CN110129465B - 一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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CN110129465B CN201910428436.3A CN201910428436A CN110129465B CN 110129465 B CN110129465 B CN 110129465B CN 201910428436 A CN201910428436 A CN 201910428436A CN 110129465 B CN110129465 B CN 110129465B
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Abstract

本发明公开了一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，检测方法，包括如下内容：采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；提取分泌物中的DNA核酸；设计引物和探针；配制海分枝杆菌核酸检测试剂；取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果；本发明无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，本发明运用独特的方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好；再通过实验优选出引物探针优选和最优的工作浓度范围，从而进一步提高试剂盒的检测的灵敏度和特异性。

Description

一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是一种海分枝杆菌核酸的检测方法及其试剂盒。
背景技术
海分枝杆菌是一种生长在淡水和海洋中的非结核分枝杆菌，主要感染鱼类、蛙类、虾类等水生生物，也可以通过皮肤表面的微小伤口感染人类，形成肉芽肿样病变。临床患者大多因被水产品刺伤手部，或在受污染的水域游泳引起感染。海分枝杆菌的最适生长温度约为32℃，温度上升至37℃时细菌生长受到抑制。因此，临床发现的感染灶大多位于人体四肢和皮肤等温度较低的表浅位置，免疫力低下的患者有可能发生全身感染。感染症状一般表现为迁延不愈的皮肤肿块，可伴有疼痛、破溃流脓等症状，临床容易误诊为腱鞘炎、关节炎、或结核分枝杆菌感染，从而延误治疗。治疗延误有可能导致病灶大面积坏死，严重时甚至有截肢风险。因此，及时诊断病原体类型是治疗海分枝杆菌感染的首要措施。
目前海分枝杆菌的诊断还没有统一标准。根据2016年《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》，海分枝杆菌的诊断需要先从临床样本中分离培养分枝杆菌，再通过分子生物学方法进行菌种鉴定，最终锁定致病菌。海分枝杆菌虽然属于快速生长的分枝杆菌，但分离培养依然需要至少一周到两周时间，再加上后续菌种鉴定的耗时，极大地耽误了患者的确诊和治疗时间。
市场需要一种无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸的方法，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒，本发明无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，具有耗时短、操作简便的优点，通过本方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好，具备良好的临床应用前景。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，包括如下内容：
采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物；
提取分泌物中的DNA核酸；
设计如下5条引物和探针，
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC；
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A；
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC；
配制海分枝杆菌核酸检测试剂，检测试剂包括：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液，MgSO4溶液，dNTP，蒸馏水，DNA样品；
取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，进行恒温扩增；
待恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果，
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置；
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置；
无效结果：检测装置无指示线出现。
前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，设计如下5条引物和探针的方法为：
5条引物和探针如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT；
SEQ ID NO.2：5’-抗原标记物-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG；
SEQ ID NO.3：5’-抗原标记物-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC；
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC；
步骤一，下载如下基因组序列：
5条海分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：HG917972.2，CP000854.1，CP025779.1，AP018496.1，CP024190.1，
3条溃疡分枝杆菌基因组序列，包括：GeneBank编号：CP000325.1，LR135168.1，AP017624.1，
19条其他分枝杆菌的基因组序列，具体如下：
结核分枝杆菌GeneBank编号：NC_000962.3，
牛结核分枝杆菌GeneBank编号：CP003494.1，
瘰疬分枝杆菌GeneBank编号：NZ_MVIJ01000184.1，
鸟分枝杆菌GeneBank编号：AE016958.1，
堪萨斯分枝杆菌GeneBank编号：CP006835.1，
戈登分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQOY01000260.1，
亚洲分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LZMH01000086.1，
龟分枝杆菌GeneBank编号：CP007220.1，
脓肿分枝杆菌GeneBank编号：CU458896.1，
马赛分枝杆菌GeneBank编号：NZ_FVNT01000011.1，
胞内分枝杆菌GeneBank编号：CP003322.1，
施氏分枝杆菌GeneBank编号：UEGW01000001.1，
蟾蜍分枝杆菌GeneBank编号：UATA01000001.1，
土分枝杆菌GeneBank编号：LT906469.1，
次要分枝杆菌GeneBank编号：NZ_LQPZ01000057.1，
草分枝杆菌GeneBank编号：CP014475.1，
耻垢分枝杆菌GeneBank编号：CP000480.1，
产粘液分枝杆菌GeneBank编号：NZ_CYSI01000007.1，
偶然分枝杆菌GeneBank编号：CP011269.1；
步骤二，以海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2的基因组序列为标准模板，将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件；
步骤三，处理比对结果，进行序列分析工作，筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条；
步骤四，选择海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2，碱基序号：646501-2647700的特征序列设计所述5条引物和探针。
前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，
步骤二，以海分枝杆菌E11菌株GeneBank编号：HG917972.2的基因组序列为标准模板，使用本地BLAST软件将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件；
步骤三，处理比对结果，进行序列分析工作，筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列；
筛选方法具体为：
编写Perl语言脚本，对本地BLAST软件的输出结果进行如下处理：
1)过滤本地BLAST输出的基因组比对文件，保留各基因组碱基位点与标准模板碱基位点的匹配信息；
2)按照标准模板碱基序号从小到大的顺序，将所有基因组碱基位点的匹配信息合并到一个文件；
3)以100bp的序列长度为单元，将标准模板分割成若干个100bp的小片段，统计其他基因组在各小片段中的碱基匹配数量；
4)将特征序列定义为，在该序列范围内，所有海分枝杆菌的碱基匹配数量≥95％，其他基因组的碱基匹配数量<50％；由此筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条。
前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的抗原标记物包括：Biotin，6-FAM。
前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，SEQ ID NO.2的抗原标记物为Biotin，SEQ ID NO.3的抗原标记物为6-FAM。
前述的一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法，恒温扩增的程序为：65℃ 45分钟。
一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，包括如下试剂：
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT，工作浓度范围0.2μM～0.6μM；
SEQ ID NO.2：5’-抗原标记物-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG，工作浓度范围0.5μM～1.3μM；
SEQ ID NO.3：5’-抗原标记物-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC，工作浓度范围0.8μM～1.6μM；
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A，工作浓度范围0.5μM～1.3μM；
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC，工作浓度范围0.2μM～0.6μM；
DNA聚合酶，工作浓度范围2.4U/测试～12U/测试；
DNA聚合酶缓冲液，浓度为10×；
MgSO4，添加量范围1.0mM～3.0mM；
dNTP，工作浓度范围0.1mM～0.4mM；
蒸馏水；
DNA样品。
前述的一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT，工作浓度范围0.4μM；
SEQ ID NO.2：5’-抗原标记物-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG，工作浓度范围0.9μM；
SEQ ID NO.3：5’-抗原标记物-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC，工作浓度范围1.0μM；
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A，工作浓度范围0.9μM；
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC，工作浓度范围0.4μM；
DNA聚合酶，工作浓度范围6U/测试；
DNA聚合酶缓冲液，浓度为10×；
MgSO4，添加量为2.0mM；
dNTP，工作浓度为0.3mM；
蒸馏水；
DNA样品。
前述的一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，DNA聚合酶为Bst酶，DNA聚合酶缓冲液为Bst酶缓冲液。
前述的一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，Bst酶缓冲液组成有：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，100mM dNTP，质量百分比1％Triton X-100；在25℃环境下，Bst酶缓冲液的pH值为8.8。
本发明的有益之处在于：
本发明无需分离培养分枝杆菌，直接从病灶分泌物中检测海分枝杆菌核酸，简化了临床检验的流程和耗时，具有耗时短、操作简便的优点；
通过本方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好；
本发明优选出引物探针优选和最优的工作浓度范围，从而进一步提高检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1是本发明的引物和探针的匹配位置。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法的操作流程如下：
1.采集海分枝杆菌疑似感染者的脓性分泌物。
2.使用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit提取分泌物中的DNA核酸，需要说明的是，其他公司的试剂盒也可以，这只是一种实施例。
3.设计如下5条引物和探针，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成：
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC
需要说明的是：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3是带有抗原标记的探针，作为一种实施例，
抗原标记物包括：Biotin，6-FAM；抗原标记物也可以是其他的标记物，不受限制。SEQ
ID NO.2和SEQ ID NO.3需参与核酸扩增反应，因此抗原标记在核酸序列的5’端或中间位
置，不可标记在核酸序列的3’端。
这5条引物和探针的设计过程如下：
步骤一，从NCBI GeneBank数据库下载海分枝杆菌和其他分枝杆菌的基因组序列，包括：
5条海分枝杆菌基因组序列(GeneBank编号：HG917972.2，CP000854.1，CP025779.1，AP018496.1，CP024190.1)；
3条溃疡分枝杆菌基因组序列(GeneBank编号：CP000325.1，LR135168.1，AP017624.1)，以及19条其他分枝杆菌的基因组序列，具体如下：
结核分枝杆菌(GeneBank编号：NC_000962.3)，
牛结核分枝杆菌(GeneBank编号：CP003494.1)，
瘰疬分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_MVIJ01000184.1)，
鸟分枝杆菌(GeneBank编号：AE016958.1)，
堪萨斯分枝杆菌(GeneBank编号：CP006835.1)，
戈登分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_LQOY01000260.1)，
亚洲分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_LZMH01000086.1)，
龟分枝杆菌(GeneBank编号：CP007220.1)，
脓肿分枝杆菌(GeneBank编号：CU458896.1)，
马赛分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_FVNT01000011.1)，
胞内分枝杆菌(GeneBank编号：CP003322.1)，
施氏分枝杆菌(GeneBank编号：UEGW01000001.1)，
蟾蜍分枝杆菌(GeneBank编号：UATA01000001.1)，
土分枝杆菌(GeneBank编号：LT906469.1)，
次要分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_LQPZ01000057.1)，
草分枝杆菌(GeneBank编号：CP014475.1)，
耻垢分枝杆菌(GeneBank编号：CP000480.1)，
产粘液分枝杆菌(GeneBank编号：NZ_CYSI01000007.1)，
偶然分枝杆菌(GeneBank编号：CP011269.1)。
步骤二，以海分枝杆菌E11菌株(GeneBank编号：HG917972.2)的基因组序列为标准模板，用本地BLAST软件将其他基因组序列与标准模板进行两两比对，分别得到各基因组的比对文件。由于没有现成软件可以处理后续的序列分析工作，因此根据设计需求编写Perl语言脚本，对本地BLAST软件的输出结果进行如下处理：1)过滤本地BLAST输出的基因组比对文件，保留各基因组碱基位点与标准模板碱基位点的匹配信息；2)按照标准模板碱基序号从小到大的顺序，将所有基因组碱基位点的匹配信息合并到一个文件；3)以100bp的序列长度为单元，将标准模板分割成若干个100bp的小片段，统计其他基因组在各小片段中的碱基匹配数量；4)将特征序列定义为，在该序列范围内，所有海分枝杆菌的碱基匹配数量≥95％，其他基因组的碱基匹配数量<50％。由此筛选出长度600bp以上的海分枝杆菌保守的特征序列共32条。
步骤三，选择海分枝杆菌E11菌株(GeneBank编号：HG917972.2)碱基序号2646501-2647700的特征序列设计上述5条引物和探针。
步骤四，根据如下表格，配制海分枝杆菌核酸检测试剂：
SEQ ID NO.1工作浓度范围0.2μM～0.6μM，优选的，SEQ ID NO.1的工作浓度为0.4μM；
SEQ ID NO.2工作浓度范围0.5μM～1.3μM，优选的，SEQ ID NO.2的工作浓度为0.9μM；
SEQ ID NO.3工作浓度范围0.8μM～1.6μM，优选的，SEQ ID NO.3的工作浓度为1.0μM；
SEQ ID NO.4工作浓度范围0.5μM～1.3μM，优选的，SEQ ID NO.4的工作浓度为0.9μM；
SEQ ID NO.5工作浓度范围0.2μM～0.6μM，优选的，SEQ ID NO.5的工作浓度为0.4μM；
Bst酶的工作浓度范围2.4U/测试～12U/测试，优选的，Bst酶的工作浓度为6U/测试；
MgSO4的添加量范围1.0mM～3.0mM，优选的，MgSO4的添加量为2.0mM
dNTP的工作浓度范围0.1mM～0.4mM，优选的，dNTP的工作浓度为0.3mM。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.4μL
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.4μL
Bst酶 6U/μl 1μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
MgSO4溶液 100mM 0.4μL
dNTP mix 10mM 0.6μL
蒸馏水 - 8.4μL
DNA样品 - 4μL
总体积 - 20μL
其中Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司，成分为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mM MgSO4、100mM dNTP、质量百分比1％Triton X-100。25℃环境下，Bst酶缓冲液pH值为8.8。
步骤五，取病灶分泌物的DNA核酸作扩增模板，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
步骤六，恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置。
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置。
无效结果：检测装置无指示线出现。
△以下通过实验验证本发明的有益效果：
实验一，灵敏度验证；
对比测试现有技术的套路找出的引物和探针与用本发明的方法找出的引物和探针的最低检测限；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
质粒DNA用天根生化科技(北京)有限公司的质粒小提试剂盒(DP103)提取；
质粒浓度用NanoDrop 2000微量分光光度计测定；
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
选择引物和探针覆盖的海分枝杆菌E11菌株(GeneBank编号：HG917972.2)基因组位置2646803-2646963，长度160bp的检测片段。从头合成该片段，并连接进pUC57载体，转化感受态大肠杆菌。
大肠杆菌培养至对数生长期(OD600 0.8～1.0)后，抽提质粒并测定浓度。
将海分枝杆菌质粒溶液10倍梯度稀释至2500copies/μL，250copies/μL，25copies/μL，2.5copies/μL的质粒稀释液。
1.3引物设计与合成
设计以下5条引物和探针，扩增海分枝杆菌特征片段(图1)。
SEQ ID NO.1：5’-TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT；
SEQ ID NO.2：5’-Biotin-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG；
SEQ ID NO.3：5’-6-FAM-GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC；
SEQ ID NO.4：5’-GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A；
SEQ ID NO.5：5’-TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC；
1.4.试剂配制
根据如下表格，配制海分枝杆菌核酸检测试剂。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.4μL
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.4μL
Bst酶 6U/μl 1μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
MgSO4溶液 100mM 0.4μL
dNTP mix 10mM 0.6μL
蒸馏水 - 8.4μL
DNA样品 - 4μL
总体积 - 20μL
其中，Bst酶缓冲液的成分为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mMMgSO4、100mM dNTP、质量百分比1％Triton X-100。25℃环境下，Bst酶缓冲液pH值为8.8。
1.5核酸扩增
选择1250copies/μL，125copies/μL，12.5copies/μL，1.25copies/μL四种不同浓度的质粒稀释液作扩增模板，每种浓度梯度的质粒稀释液重复进行3次测试。
恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
阳性结果：检测装置出现两条红色的指示线，两条指示线分别位于质控线(C)位置和检测线(T)位置。
阴性结果：检测装置出现一条指示线，且位于质控线(C)位置。
无效结果：检测装置无指示线出现。
2.实验结果
1250copies/μL和125copies/μL质粒稀释液的检出率均为3/3；12.5copies/μL质粒稀释液的检出率为1/3；1.25copies/μL质粒稀释液未检出阳性信号。
3.实验结论
本专利中公开的海分枝杆菌核酸检测试剂，其检测下限小于500copies/测试。
实验二，特异性测试；
对比测试现有技术的套路找出的引物和探针与用本发明的方法找出的引物和探针的特异性；
海分枝杆菌与其他分枝杆菌的基因组相似性较高，因此需要实验验证临床常见的其他分枝杆菌如鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌，是否对检验试剂造成假阳性结果。除此之外，常见的皮肤感染致病菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，也进行了特异性测试。
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2菌落DNA的制备
海分枝杆菌菌落和其他10种菌落样本由昆明市第三人民医院检验科从日常工作中收集。
向1.5ml离心管中加入30μl生理盐水，挑取单菌落样本，加入到生理盐水中。将离心管95℃加热10分钟裂解，再插入冰水混合物3分钟。将离心管10,000rpm离心2分钟，上清液即为菌落DNA溶液，可作为核酸扩增的模板。
1.3引物设计与合成
参考实验一，设计扩增海分枝杆菌特征序列的5条引物和探针。
1.4.试剂配制
参考实验一，配制海分枝杆菌核酸检测试剂。
1.5核酸扩增
将10种菌落DNA溶液作扩增模板，每种菌落DNA重复进行3次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
参考实验一，恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
2.实验结果
海分枝杆菌菌落样本检测结果为阳性，而其他6种临床常见的分枝杆菌菌落样本和4种皮肤感染常见致病菌，检测结果均为阴性。
3.实验结论
本专利中公开的海分枝杆菌核酸检测试剂，对与临床常见的6种分枝杆菌菌落和4种常见的皮肤感染致病菌菌落没有交叉反应。
实验三，临床样本测试；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2临床样本DNA的制备
3例确认感染海分枝杆菌的脓性样本由昆明市第三人民医院检验科从日常工作中收集。
临床样本DNA用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取。
海分枝杆菌菌落由临床样本分离培养得到。
海分枝杆菌菌落DNA用煮沸法制备，操作流程参考实施例2。
1.3引物设计与合成
参考实验一，设计扩增海分枝杆菌特征序列的5条引物和探针。
1.4.试剂配制
参考实验一，配制海分枝杆菌核酸检测试剂。
1.5核酸扩增
将临床样本DNA作扩增模板，每例样本DNA测试3次。
将海分枝杆菌菌落DNA作为阳性对照的扩增模板，重复3次测试。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复3次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。
2.实验结果
3例确认感染海分枝杆菌的临床样本均稳定检测出阳性结果。阴性对照与阳性对照检测结果均正确。
3.实验结论
本专利中公开的海分枝杆菌核酸检测试剂，无需分离培养，可直接从临床样本中检测出海分枝杆菌核酸，具备临床应用的可行性。
实验四，SEQ ID NO.3工作浓度的优选范围和最优值实验；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
质粒制备流程同实验一。
1.3试剂配制：按照下表配制试剂母液，每测试管使用11μL母液。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.1μL
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.5μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.5μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.1μL
Bst酶 6U/μl 0.7μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
MgSO4溶液 100mM 0.2μL
dNTP mix 10mM 0.3μL
蒸馏水 - 6.6μL
按照下表配制SEQ ID NO.3浓度梯度组，每组4个平行测试管，每测试管使用5μLSEQ ID NO.3溶液。
分组 1 2 3 4 5
20μM SEQ ID NO.3 0.8μL 1.0μL 1.2μL 1.4μL 1.6μL
蒸馏水 4.2μL 4.0μL 3.8μL 3.6μL 3.4μL
1.5核酸扩增
向每个测试管中加入4μL浓度250cp/μL的质粒溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复4次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。根据装置的显色强度判断SEQ ID NO.3的最优工作浓度。
2.实验结果
第1组至第5组，每组都能稳定检出质粒的阳性信号。
第2组的显色结果最强，优于其他各组。
阴性对照结果正确。
3.实验结论
SEQ ID NO.3的工作浓度范围0.8μM～1.6μM，优选的，所述SEQ ID NO.3的工作浓度为1.0μM。
实验五，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4工作浓度的优选范围和最优值实验；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
质粒制备流程同实验一。
1.3试剂配制：按照下表配制试剂母液，每测试管使用11μL母液。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.1μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.1μL
Bst酶 6U/μl 0.7μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
MgSO4溶液 100mM 0.2μL
dNTP mix 10mM 0.3μL
蒸馏水 - 6.6μL
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4在扩增过程中以1:1的比例形成扩增产物中间体。因此以1:1的比例，按照下表配制SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的浓度梯度组，每组4个平行测试管，每测试管使用5μL SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的混合溶液。
分组 1 2 3 4 5
20μM SEQ ID NO.2 0.5μL 0.7μL 0.9μL 1.1μL 1.3μL
20μM SEQ ID NO.4 0.5μL 0.7μL 0.9μL 1.1μL 1.3μL
蒸馏水 4.0μL 3.6μL 3.2μL 2.8μL 2.4μL
1.5核酸扩增
向每个测试管中加入4μL浓度250cp/μL的质粒溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复4次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。根据装置的显色强度判断SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的最优工作浓度。
2.实验结果
第1组至第5组，每组都能稳定检出质粒的阳性信号。
第3组的显色结果最强，优于其他各组。
阴性对照结果正确。
3.实验结论
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的工作浓度范围0.8μM～1.6μM，优选的，所述SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4的工作浓度为0.9μM。
实验六，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5工作浓度的优选范围和最优值实验；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
质粒制备流程同实验一。
1.3试剂配制：按照下表配制试剂母液，每测试管使用11μL母液。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.9μL
Bst酶 6U/μl 0.7μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
MgSO4溶液 100mM 0.2μL
dNTP mix 10mM 0.3μL
蒸馏水 - 5.0μL
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5分别是扩增区域上游和下游的置换引物，在扩增过程中以近似1:1的比例从模板上置换SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的延伸链。因此，以1:1的比例，按照下表配制SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5的浓度梯度组，每组4个平行测试管，每测试管使用5μL SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5的混合溶液。
1.5核酸扩增
向每个测试管中加入4μL浓度250cp/μL的质粒溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复4次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。根据装置的显色强度判断SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5的最优工作浓度。
2.实验结果
第1组、第2组和第3组能稳定检出质粒的阳性信号。
第4组检出2/4阳性信号，且显色微弱。
第5组未检出阳性信号，提示SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5浓度过高，抑制了探针SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.4的工作效率。
第3组的显色结果最强，优于其他各组。
阴性对照结果正确。
3.实验结论
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5的工作浓度范围0.2μM～0.6μM，优选的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5的工作浓度为0.4μM。
实验七，MgSO4和dNTP工作浓度的优选范围和最优值实验；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
质粒制备流程同实验一。
1.3试剂配制：按照下表配制试剂母液，每测试管使用11μL母液。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.4μL
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.9μL
Bst酶 6U/μl 0.7μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
蒸馏水 - 4.2μL
当MgSO4浓度过低时，DNA聚合酶的工作效率低下，当MgSO4浓度过高时，容易出现非特异性扩增和假阳性结果。当dNTP浓度过低时，引物延伸的效率下降，当dNTP浓度过高时，dNTP会与Mg2+结合，使DNA聚合酶的工作效率下降。因此，需要实验确定MgSO4和dNTP的最优浓度组合。按照下表配制MgSO4和dNTP的浓度梯度组，每组4个平行测试管，每测试管使用5μL MgSO4和dNTP的混合溶液。
1.5核酸扩增
向每个测试管中加入4μL浓度250cp/μL的质粒溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复4次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。根据装置的显色强度判断MgSO4和dNTP的最优工作浓度。
2.实验结果
第1组-第8组均能稳定检测阳性信号。
第4组的显色结果最强，优于其他各组。
阴性对照结果正确。
3.实验结论
MgSO4的工作浓度范围1.0mM～3.0mM，优选的，MgSO4的工作浓度为2.0mM。dNTP的工作浓度范围0.1mM～0.4mM，优选的，dNTP的工作浓度为0.3mM。
实验八，Bst酶工作浓度的优选范围和最优值实验；
1.材料与方法：
1.1试剂和仪器
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
Bst酶缓冲液购自NEW ENGLAND Biolabs Inc公司；
QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自QIAGEN公司；
恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司。
1.2海分枝杆菌质粒的制备
质粒制备流程同实验一。
1.3试剂配制：按照下表配制试剂母液，每测试管使用11μL母液。
成分 浓度 加样量
SEQ ID NO.1 20μmol/L 0.4μL
SEQ ID NO.2 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.3 20μmol/L 1.0μL
SEQ ID NO.4 20μmol/L 0.9μL
SEQ ID NO.5 20μmol/L 0.9μL
MgSO4 100mM 0.4μL
dNTP 10mM 0.6μL
Bst酶缓冲液 10× 2μL
蒸馏水 - 3.9μL
当Bst酶超过饱和浓度后，提升酶量对显色强度不再有明显改善。因此设置以下Bst酶的浓度梯度组，确定Bst酶的饱和浓度，每组4个平行测试管，每测试管使用5μL Bst酶溶液。
1.5核酸扩增
向每个测试管中加入4μL浓度250cp/μL的质粒溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复4次测试。
核酸扩增条件同实验一，恒温扩增程序为：65℃ 45分钟，温度偏差应在±2℃以内。
1.6结果判读
恒温扩增结束后，用一次性核酸检测装置定性判读结果。根据装置的显色强度判断Bst酶的饱和浓度。
2.实验结果
第1组无阳性信号检出。
第2组-第7组均能稳定检测阳性信号。
从第4组开始，酶量增加对显色强度的影响不再明显。
阴性对照结果正确。
3.实验结论
Bst酶的工作浓度范围2.4U/测试～12U/测试，优选的，所述Bst酶的工作浓度为6U/测试。
综上可知，本发明，简化了临床检验的流程和耗时，耗时短、操作简便；本发明运用独特的方法设计出的引物和探针，使得检测灵敏度高、特异性好；本发明通过实验优选出引物探针优选和最优的工作浓度范围，从而进一步提高检测的灵敏度和特异性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州优思达生物技术有限公司
<120> 一种海分枝杆菌核酸的快速检测方法及其试剂盒
<141> 2019-05-22
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgtacctgaa ggagcgcagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> mRNA
<222> (0)..(1)
<223> Biotin
<400> 2
gggctccttt gttgaggttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> mRNA
<222> (0)..(1)
<223> 6-FAM
<400> 3
gtgtcggatc gggccacgtc 20
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gggctccttt gttgaggttg gaccagccgc gcgatagcaa 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttggttgaca ctcgaggcac 20

Claims (4)

1.一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：
SEQ ID NO.1：5’- TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT，工作浓度范围0.2μM~0.6μM；
SEQ ID NO.2：5’- Biotin- GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG，工作浓度范围0.5μM~1.3μM；
SEQ ID NO.3：5’- 6-FAM- GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC，工作浓度范围0.8μM~1.6μM；
SEQ ID NO.4：5’- GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A，工作浓度范围0.5μM~1.3μM；
SEQ ID NO.5：5’- TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC，工作浓度范围0.2μM~0.6μM；
Bst酶，工作浓度范围2.4U/测试~12U/测试；
Bst酶缓冲液，浓度为10 ×；
MgSO4，添加量范围1.0mM~3.0mM；
dNTP，工作浓度范围0.1mM~0.4mM；
蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，
SEQ ID NO.1：5’- TGT ACC TGA AGG AGC GCA GT，工作浓度范围0.4μM；
SEQ ID NO.2：5’- Biotin- GGG CTC CTT TGT TGA GGT TG，工作浓度范围0.9μM；
SEQ ID NO.3：5’- 6-FAM- GTG TCG GAT CGG GCC ACG TC，工作浓度范围1.0μM；
SEQ ID NO.4：5’- GGG CTC CTT TGT TGA GGT TGG ACC AGC CGC GCG ATA GCA A，工作浓度范围0.9μM；
SEQ ID NO.5：5’- TTG GTT GAC ACT CGA GGC AC，工作浓度范围0.4μM；
Bst酶，工作浓度范围6U/测试；
Bst酶缓冲液，浓度为10 ×；
MgSO4，添加量为2.0mM；
dNTP，工作浓度为0.3mM；
蒸馏水。
3. 根据权利要求1所述的一种海分枝杆菌核酸的试剂盒，其特征在于，所述Bst酶缓冲液组成有：200 mM Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，100 mM KCl，20 mM MgSO4，100 mM dNTP，质量百分比1% Triton X-100；在25˚C环境下，Bst酶缓冲液的pH值为8.8。
4.如权利要求1所述的试剂盒在制备海分枝杆菌检测试剂盒上的应用。
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海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌二重 PCR检测方法的建立及应用;武迪等;《中国现代医学杂志》;20180228;第28卷(第4期);第45-50页 *

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