CN107447046A - 一种快速鉴定甲型、乙型、h1n1‑2009、季h3亚型流感病毒四重荧光pcr方法 - Google Patents

一种快速鉴定甲型、乙型、h1n1‑2009、季h3亚型流感病毒四重荧光pcr方法 Download PDF

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Abstract

一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1‑2009、季H3亚型流感病毒四重荧光PCR方法，属于生物工程技术领域。本发明选择在设计的单一引物和探针对流感病毒有典型扩增曲线前提下，分别将四种引物的上下游引物（40µM）按体积比1：1混合，四种探针（20µM）按体积比1：1混合，作为本发明的使用引物和探针；使用手工提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取流感样本的核酸（RNA）；进行Real‑time PCR检测；通过PCR扩增曲线分别以FAM通道Ct值、HEX通道Ct值、TEXAS RED通道Ct值、Cy5通道Ct值来判断流感样本为甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型各对应流感病毒的阳性或阴性。

Description

一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1-2009、季H3亚型流感病毒四重 荧光PCR方法
技术领域
一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1-2009、季H3亚型流感病毒四重荧光PCR方法
，属于生物工程技术领域。
背景技术
流感病毒（Influenza Virus）属于正粘病毒科，根据流感病毒内部核蛋白和基质蛋白的抗原性可以分为甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒只造成轻微的上呼吸道感染，甲型和乙型流感病毒则会导致很多严重的病症，包括下呼吸道感染，肺炎，脑膜炎等，每年全球季节性的流感暴发感染约6亿人，并导致25~50万人死亡。其中，甲型流感病毒对人类健康危害最为严重，除每年季节性暴发感染大量人群，偶尔的大流行更会造成灾难性的后果，如1918年的西班牙流感H1N1，全球累计死亡大约5000万人，1957年出现的甲型H2N2流感，H2N2流感只在人群中流行了11年，之后被H3N2（1968年）流感取代, 从人际消失。1968年出现的甲型H3N2流感一直到现在依然是我国的主要流行株。2009年首先在北美出现的甲型H1N1流感，随后此亚型流感病毒肆虐全球，取代了原来的季H1N1流感，直到现在H1N1(2009)依然是我国的主要流行株。这些甲型流感病毒每年都会以某一个亚型为优势株，偶有伴乙型流感病毒流行，这给国家和个人带来沉重的经济负担。
我国在2005年针对流感病毒建立监测网络，到2010年流感病毒网络实验室有411家，几乎覆盖每个省、市级疾控中心。目前的流感网络实验室的检测策略一般是先做甲/乙型流感病毒，如果有核酸阳性再进一步做季H3、H1N1(2009)或B（Victoria、Yamagata系）的分型。本实验室经过十几年的监测发现流感病毒在一个流行季只会出现一种优势株（流行株），不会出现季H3和H1N1(2009)同时流行，或者是B（Victoria）和B(Yamagata）同时流行。因此本发明旨在建立一种快速鉴定检测甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型流感病毒的方法。适合于流感病毒的监测，特别是学校、工厂流感暴发疫情的快速处置，可以准确、及时的锁定病原，排除其他感染。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1-2009、季H3亚型流感病毒四重荧光PCR方法，适合于流感病毒的监测，特别是学校、工厂流感暴发疫情的快速处置，可以准确、及时的锁定病原，排除其他感染。
本发明的技术方案：一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型流感病毒的四重荧光PCR方法，分别将浓度为40µM的四种引物的上下游引物按体积比1：1 混合，将浓度为20µM的四种探针按体积比1：1 混合，作为检测使用的引物和探针；使用手工提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取流感样本的核酸（RNA）；进行Real-time PCR检测；通过PCR扩增曲线分别以FAM 通道Ct值、HEX 通道Ct值、TEXAS RED 通道Ct值、Cy5 通道Ct值来判断流感样本为甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型各对应流感病毒的阳性或阴性；具体步骤为：
1、甲型流感探针的5’端标记的发光基团为FAM，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；乙型流感探针的5’端标记的发光基团为HEX，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；H1N1(2009)亚型流感探针的5’端标记的发光基团为TEXAS RED，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2；季H3亚型流感探针的5’端标记的发光基团为Cy5，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2；
2、在设计的单一引物和探针对流感病毒有典型扩增曲线前提下，分别将四种引物的上下游引物（40µM）按体积比1：1 混合，四种探针（20µM）按体积比1：1 混合，作为本发明的使用引物和探针；所用引物和探针如表1：
表1
3、使用手工提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取流感样本的核酸（RNA）；
4、检测的反应体系为25µL，包括：RT Mix 0.25µL，5 x PCR Master Mix 12.5µL，混合后的引物1µL，混合后的探针0.5µL，待检模版5µL，最后加RNase Free Water补充至25µL，待检模板为从流感样本中提取的RNA，RT Mix、5 x PCR Master Mix为QuantiTect Probe RT-PCR Kit试剂盒提供；
5、Real-time PCR检测反应程序为：50℃ 20min；95℃ 15min；95℃ 变性15sec，60℃1min，40个循环；单点荧光在60℃；
6、结果判断：
（1）当FAM 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为甲型流感病毒阳性；
当FAM 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为甲型流感病毒阳性；
当FAM 通道Ct >40 时，判断样本为甲型流感病毒阴性；
（因为甲型流感探针5’端标记的是FAM荧光，所以对应的荧光PCR仪上读结果时要选择FAM通道。依此类推，乙型流感选HEX通道，H1N1(2009)亚型选TEXAS RED通道，季H3亚型选Cy5 通道。）
（2）当HEX 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为乙型流感病毒阳性；
当HEX 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为乙型流感病毒阳性；
当HEX 通道Ct >40 时，判断样本为乙型流感病毒阴性；
（3）当TEXAS RED 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为H1N1(2009)流感病毒阳性；
当TEXAS RED 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为H1N1(2009)流感病毒阳性；
当TEXAS RED 通道Ct >40 时，判断样本为H1N1(2009)流感病毒阴性。
（4）当Cy5 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为季H3流感病毒阳性；
当Cy5 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为季H3流感病毒阳性；
当Cy5 通道Ct >40 时，判断样本为季H3流感病毒阴性。
本发明的有益效果：本发明采用Real-time PCR方法，具有如下优点：1）灵敏度高、特异性强、检测快速准确；2）节约了时间、减轻了人工负担、降低了成本；3）检测高通量，一次可检测四种病毒。
附图说明
图1 流感病毒PCR扩增曲线图。1：H1N1(2009)；2：H1N1(2009)的甲型；3：季H3的甲型；4：季H3；5：乙型Yamagata系；6：乙型Victoria系。
具体实施方式
实施例1
1、检测疑似流感病毒感染患者鼻咽拭子样本20 份，各取样本液200μL 用罗氏MagNAPure LC 2.0 全自动核酸提取仪进行病毒核酸提取。
2、所有试剂：QuantiTect Probe RT-PCR Kit 购自QIAGEN公司。
3、引物探针的设计和合成：选取甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型流感病毒基因的高度保守区，用Primer 5.0进行引物和探针的设计。甲型流感探针的5’端标记的发光基团为FAM，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；乙型流感探针的5’端标记的发光基团为HEX，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；H1N1(2009)流感探针的5’端标记的发光基团为TEXAS RED，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2；季H3亚型流感探针的5’端标记的发光基团为Cy5，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2。引物和探针均由上海生物工程有限公司合成，其中引物和探针都为HPLC级纯化。分别将四种引物的上下游引物（40µM）按体积比1:1混合，四种探针（20µM）按体积比1:1 混合，作为本发明的使用引物和探针，引物和探针的详细序列如表1。
表1
4、 Real-time PCR反应液配制如表2：
表2
RNase Free Water 5.75 µL
5 x PCR Master Mix 12.5 µL
混合后的上游引物 0.5 µL
混合后的下游引物 0.5 µL
混合后的探针 0.5 µL
RT Mix 0.25 µL
5、提取好的核酸5 µL 加入到上述的配制好的反应液中，总体积25µL；
6、使用LightCycle 480II 荧光定量PCR 仪进行检测，PCR 反应程序如下：
50℃ 20min；95℃ 15min；95℃变性15sec，60℃ 1min，40个循环；单点荧光在60℃；
7、结果判读：疑似流感病毒感染患者鼻咽拭子20份样本中检出甲型流感病毒阳性7例，季H3流感阳性4例，H1N1(2009)流感3例，乙型流感阳性1例。

Claims (1)

1.一种快速鉴定甲型、乙型、H1N1-2009、季H3亚型流感病毒四重荧光PCR方法，其特征在于分别将浓度为40µM的四种引物的上下游引物按体积比1：1 混合，将浓度为20µM的四种探针按体积比1：1 混合，作为检测使用的引物和探针；使用手工提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取流感样本的核酸RNA；进行Real-time PCR检测；通过PCR扩增曲线分别以FAM 通道Ct值、HEX 通道Ct值、TEXAS RED 通道Ct值、Cy5 通道Ct值来判断流感样本为甲型、乙型、H1N1(2009)、季H3亚型各对应流感病毒的阳性或阴性；具体步骤为：
（1）甲型流感探针的5’端标记的发光基团为FAM，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；乙型流感探针的5’端标记的发光基团为HEX，在3’端标记的淬灭基团为BHQ1；H1N1(2009)亚型流感探针的5’端标记的发光基团为TEXAS RED，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2；季H3亚型流感探针的5’端标记的发光基团为Cy5，在3’端标记的淬灭基团为BHQ2；
（2）分别将浓度为40µM的四种引物的上下游引物按体积比1：1 混合，将浓度为20µM的四种探针按体积比1：1 混合，作为检测使用的引物和探针；使用的引物和探针为：
FluA-F：5’-GRC CGA TCC TST CAC CTC TGA C-3’，
FluA-R：5’-GRG CAT TCT GGA CAA AGC GTC TAC G-3’，
FluA-P：5’-TGY AGT CST CGC TCR CTG GGC ACG-3’，
FluB-F：5’-TYC TCA ACT CRC TCT TYG AGC G-3’，
FluB-R：5’-RGG TGC YCT TGA CSA AAT TGG-3’，
FluB-P：5’-CCA RTT CRA GCA GYT GAA RCT GCG GTG-3’，
SWH1-F：5’-GSG TAG CYC CAT TGC RT-3’，
SWH1-R：5’-AGR GTG AYT CAC AYT CTG RAT TTC-3’，
SWH1-P：5’-TGR GTA AAY GTA ACA YTG CTG GKT GG-3’，
H3-F：5’-ASC CTC RGT GTG RTG GCT TYC AAA-3’，
H3-R：5’-TAA GRG AGG YAT AAT CMG GCA CAT-3’，
H3-P：5’-AYG AAG CRA AGC CTA CMG CAA CTG T-3’，
（3）使用手工提取试剂盒或全自动核酸提取仪提取流感样本的核酸RNA；
（4）检测的反应体系为25µL，包括：RT Mix 0.25µL，5 x PCR Master Mix 12.5µL，混合后的引物1µL，混合后的探针0.5µL，待检模版5µL，最后加RNase Free Water补充至25µL，待检模板为从流感样本中提取的RNA，RT Mix、5 x PCR Master Mix为QuantiTect Probe RT-PCR Kit试剂盒提供；
（5）Real-time PCR检测反应程序为：50℃ 20min；95℃ 15min；95℃ 变性15sec，60℃1min，40个循环；单点荧光在60℃；
（6）结果判断：
（ⅰ）当FAM 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为甲型流感病毒阳性；
当FAM 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为甲型流感病毒阳性；
当FAM 通道Ct >40 时，判断样本为甲型流感病毒阴性；
（ⅱ）当HEX 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为乙型流感病毒阳性；
当HEX 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为乙型流感病毒阳性；
当HEX 通道Ct >40 时，判断样本为乙型流感病毒阴性；
（ⅲ）当TEXAS RED 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为H1N1(2009)流感病毒阳性；
当TEXAS RED 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为H1N1(2009)流感病毒阳性；
当TEXAS RED 通道Ct >40 时，判断样本为H1N1(2009)流感病毒阴性；
（ⅳ）当Cy5 通道Ct ≤ 35 时，判断样本为季H3流感病毒阳性；
当Cy5 通道35<Ct ≤ 40 时，重复一次实验，如果Ct 还是在此范围之内就判断样本为季H3流感病毒阳性；
当Cy5 通道Ct >40 时，判断样本为季H3流感病毒阴性。
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