacg    24

<210>4

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

acattcgaag caactggaaa    20

<210>5

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gtrttrcaat cgtggactgg    20

<210>6

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tccattgcga akgcatatct cgg    23

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tcmgacatgc gaacrgaagt t    21

<210>8

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gggttcgttg ccttttcgt    19

<210>9

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ccagaagatt tgtccttcca    20

<210>10

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

agatttggac ctgcgagcg    19

<210>11

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gagcggctgt  ctccacaagt    20

<210>12

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

ttctgacctg aaggctctgc gcg    23

Claims (10)

1、一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成如下：

H1N1反应液(FluA)                1.0ml/管

H1N1反应液(SWH1)                1.0ml/管

H1N1反应液(SWFluA1)             1.0ml/管

内标反应液(RNP)                 1.0ml/管

DNA聚合酶                       200μl/管

逆转录酶                        68μl/管

H1N1阳性对照                    100μl/管

H1N1阴性对照                    1.0ml/管。

2、权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含4种反应液，每种反应液的组分及组成比例为：

(1)H1N1反应液(FluA)

(2)H1N1反应液(SWH1)

(3)H1N1反应液(SWFluA1)

(4)内标反应液(RNP)

3、权利要求1的试剂盒，其特征在于，4种反应液含有3个检测引物和探针，1个内标检测引物和探针，引物和探针的代码和核苷酸序列为：

4、权利要求1的试剂盒，其特征在于，通过设计甲型H1N1流感病毒特异性Taqman探针及配套引物组成的荧光PCR反应系统，实现对甲型H1N1流感病毒的检测。

5、权利要求1的试剂盒，其特征在于，试剂盒以人上皮细胞中核糖核酸酶P(RNase P)基因为内标，对提取过程进行监控。

6、权利要求1的试剂盒，其特征在于，检测样本为鼻拭子、咽拭子和鼻咽吸取物悬浮液，并进行核酸提取。病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等微量病毒RNA提取试剂盒。

7、权利要求1的试剂盒，其特征在于，检验过程中荧光PCR扩增程序为：

(1)逆转录及变性：50℃30分钟，95℃3分钟；

(2)预扩增：95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，共5个循环；

(3)扩增及荧光收集：95℃10秒，55℃40秒，共40个循环，在55℃收集FAM荧光信号。(对于Lightcycler荧光PCR扩增仪，将变性温度由95℃改为93℃，其余条件不变；对于ABI系列荧光PCR仪：报告基团(reporter)设置为FAM。淬灭基团(Quencher)设置none，背景荧光(passive)设置为none。

8、权利要求1的试剂盒，其特征在于，通过荧光PCR反应的Ct值来判定样本为某一反应液检测结果的阴阳性。每次试验应设置阳性对照和阴性对照，阴性对照无Ct值或Ct值为0，阳性对照Ct值小于30，在阴性、阳性对照均成立的情况下，Ct值小于37.0时报告样本为该反应液检测呈阳性。

9、权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，判定样本是否甲型H1N1流感样本的方法是：H1N1反应液(FluA)和内标反应液(RNP)检测结果均为阳性，同时H1N1反应液(SWH1)和H1N1反应液(SWFluA1)有一种或两种为阳性，则可以判断该检测样本为甲型H1N1流感患者样本。

10、权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于，针对的是如下病症患者：

急性发热(体温≥37.5℃)呼吸道感染患者(部分患者可伴有腹泻、恶心、呕吐等消化道症状)，并具有以下流行病学史中的任何一项：

(1)发病前7天曾与疑似、临床诊断或确诊甲型H1N1流感患者密切接触，包括照顾患者、与患者共同居住或直接接触过其呼吸道分泌物或体液，与患者有过近距离(2米内)接触(如与患者说话时，患者打喷嚏、咳嗽等)，以及其他可能接触过患者呼吸道分泌物或体液污染的环境或物体的情形；

(2)居住在确诊病例发生的社区或村庄；

(3)发病前7天曾到过有甲型H1N1流感流行的国家或地区。