CN110257558A - 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents

用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110257558A
CN110257558A CN201910532579.9A CN201910532579A CN110257558A CN 110257558 A CN110257558 A CN 110257558A CN 201910532579 A CN201910532579 A CN 201910532579A CN 110257558 A CN110257558 A CN 110257558A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
seq
virus
primer
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910532579.9A
Other languages
English (en)
Inventor
吴诗品
金宁一
李体远
李昌
杜寿文
田明尧
任琴
张星艳
王宇航
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Shenzhen Peoples Hospital
Original Assignee
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Shenzhen Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences, Shenzhen Peoples Hospital filed Critical Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority to CN201910532579.9A priority Critical patent/CN110257558A/zh
Publication of CN110257558A publication Critical patent/CN110257558A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒，上游引物具有如SEQ ID No.1、4、7、10、13所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.2、5、8、11、14所示的核苷酸序列；荧光探针具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15所示的核苷酸序列；经取代、缺失或添加一个或多个碱基且与所述核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；与所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；该组合及检测方法具备极高的灵敏度和特异性，与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，若推向临床，具有很好的应用前景。

Description

用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
流感病毒属正粘病毒科，病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，为单股负链RNA 病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8 个独立片段组成。流感病毒按照核蛋白和基质蛋白的不同可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。流感病毒主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。病毒传入人群后，传染性强并可迅速蔓延，传播速度和广度与人口密度有关。流感病毒感染导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。因此，做到甲型和乙型流感病毒的早诊断、早发现、早治疗十分关键。
季节性H1N1 流感是一种具有高度传染性的猪的急性呼吸道疾病，由几种猪A 型流感病毒中的一种引起。发病率高死亡率低（1-4%）。病毒在猪群中通过气溶胶、直接和间接接触传播，无症状携带病毒的猪也可传播。在温带地区，猪间疫情全年均可发生，但秋冬季节发病较多。一般来说，季节性流感病毒H1N1 存在种属特异性，只感染猪，但有时也能跨越种群屏障引起人类发病。人类通常从携带病毒的猪身上感染季节性流感病毒H1N1，然而，一些病例并没有猪接触史，或者未曾接触过猪所在的环境。在某些情况下已经发生了人-人传播，但仍局限在密切接触者以及与病人同处在封闭环境的人群中。人感染季节性流感病毒H1N1 后的症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。目前对人类健康造成重大威胁的主要是以AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9为代表的禽流感亚型病毒。这些病毒由于RNA聚合酶缺乏校正功能，容易发生变异和重排，毒力越来越强。
麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属，呈球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L 6个基因，分别编码6个结构和功能蛋白。麻疹是儿童最常见的急性呼吸道传染病之一，其传染性很强，在人口密集而未普种疫苗的地区易发生流行约2-3年发生一次大流行。临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎等而以皮肤出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑及疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。
近年来高致病性禽流感在世界各地的爆发呈上升趋势，不但严重危害禽类，也威胁哺乳动物，尤其是感染人类并致死，已对人类健康造成极大威胁，因此建立快速、准确的病毒检测手段至关重要。
目前对于呼吸道病毒感染的临床诊断，多以临床症状及流行病学资料作为依据，而确诊需用病毒分离培养、血清学检测及病毒核酸的分子生物学检测等实验室诊断。在这些方法中，基于荧光定量的病毒核酸检测最为常用。而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验（point-of-care testing, POCT），不能实现便携、可移动及现场快检的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒。具体的，本发明提供了一种快速、高效、高通量和高灵敏度检测甲型流感病毒和禽流感病毒H1、H3、H5、H7的方法以及检测试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
（1）、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（2）、下游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；和
（3）、荧光探针具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；或
（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合二：
（6）、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
（7）、下游引物具有如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；和
（8）、荧光探针具有如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；或
（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合三：
（11）、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
（12）、下游引物具有如SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；和
（13）、荧光探针具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；或
（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合四：
（16）、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
（17）、下游引物具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列；和
（18）、荧光探针具有如SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；或
（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合五：
（21）、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
（22）、下游引物具有如SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列；和
（23）、荧光探针具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或
（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3或麻疹病毒中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒检测的扩增程序为：
在上述研究的基础上，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括本发明所述的引物探针组合以及常用的助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3或麻疹病毒中的一种或多种。
此外，本发明还提供了呼吸道病毒的检测方法，取待测样本与所述的引物探针组合或所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。
本发明提供了一种引物探针组合，该组合及检测方法具备极高的灵敏度和特异性，与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，若推向临床，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例2中甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3以及麻疹病毒的特异性检测结果；其中，图1（A）示甲型流感病毒的特异性检测结果；图1（B）示乙型流感病毒的特异性检测结果；图1（C）示禽流感病毒H1的特异性检测结果；图1（D）示禽流感病毒H3的特异性检测结果；图1（E）示麻疹病毒的特异性检测结果；
图2示本发明实施例3中甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、H3以及麻疹病毒的灵敏度检测结果；其中，图2（A）示甲型流感病毒的灵敏度检测结果；图2（B）示乙型流感病毒的灵敏度检测结果；图2（C）示禽流感病毒H1的灵敏度检测结果；图2（D）示禽流感病毒H3的灵敏度检测结果；图2（E）示麻疹病毒的灵敏度检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、H3以及麻疹病毒的极速检测方法，包括如下步骤：
核酸提取（配合Hs480加热离心机使用）
1）取样品50μl加入5μl FastLyse L4，震荡混匀；
2）上机，选择相应程序，RUN；
3）离心结束后，取上清即为样品RNA，编号；
4）阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1）配制PCR 反应液：预先混合极速PCR buffer1（68μl）与极速PCR酶系（17μl）（比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡）；
2）各取5μl上述混合液分装至PCR反应管（15管）中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；（注意：使用前确保极速PCR buffer 1和引物探针混合液充分溶解）。
三、加样
1）取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2）取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加 样顺序如下：
01 甲型流感（阳性对照） 09 禽流感H1（待检样品RNA）
02 甲型流感（阴性对照） 10 禽流感H3（阳性对照）
03 甲型流感（待检样品RNA） 11 禽流感H3（阴性对照）
04 乙型流感（阳性对照） 12 禽流感H3（待检样品RNA）
05 乙型流感（阴性对照） 13 麻疹病毒（阳性对照）
06 乙型流感（待检样品RNA） 14 麻疹病毒（阴性对照）
07 禽流感H1（阳性对照） 15 麻疹病毒（待检样品RNA）
08 禽流感H1（阴性对照） 16 水
四、PCR扩增检测
1）将PCR扩增芯片插入Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择 Cy5通道。
本发明提供了一种用于同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、H3以及麻疹病毒极速检测方法和检测试剂盒。该方法利用其生产的基于微流控芯片技术和具有独特快速反应体系及创新性温控模块研制的极速荧光定量PCR仪，通过选择不同引物探针组合、优化反应条件、规范实验流程、建立质控标准，建立可同时检测五种流感病毒的快速检测技术平台。本发明具备极高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。
本发明提供的用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 重复性检测
以稀释10倍的各病毒阳性对照作为待检样品进行重复性检测，共重复检测5次。
一、核酸提取（配合Hs480加热离心机使用）
1）取样品50μl加入5μl FastLyse L4，震荡混匀；
2）上机，选择相应程序，RUN；
3）离心结束后，取上清即为样品RNA，编号；
4）阳性对照与阴性对照与待测样本同步进行处理。
二、PCR试剂配制
1）配制PCR 反应液：预先混合极速PCR buffer1（68μl）与极速PCR酶系（17μl）（比实际反应管数多2个，避免加样过程中发生损耗，混合时避免产生气泡）；
2）各取5μl上述混合液分装至PCR反应管（15管）中，分别加入2μl相应的引物探针，编号并充分混匀；（注意：使用前确保极速PCR buffer 1和引物探针混合液充分溶解）。
三、加样
1）取已处理好的样品RNA、阳性对照、阴性对照各3μl分别加入到相应的PCR反应管中；
2）取8μl终混合液垂直加入PCR扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。建议芯片加样顺序如下：
表1
01 甲型流感（阳性对照） 09 禽流感H1（待检样品RNA）
02 甲型流感（阴性对照） 10 禽流感H3（阳性对照）
03 甲型流感（待检样品RNA） 11 禽流感H3（阴性对照）
04 乙型流感（阳性对照） 12 禽流感H3（待检样品RNA）
05 乙型流感（阴性对照） 13 麻疹病毒（阳性对照）
06 乙型流感（待检样品RNA） 14 麻疹病毒（阴性对照）
07 禽流感H1（阳性对照） 15 麻疹病毒（待检样品RNA）
08 禽流感H1（阴性对照） 16 水
四、PCR扩增检测
1）将PCR扩增芯片插入Mokobio UltraFast LabChip Real-time PCR V280中进行扩增检测。
2)循环参数设定：
表2
3)仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM通道，内标荧光信号选择 Cy5通道。
五、结果
表3 重复性检测数据统计结果
共重复检测了五次，结果Ct值变异系数（CV）≤5%。
实施例2 特异性检测
分别以各病毒阳性对照作为待检样品进行特异性检测，检测方法同实施例1。
结果：各病毒阳性对照样品仅在对应的探针下呈阳性，其余均呈阴性，特异性较好，结果如图1所示。
实施例3 敏感性检测
将试剂盒中的各病毒阳性对照（浓度均为1×105copies/ml）梯度稀释至1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml和1×101copies/ml，制备好后以此作为待测样品用对应的试剂盒进行敏感性检测。
具体实施步骤同实施例1。
结果：甲型流感病毒试剂盒及禽流感病毒H1型检测试剂盒检测限不高于1×102copies/ml，乙型流感病毒、禽流感H3型病毒及麻疹病毒检测试剂盒检测限不高于1×101copies/ml。结果如图2所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 申请人
<120> 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒
<130> 案号
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agaccaatct tgtcacctct g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggcattttgg acaaagcgtc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcacgctcac cgtgcccagt g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtggaggatg aagaagatgg c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcgaattggc tttgratgtc ct 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atcctcaayt cactcttcga gcgtct 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atctaytcca cagtcgccag ttc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgacccatt rgarcacatc ca 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aarctgattg cccccaggga gacta 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cgaagcaaag cctacagcaa c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cggatgaggc aactagtgac c 21
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cttatgatgt gccggattat gcctccc 27
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gctggaaagg tcagttccac a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tctctgaaac aagccttgca t 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
catctgaact cggtatcacd gccga 25

Claims (10)

1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：
组合一：
（1）、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（2）、下游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；和
（3）、荧光探针具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；或
（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合二：
（6）、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和
（7）、下游引物具有如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；和
（8）、荧光探针具有如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；或
（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合三：
（11）、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和
（12）、下游引物具有如SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；和
（13）、荧光探针具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；或
（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合四：
（16）、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和
（17）、下游引物具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列；和
（18）、荧光探针具有如SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；或
（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；
组合五：
（21）、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和
（22）、下游引物具有如SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列；和
（23）、荧光探针具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或
（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为呼吸道病毒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3或麻疹病毒中的一种或多种。
6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒检测的扩增程序为：
。
7.病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物探针组合以及常用的助剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为呼吸道病毒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3或麻疹病毒中的一种或多种。
10.呼吸道病毒的检测方法，其特征在于，取待测样本与如权利要求1或2所述的引物探针组合或如权利要求7至9任一项所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。
CN201910532579.9A 2019-06-19 2019-06-19 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒 Pending CN110257558A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910532579.9A CN110257558A (zh) 2019-06-19 2019-06-19 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910532579.9A CN110257558A (zh) 2019-06-19 2019-06-19 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110257558A true CN110257558A (zh) 2019-09-20

Family

ID=67919472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910532579.9A Pending CN110257558A (zh) 2019-06-19 2019-06-19 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110257558A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112609025A (zh) * 2020-12-31 2021-04-06 上海基灵生物科技有限公司 一种用于检测犬呼吸多重病原体的核酸组合物及其试剂盒和方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1690220A (zh) * 2004-04-19 2005-11-02 中国人民解放军军需大学军事兽医研究所 禽流感病毒反转录聚合酶链式反应检测方法及试剂盒
US20060014140A1 (en) * 2002-12-19 2006-01-19 Guy Boivin Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
CN101443453A (zh) * 2006-04-11 2009-05-27 梅约医学教育与研究基金会 甲型流感病毒的检测
CN101921870A (zh) * 2009-06-17 2010-12-22 上海人类基因组研究中心 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒
CN102230023A (zh) * 2011-06-04 2011-11-02 浙江省疾病预防控制中心 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN107447046A (zh) * 2017-08-29 2017-12-08 无锡市疾病预防控制中心 一种快速鉴定甲型、乙型、h1n1‑2009、季h3亚型流感病毒四重荧光pcr方法
CN109576352A (zh) * 2018-11-25 2019-04-05 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060014140A1 (en) * 2002-12-19 2006-01-19 Guy Boivin Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
CN1690220A (zh) * 2004-04-19 2005-11-02 中国人民解放军军需大学军事兽医研究所 禽流感病毒反转录聚合酶链式反应检测方法及试剂盒
CN101443453A (zh) * 2006-04-11 2009-05-27 梅约医学教育与研究基金会 甲型流感病毒的检测
CN101921870A (zh) * 2009-06-17 2010-12-22 上海人类基因组研究中心 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒
CN102230023A (zh) * 2011-06-04 2011-11-02 浙江省疾病预防控制中心 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN107447046A (zh) * 2017-08-29 2017-12-08 无锡市疾病预防控制中心 一种快速鉴定甲型、乙型、h1n1‑2009、季h3亚型流感病毒四重荧光pcr方法
CN109576352A (zh) * 2018-11-25 2019-04-05 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冀林立: "实时荧光RT-PCR检测20份流感考核盲样", 《疾病监测与控制》 *
张洪英等: "RT-LAMP法快速检测人季节性流感病毒", 《分子诊断与治疗杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112609025A (zh) * 2020-12-31 2021-04-06 上海基灵生物科技有限公司 一种用于检测犬呼吸多重病原体的核酸组合物及其试剂盒和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fuller et al. Development of an L gene real-time reverse-transcription PCR assay for the detection of avian paramyxovirus type 1 RNA in clinical samples
CN103074450B (zh) 一种同步检测三十种腹泻致病菌的试剂盒及其检测方法
CN106399590A (zh) 呼吸道感染相关腺病毒的通用型核酸等温检测试剂
CN103074449B (zh) 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN107058628B (zh) 一种用于检测手足口病相关病原体的lamp引物组合物及其相关应用
CN108504775A (zh) 一种基于微流控芯片的检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法
CN105200049B (zh) 同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP快速检测试剂盒
CN102337351A (zh) 一种流感病毒分型检测试剂盒
CN108486282A (zh) 一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法
CN108384898A (zh) 用于检测呼吸道合胞病毒a、b型的试剂盒及其使用方法
CN109517927A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
CN105886667A (zh) 猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN103074447B (zh) 一种快速鉴别诊断不同血清型禽白血病病毒pcr-hrm分析方法的建立
CN108546786A (zh) 用于检测鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的试剂盒及其使用方法
Mo et al. Validation of specific quantitative real-time RT-PCR assay panel for Infectious Bronchitis using synthetic DNA standards and clinical specimens
CN108085413B (zh) 一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用
CN104694670A (zh) 猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用
CN107447054A (zh) 禽流感与新城疫双重微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒
CN105316431B (zh) 同时鉴别感染人的三种H5亚型禽流感病毒组合的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
CN110257558A (zh) 用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒
CN106435020B (zh) 用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒
CN108148890A (zh) 鸭新城疫、鸭瘟和鸭坦布苏病毒病的多重pcr检测引物
CN102337352B (zh) 一种pcr微阵列检测多种流感病毒的试剂盒
CN110257561B (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN105925729A (zh) 一种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190920