CN102230023A

CN102230023A - 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN102230023A
Application number: CN2011101493337A
Authority: CN
Inventors: 张严峻
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-06-04
Filing date: 2011-06-04
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2031-06-04
Also published as: CN102230023B

Abstract

本发明提供了一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷混合物，MgCl₂，RNA酶抑制剂，莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶，DNA聚合酶、流感病毒标准品、对照品。本发明是在目前流行的甲型H1N1流感病毒序列分析的基础上，提供的一种多重荧光定量PCR的分子生物学快速、特异、准确、灵敏的基因诊断方法与诊断试剂盒，可以1个反应管2个小时同时检测区别甲型流感病毒或乙型流感病毒，完善流感检测。

Description

双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

2009年3月18日以来，墨西哥发生了人感染甲型H1N1流感病毒暴发疫情。自墨西哥2009年4月13日出现第1例人感染甲型H1N1流感病毒的死亡病例以来，至5月5日全球已有21个国家经实验室检测确认存在甲型H1N1流感病例，总感染人数上升至1124例，其中死亡人数26例。除墨西哥与美国外，许多国家都报告了甲型H1N1的确认病例。为此，世界卫生组织（WHO）在将全球流感大流行的警告级别提升到4级，4月29日又进一步提高到5级，这意味着在世卫组织六个管辖区域的一个中，至少有两个国家出现了病毒的人际传播，虽然在此阶段大多数国家不会受到影响，但宣布进入第五级是一个强烈的信号，表明大流行迫在眉睫，充分体现了世界卫生组织对这次新型流感流行的重视程度。

在自然界，流感病毒在人以及猪和马等动物，尤其是鸟类中间持续流行。目前，在全球范围内猪群中已造成世界性流行的猪流感病毒血清型仅有H1N1、H1N2、H3N2三种。猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，常引起猪的急性呼吸道疾病爆发，其病原猪流感病毒也是甲型流感病毒的成员。猪呼吸道上皮细胞上既有禽流感病毒的受体，唾液酸a-2，3-半乳糖苷（SA a 2，3Gal）又有人流感病毒的受体唾液酸a-2，6-半乳糖苷（SA a 2，6Gal）。因此，猪群在储存流感病毒、诱导流感病毒新亚型出现的环节上起到了重要作用。

有专家对近三十多年来猪流感病毒的重配进行研究，认为从1970年起，在美国的猪群中就已经分离到含有古典猪流感病毒和人流感病毒的重配猪流感病毒，在欧洲和亚洲的猪群中也分离人流感病毒与禽流感病毒的重配毒株，且这些重配病毒在欧洲和亚洲的猪群中持续存在。1984年，在欧洲和亚洲出现的大规模猪流感，很可能也是人源H3N2与禽源H1N1病毒基因片段在猪体内进行重配的结果。此外，自1998年起，猪群中三源重配的H3N2病毒在美国广泛流行，该病毒同时含有人流感病毒的HA、NA和PB1基因，北美禽病毒的PB2和PA基因，以及古典猪病毒的NP、M和NS。

猪流感除了对养猪业的影响之外，最突出的流行病学特点是它具有同时感染人和禽的能力，因此猪流感病毒除具有畜牧业传染病上的意义外，在人类的流感流行中也具有重要的公共卫生意义。流行于猪群中的流感病毒有的具有在人体上复制的能力，这就增加了新流感病毒经猪重配后传播给人类的可能性。因此，许多学者认为，猪体内的流感病毒是人类流感病毒的潜在来源，下一次人类流感大流行的流行株基因中，将会有现今流行于猪群中的流感病毒片段，对猪群中的人、猪、禽流感病毒基因的监测，有可能对人类下一次流感大流行的毒株进行预测。一旦这类重配病毒具有较强的传染性、致病性，并能感染人类，就有可能引起新的世界性流感大流行，这次墨西哥发生的新型甲型（H1N1）流感，也具有这种特点。

在流行后期间，流感的活动可能恢复到通常见到的季节性流感水平。此次甲型H1N1流感病毒流行有可能转而表现为季节性A型流感病毒。在此阶段，重要的是持续监测，这也对检测方法的改进和完善提出了更高的要求。

在4月30日公布针对本次甲型H1N1流感病毒的荧光定量检测方法后，近几天又有许多国家和地区公布了甲型H1N1流感病毒的基因序列。但众所周知，流感病毒是一种变异速率非常快的RNA病毒，自然界中像甲型流感病毒这样变异频繁，变异幅度大的生物是少有的，其变异可以通过抗原漂移与抗原转换这二种机制来实现。在流感病毒的8个基因中，HA变异最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HA1基因每年每个核苷酸变异的概率为3～4×10^-3，而细胞染色体DNA的突变率仅为10^-8-10^-10。而HA和NA基因正是甲型H1N1流感病毒检测的重要目标基因。虽然WHO的方法能够检测本次流行的流感病毒，由于流感病毒的高度变异性，同时还应考虑针对我国的猪源流感病毒的监测，因此从方法学的角度去完善流感病毒的检测还需要进行很多探索性工作。

鉴于包括人季节性流感、禽流感和甲型H1N1流感在公共卫生中的重要性与日俱增，所以在流感监测工作中同时要进行多种流感病毒的检测，费时费力而且浪费临床标本与试剂。

发明内容

本发明目的是提供一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒主要是针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

本发明多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含荧光定量RT-PCR反应液，甲型流感病毒标准品、乙型流感病毒标准品、对照品，其中荧光定量RT-PCR反应液管包含RT-PCR反应缓冲液管（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等）、两种病毒通用引物管（上下游引物同管装）、相应的两种荧光探针管和酶混合物管（含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶等）

所述双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：

上游引物甲型infA-FP: 5’- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3’

下游引物甲型infA-RP: 5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’

特异性探针甲型infA-P: 5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3’

上游引物乙型-FP: 5’-CCCACCRAGCAACAAACG-3’

下游引物乙型-RP: 5’-CCTTCCGACATCAGCTTCACT-3’

特异性探针乙型-P : 5’-CCCGGAACCCATCCCCGGA-3’

所述试剂盒流感病毒标准品序列如下：

甲型流感病毒：

Gaccaatcttgtcacctctgactaagggaattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccct

乙型流感病毒：

Cccaccaagcaacaaacgaacccggaacccatccccggaaagagcaactacaagcagtgaagctgatgtcggaagg 。

本试剂使用方法如下：

1.提取待测样品RNA，该步骤所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取；

2.以待测样品RNA为模板，RT-PCR 缓冲液为one step RT-PCR 缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one stepRT-PCR缓冲液。1×one step RT-PCR Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：HR-RT04-100。

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物甲型infA-FP: 5’- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3’

下游引物甲型infA-RP: 5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’

特异性探针甲型infA-P: 5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3’

上游引物乙型-FP: 5’-CCCACCRAGCAACAAACG-3’

下游引物乙型-RP: 5’-CCTTCCGACATCAGCTTCACT-3’

特异性探针乙型-P : 5’-CCCGGAACCCATCCCCGGA-3’

3.对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物对应的甲型和乙型流感检测的荧光结果均呈阳性，则待测样品含有甲型流感病毒和乙型流感病毒，如其中一个出现荧光检测结果呈阳性，则待检样本中含有阳性荧光对应的靶病毒。

所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50℃ 30min进行逆转录，，95℃ 5min然后95℃ 10s，58℃ 35s，在55℃进行双重荧光检测，共进行45个循环。

本发明的有益之处是提供了一种快速流感病原检测的方法，可快速、特异、准确、灵敏的检测区别甲型流感病毒或乙型流感病毒。按照相关规定，甲型H1N1流感病毒的细胞培养需在BSL-3实验室进行，这对生产各流感网络实验室的检测阳性参照增加了生物安全风险。本试剂盒完全符合此规定，进行安全而稳定的RNA阳性参照，增加了生物安全风险，完善流感检测。本发明试剂盒可以1个反应管2个小时检测区别甲型流感病毒或乙型流感病毒，实现在流感监测工作中同时要进行多种流感病毒的检测的目的，省时省力，而且节约临床标本与试剂。在目前流行的甲型H1N1流感病毒序列分析的基础上，建立多重荧光定量PCR的分子生物学的基因诊断方法与诊断试剂盒尤为重要，

附图说明

图1为荧光RT-PCR法检测甲型流感病毒的灵敏度；从1至6依次为10000000、1000000、100000、10000、1000、100copy。

图2为荧光RT-PCR法检测乙型流感病毒的灵敏度；从1至6依次为10000000、1000000、100000、10000、1000、100copy。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

1.材料与方法

病毒株与临床标本：

甲型H1N1、SWH1N1、季节性H1N1、季节性H3N1病毒株来源于浙江省疾病预防控制中心分离株。临床样本来源于近期浙江省甲型H1N1病毒爆发疫情疑似患者的咽拭子，样本采集后带冰运送到实验室。

1.2 引物与探针

从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的甲型H1N1、季节性H1N1、猪H1N1流感病毒毒株。对其进行了同源性比较，在所有流感病毒基因组HA基因区设计甲型H1N1特异性引物与Taqman探针，序列如下：

上游引物甲型infA-FP: 5’- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3’

下游引物甲型infA-RP: 5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’

特异性探针甲型infA-P: 5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3’

引物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.3 病毒定量标准与病毒RNA的提取：

以肠道病毒POLIO 3型为标准毒株，用人横纹肌瘤细胞（RD）进行病毒效价滴定（115.2TCID₅₀/ml）后作为参考株，将其稀释至1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA（10²ng/μL），备用。

1.4 荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

试剂盒：选用上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：HR-RT04-100，按说明书操作，反应体系为25 ，其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer 7.5 ul，Enzyme Mix 5 ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1 ，探针(10μmol/L) 0.5

, 模板RNA 2-3

，DEPC水补足25 。反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，58℃ 30s，在58℃进行单点荧光检测，共进行50个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。

1.5 荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

选择甲型H1N1、季节性H1N1、猪H1N1流感病毒毒株和近期浙江省爆发疫情确诊、疑似患者的咽拭子临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用甲型H1N1流感病毒荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID50的甲型流感病毒POLIO 3型（115.2TCID50/ml）稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。

2 结果

2.1 荧光RT-PCR反应体系及条件

选用上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：HR-RT04-100，按说明书操作，反应体系为25

，其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer 7.5 ul，Enzyme Mix 5 ul，上游与下游引物(10μmol/L)各1

，探针(10μmol/L) 0.5

, 模板RNA 2-3

，DEPC水补足25

。用Rotor-Gene6000荧光检测系统进行检测，反应参数为：反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃ 35s，在55℃进行双重荧光检测，共进行45个循环，可获得最低Ct值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光 RT-PCR方法对甲型流感病毒具有较好的特异性，近期流行的甲型H1N1流感患者的咽拭子也显示阳性反应。而与其他流感病毒如季节性H1N1、猪H1N1、H3N1、H5N1、H7N1、H9N1流感病毒等均无交叉反应。

2.3 敏感性试验

对甲型H1N1流感病毒POLIO 3型毒株，采用RD细胞进行病毒效价测定（115.2 TCID50/ml），然后稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50，提取病毒RNA，用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1TCID50，（参见图1）。

2.4重复性试验

甲型H1N1流感病毒毒株按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性（表1）。

。

2.5临床样本的检测

从近期浙江省各地报告的甲型H1N1流感爆发疫情疑似患者的脑脊液、粪便和疱疹液共100份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同时检测肠道病毒核酸，结果肠道病毒荧光RT-PCR方法检测出肠道病毒核酸阳性34份，普通RT-PCR法检测出EV71核酸阳性30份，本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测肠道病毒的阳性率高。本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，参见图2，显示的是部分临床样本的检测图谱。

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用

<160> 8

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据甲型流感病毒M蛋白序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 1

GACCRATCYT GTCACCTCTG AC 22

<210>2

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据甲型流感病毒M蛋白序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 2

AGGGCATTYT GGACAAAKCG TCTA 24

<210>3

<211>25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据甲型流感病毒M蛋白序列设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 3

AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA 23

<210> 4

<211> 506

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据甲型流感病毒M蛋白序列设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 4

Gaccaatcttgtcacctctgactaagggaattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccct 506

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型流感病毒NP蛋白序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 5

CCCACCRAGC AACAAACG 18

<210> 6

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型流感病毒NP蛋白序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 6

CCTTCCGACA TCAGCTTCAC T 21

<210> 7

<211>25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型流感病毒NP蛋白序列设计的TaqMan荧光定量检测探针序列

<400> 7

CCCGGAACCCATCCCCGGA 19

<210> 8

<211>506

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据乙型流感病毒NP蛋白序列设计的荧光定量检测标准品序列

<400> 8

Cccaccaagcaacaaacgaacccggaacccatccccggaaagagcaactacaagcagtgaagctgatgtcggaagg 506

Claims

1.一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含荧光定量RT-PCR反应液，甲型流感病毒标准品、乙型流感病毒标准品、对照品，其中荧光定量RT-PCR反应液含RT-PCR反应缓冲液、两种病毒通用引物、相应的两种荧光探针和酶混合物，所述RT-PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶，

上游引物甲型infA-FP: 5’- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3’

下游引物甲型infA-RP: 5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’

特异性探针甲型infA-P: 5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3’

上游引物乙型-FP: 5’-CCCACCRAGCAACAAACG-3’

下游引物乙型-RP: 5’-CCTTCCGACATCAGCTTCACT-3’

特异性探针乙型-P : 5’-CCCGGAACCCATCCCCGGA-3’ ；

甲型流感病毒标准品：

Gaccaatcttgtcacctctgactaagggaattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaa

乙型流感病毒标准品：

2.根据权利要求1所述的一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒在检测甲型流感病毒和乙型流感病毒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR反应条件为：50℃ 30min进行逆转录，95℃ 5min然后95℃ 10s，58℃ 35s，在55℃进行双重荧光检测，共进行45个循环。