CN112501349B - 一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物及试剂盒 - Google Patents

一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物及试剂盒，所述引物组、探针组及试剂盒可实现一次反应同时检测多种引起消化系统感染的常见真菌和寄生虫，是目前最全面的儿童消化道真菌及寄生虫感染检测方法，效率高、特异性强，为临床检验提供辅助诊断的依据。通过本技术方案的公开，可以缓解现有技术中存在的对儿童消化道感染相关的真菌及寄生虫类病原体诊断研究尚有不足的技术问题。

Description

一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体 的引物探针组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于病原微生物分子生物学领域，具体涉及一种用于儿童消化道感染真菌及寄生虫类病原体系列检测和区分的引物探针组合及试剂盒，以及试剂盒的检测方法。
背景技术
消化道感染是一种常见疾病，在临床儿科中尤为多见，发病率呈逐年增高趋势，仅次于呼吸系统感染，位列儿科第二大多发病，多因细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原体感染导致。全年均可发病，真菌中常见的是毛霉菌（Muc）、白色假丝酵母菌（MoA）、隐孢子虫（Cryp）、环孢子虫（Cyc）、溶组织内阿米巴（EnHS）、蓝氏贾第鞭毛虫（Gial）。曲霉菌（As）、人芽囊原虫(BH)等，部分具有传染性，通常引起腹泻等临床病症。这些消化道真菌及寄生虫大都具有感染力强、治疗期长等特点。随着科技发展，越来越多的新的致病性消化道病原体被发现，给临床相关疾病的诊断和治疗造成极大的困难。
此外，消化道感染还会导致患儿营养不良，进而影响患儿的正常生长发育，在发展中国家此类影响尤为明显。因此，消化道病原体的感染和流行问题已引起世界各国的密切关注和高度重视。
及时准确地判断出消化道感染病原体的种类，对于传染源的早期发现、流行病的控制及临床治疗的有效开展均具有重要意义。
多年来，世界各地的医院及实验室均常规使用镜检法、病原体分离培养、免疫学检查等方法对消化道常见病原体进行检测，但这些检测方法都存在许多难以克服的缺陷。
直接镜检法准确性差、安全性存在明显不足；传统的病原体分离方法操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，实验安全性和结果准确性相对难以保证；消化道感染病原体免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点，但耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。
近年来，分子生物学技术如实时荧光PCR技术等的引入，很大程度上改善了检测和鉴定病原体的现状。普通荧光PCR检测具有较好的灵敏度和特异性，提高了临床鉴定水平，但实际应用过程中该技术多是针对单项或几项病原体，想要同步检测多种病原体就需要多种检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高。针对消化道感染病原体的特点，建立起高效、快速、简便、特异的检测方法，以适应疫情筛查和临床检测的需求，是当前消化道感染性疾病防治工作的重点，因而多重荧光定量PCR技术应运而生。
多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检，能够在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测。在临床病原体检测的应用中，可同步检测同一标本内几十种乃至上百种关联病原体，有利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题：（1）由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。（2）避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性结果。（3）每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增。（4）需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。
目前还没有可对以上儿童多种消化道感染真菌及寄生虫相关病原体进行同步PCR法检测的产品，并保证检测准确性和特异性的有效方法。本发明将是市面上最全面的儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体检测产品。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，根据统计学研究，提出一种用于8种儿童消化道感染相关的真菌及寄生虫病原体检测的引物、探针组合。真菌及寄生虫类病原体包括毛霉菌（Muc）、白色假丝酵母菌（MoA）、隐孢子虫（Cryp）、环孢子虫（Cyc）、溶组织内阿米巴（EnHS）、蓝氏贾第鞭毛虫（Gial）。曲霉菌（As）、人芽囊原虫(BH)。
本发明的第二个目的是提供上述病原体标志物的引物及探针。
本发明的第三个目的是提供上述标志物的引物探针组合在制备儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明提供的病原体标志物及其引物探针组合在制备用于诊断儿童消化道真菌及寄生虫感染的产品中的应用，可以缓解现有技术中存在的对消化道真菌及寄生虫感染相关的特定病原体诊断研究尚有不足的技术问题。
本发明的第四个目的是提供儿童消化道真菌及寄生虫感染的诊断或辅助诊断的试剂盒。以缓解现有技术中存在的对儿童消化道感染相关的真菌及寄生虫病原体标志物的检测特异性不强的技术问题。
一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物，包括：毛霉菌（Muc）的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；白色假丝酵母菌（MoA）的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5，探针序列如SEQ ID NO.6所示；隐孢子虫（Cryp）上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；环孢子虫（Cyc）上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；溶组织内阿米巴（EnHS）上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；蓝氏贾第鞭毛虫（Gial）上游引物序列如SEQ ID NO.16所示，下游引物序列如SEQ ID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；曲霉菌（As）上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQID NO.20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示；人芽囊原虫(BH) 上游引物序列如SEQ IDNO.22所示，下游引物序列如SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示；管家基因（IC）(BH) 上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ ID NO.27所示。
其中，所述毛霉菌（Muc）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述白色假丝酵母菌（MoA）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述隐孢子虫（Cryp）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述环孢子虫（Cyc）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述溶组织内阿米巴（EnHS）探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述蓝氏贾第鞭毛虫（Gial）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；曲霉菌（As）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；人芽囊原虫(BH)探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。管家基因(IC)探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
一种同步检测8种儿童多种消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒，包括上述引物探针组合物、病原体标志物标准品、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶。所述的病原体标志物标准品包括真菌病原体标志物标准品和寄生虫病原体标志物标准品。
进一步的，所述引物探针组合物中的引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述引物探针组合物中的TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。
进一步的，所述的试剂盒的检测样本为粪便。
进一步的，所述病原体标志物标准品的浓度为1013copies/ml。
进一步的，所述的试剂盒用于诊断或辅助诊断儿童消化道真菌及寄生虫感染。
本发明的有益效果：
本发明提供的真菌及寄生虫病原体标志物引物及探针组合通过实验发现在患有消化道感染的粪便中表达量显著，因此本发明中提供的真菌及寄生虫类病原体标志物组合可以作为标志物用于消化道真菌或寄生虫感染的风险预估与检测，具有灵敏度高、准确性强的优点，为消化道感染诊断提供了一定的应用价值，对我国儿童消化道感染的筛查、预防及治疗有较大的帮助。
另外，本发明还提供了用于诊断消化道真菌及寄生虫感染的试剂盒，包含相关试剂和使用说明。其引物特异性强，灵敏度高。可以定性检测的同时区分出儿童消化道的3种真菌和5种寄生虫，是目前最全面的儿童消化道感染真菌及寄生虫类病原体检测方法，检测快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床诊断和治疗。
附图说明
图1示出了1号反应管检测5×107 copies/ml至5×102 copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图1中，从左至右依次为5×107 copies/ml、5×106 copies/ml、5×105 copies/ml、5×104copies/ml、5×103copies/ml、5×102 copies/ml的参考品的扩增曲线。
图2示出了2号反应管检测5×107 copies/ml至5×102 copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图2中，从左至右依次为5×107 copies/ml、5×106 copies/ml、5×105 copies/ml、5×104copies/ml、5×103copies/ml、5×102 copies/ml的参考品的扩增曲线。
图3示出了3号反应管检测5×107 copies/ml至5×102 copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线其中，在图3中，从左至右依次为5×107 copies/ml、5×106 copies/ml、5×105 copies/ml、5×104copies/ml、5×103copies/ml、5×102 copies/ml的参考品的扩增曲线。
图4示出了1号、2号、3号反应管检测8份阴性参考品的扩增曲线。
具体实施方式
下该试剂盒由引物探针混合液、RT-PCR buffer、混合酶液、阳性质控品和无RNase水组成；RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl2；混合酶液包括HotStart Taq酶、逆转录酶和UNG酶；阳性质控品中含有对应消化道病原体的扩增基因序列的质粒或RAN颗粒。
所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。
该试剂盒的反应体系为30μL，具体为：核酸模板7μL、RT-PCR buffer20μL、混合酶液1μL和引物探针混合液2μL。
试剂盒的操作和结果判定：
(1) 将样品DNA/RNA共提取模板(从患儿粪便中提取)、无RNase水、阳性质控品各7μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20μL、混合酶液1μL和引物探针混合液2μL，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。
(2) 设置仪器中的PCR扩增反应的条件为：55℃逆转录15min；95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；40个循环。
(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。
(4)有效性判定：
无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；
(5)结果判读：
样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本DNA/RNA提取失败、待测样本中不含DNA/RNA或含量低于检测限；
样本检测孔Ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；
样本检测孔Ct值为35-40，需要复检一次，如果Ct值仍为35-40，则判断为阴性。
灵敏度验证：
采取6份线型灵敏度样本（浓度分别为5×107 copies/ml、5×106 copies/ml、5×105 copies/ml、5×104copies/ml、5×103copies/ml、5×102 copies/ml）对试剂的线性进行验证。检测结果见图1、2、3。
由图1、2、3可以看出，1号、2号、3号反应管检测线型灵敏度样本均为阳性，试剂的线性良好，最低检测下限达到5×102 copies/ml。
特异性验证：
分别检测8份与本试剂盒不涵盖的消化道病原体阴性样本，实验结果见图4。
由图4可以看出，1号、2号、3号反应管检测8份阴性样本无扩增曲线，皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。
各反应管组合如表1所示：
表1
通道 FAM ROX HEX/VIC CY5
1号反应管 白色假丝酵母菌 隐孢子虫 人芽囊原虫 管家基因
2号反应管 毛霉菌 蓝氏贾第鞭毛虫 环孢子虫 管家基因
3号反应管 曲霉菌 溶组织内阿米巴 管家基因
探针引物序列如表2所示：
表2
名称 通道 F R 探针
白色假丝酵母菌 FAM GCCAGAATCATTGCTGCTGTTC CTGGAGTGAATCTACCAGCAATGG GGTCAAAGAGCTGTTTTGAAATTTGCTGC
隐孢子虫 ROX TGGTGATTCATAATAACTTTACGGAT AATACCCTACCGTCTAAAGCTG TGACATATCATTCAAGTTTCTGACC
人芽囊原虫 HEX ATAATAATTGAAGGCTTTCGT ATAAATCCGAGAATTTCACCT GGAACAGTTGGGGGTATTCA
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA
毛霉菌 FAM CCACGCAATCAGGAATTTCA CTTTAGGCAATCCCTCAAAACG CGTCCATGTTACTGTGTAACTGCCTT
蓝氏贾第鞭毛虫 ROX GAACCTCAAGACGCGCTA TTTATTTTCTTAACTTGGGCTC CGGCGGAACCCTTTTTTGCGC
环孢子虫 HEX GGGCATTCGTATTTAACTGTCA TTTCCCTATCTCTAGTCGGCAT GTTAAAGACGAACTACTGCGAAAG
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA
曲霉菌 FAM CATGCCTGTCCGAGCGTCA CGAGGTCACCTTAAGAAGTGGGT CCTCAAGCACGGCTTGTGTGT
溶组织内阿米巴 ROX GATCAGATACCGTCGTAGTCCT TTAAGTTTCAGCCTTGTGACCA CGATGTCAACCAAGGATTGGATG
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。
序列表
<110> 爱科睿特生物医疗科技（南京）有限公司
<120> 一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物及试剂盒
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcttctcctt aatgtcacgc a 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cggctacagc ttcaccacca 20

Claims (6)

1.一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物，其特征在于：包括：毛霉菌的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；白色假丝酵母菌的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5，探针序列如SEQ ID NO.6所示；隐孢子虫上游引物序列如SEQID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；环孢子虫上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQID NO.12所示；溶组织内阿米巴上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；蓝氏贾第鞭毛虫上游引物序列如SEQ IDNO.16所示，下游引物序列如SEQ ID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；曲霉菌上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，探针序列如SEQ IDNO.21所示；人芽囊原虫上游引物序列如SEQ ID NO.22所示，下游引物序列如SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示；管家基因上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ ID NO.27所示。
2.根据权利要求1所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的组合物，其特征在于：所述毛霉菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1 ；所述白色假丝酵母菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述隐孢子虫探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述环孢子虫探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述溶组织内阿米巴探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述蓝氏贾第鞭毛虫探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；曲霉菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；人芽囊原虫探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；管家基因探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
3.一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合物、病原体标志物标准品、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶；PCR扩增反应的条件为：55℃逆转录15min；95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；40个循环。
4.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合物中引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述引物探针组合物中TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。
5.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本为粪便。
6.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒，其特征在于，所述病原体标志物标准品为1013 copies/ml。
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