CN112501330B

CN112501330B - 一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合及试剂盒

Info

Publication number: CN112501330B
Application number: CN202110153319.8A
Authority: CN
Inventors: 董晓艳; 熊永清; 王洪
Original assignee: Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd
Current assignee: Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112501330A

Abstract

本发明涉及一种用于同步检测多种儿童常见消化道感染相关细菌的引物组、探针组及包含这些的试剂盒，所述引物组、探针组及试剂盒可实现一次反应同时检测多种引起消化系统感染的常见细菌，是目前最全面的儿童消化道细菌感染检测方法，效率高、特异性强，为临床检验提供辅助诊断的依据。通过本技术方案的公开，可以缓解现有技术中存在的对儿童消化道感染相关的细菌类病原菌诊断研究尚有不足的技术问题。

Description

一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合及试剂盒

技术领域

本发明属于病原微生物分子生物学领域，具体涉及一种用于儿童消化道感染细菌类病原菌系列检测和区分的引物探针组合及试剂盒。

背景技术

消化道感染是一种常见疾病，在临床儿科中尤为多见，发病率呈逐年增高趋势，仅次于呼吸系统感染，位列儿科第二大多发病，多因细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原菌感染导致。全年均可发病，细菌中常见的是空肠弯曲杆菌（CJE）、艰难梭菌（Cdiff）、鼠伤寒沙门菌（STYP）、副溶血性弧菌（VP）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yent）、黏附性大肠埃希菌（EAEC）、产毒性大肠埃希菌（ETEC）、致病性大肠埃希菌（EPEC）、出血性大肠埃希菌（EHEC）、侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、志贺菌(SD)、霍乱弧菌（Vc）。

消化道感染引起的病症是感染性腹泻，如细菌性痢疾，主要由志贺菌属引起，中毒性痢疾常见于小儿；沙门菌属、大肠埃希菌等可引起爆发和集体发病为特征的细菌性食物中毒，严重者可危及生命。由此可见，这些消化道细菌大都具有感染力强、发病急、潜伏期短等特点，是造成儿童致死致残的重要原因。随着社会进步，越来越多的新的致病性消化道细菌被发现，给临床相关疾病的诊断和治疗造成极大的困难。

此外，消化道感染还会导致患儿营养不良，进而影响患儿的正常生长发育，在发展中国家此类影响尤为明显。因此，消化道病原菌的感染和流行问题已引起世界各国的密切关注和高度重视。

及时准确地判断出消化道感染病原菌的种类，对于传染源的早期发现、流行病的控制及临床治疗的有效开展均具有重要意义。

多年来，世界各地的医院及实验室均常规使用镜检法、病原菌分离培养、免疫学检查等方法对消化道常见病原菌进行检测，但这些检测方法都存在许多难以克服的缺陷。

直接镜检法准确性差、安全性存在明显不足；传统的病原菌分离方法操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，实验安全性和结果准确性相对难以保证；消化道感染病原菌免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点，但耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。

近年来，分子生物学技术如实时荧光PCR技术等的引入，很大程度上改善了检测和鉴定病原菌的现状。普通荧光PCR检测具有较好的灵敏度和特异性，提高了临床鉴定水平，但实际应用过程中该技术多是针对单项或几项病原菌，想要同步检测多种病原菌就需要多种检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高。针对消化道感染病原菌的特点，建立起高效、快速、简便、特异的检测方法，以适应疫情筛查和临床检测的需求，是当前消化道感染性疾病防治工作的重点，因而多重荧光定量PCR技术应运而生。

多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检，能够在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测。在临床病原菌检测的应用中，可同步检测同一标本内几十种乃至上百种关联病原菌，有利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题：（1）由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。（2）避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性结果。（3）每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增。（4）需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。

目前还没有可对以上儿童多种消化道感染细菌类病原菌进行同步PCR法检测的产品，并保证检测准确性和特异性的有效方法。本发明将是市面上最全面的儿童消化道感染细菌类病原菌检测产品。

发明内容

为本发明的首要目的是针对上述技术问题，根据统计学研究，提出一种用于12种儿童消化道感染相关的细菌类病原菌检测的引物探针组合。细菌类病原菌包括空肠弯曲杆菌（CJE）、艰难梭菌（Cdiff）、鼠伤寒沙门菌（STYP）、副溶血性弧菌（VP）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yent）、黏附性大肠埃希菌（EAEC）、产毒性大肠埃希菌（ETEC）、致病性大肠埃希菌（EPEC）、出血性大肠埃希菌（EHEC）、侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、志贺菌(SD)、霍乱弧菌（Vc）。

本发明的第二个目的是提供上述病原菌标志物的引物及探针。

本发明的第三个目的是提供上述标志物的引物探针组合在制备儿童消化道感染细菌类病原菌诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明提供的病原菌标志物及其引物探针组合在制备用于诊断儿童消化道细菌感染的产品中的应用，可以缓解现有技术中存在的对消化道细菌感染相关的特定病原菌诊断研究尚有不足的技术问题。

本发明的第四个目的是提供儿童消化道细菌感染的诊断或辅助诊断的试剂盒。以缓解现有技术中存在的对儿童消化道感染相关的细菌类病原菌标志物的检测特异性不强的技术问题。

一种同步检测12种儿童消化道感染相关的细菌类病原菌的引物探针组合，包括下列引物及探针：空肠弯曲杆菌（CJE）的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；艰难梭菌（Cdiff）上游引物序列如SEQ IDNO.4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；鼠伤寒沙门菌（STYP上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；副溶血性弧菌（VP）上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；小肠结肠炎耶尔森菌（Yent）上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；黏附性大肠埃希菌（EAEC）上游引物序列如SEQ ID NO.16所示，下游引物序列如SEQID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；产毒性大肠埃希菌（ETEC）上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示；致病性大肠埃希菌（EPEC）上游引物序列如SEQ ID NO.22所示，下游引物序列如SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示；出血性大肠埃希菌（EHEC）上游引物序列如SEQ IDNO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ ID NO.27所示；侵袭性大肠埃希菌（EIEC）上游引物序列如SEQ ID NO.28所示，下游引物序列如SEQ ID NO.29所示，探针序列如SEQ ID NO.30所示；志贺菌(SD) 上游引物序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物序列如SEQ ID NO.32所示，探针序列如SEQ ID NO.33所示；霍乱弧菌（Vc）上游引物序列如SEQ ID NO.34所示，下游引物序列如SEQ ID NO.35所示，探针序列如SEQ ID NO.36所示；管家基因上游引物序列如SEQ ID NO.37所示，下游引物序列如SEQ ID NO.38所示，探针序列如SEQ ID NO.39所示。

其中，所述空肠弯曲杆菌（CJE）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述艰难梭菌（Cdiff）探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述鼠伤寒沙门菌（STYP）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述副溶血性弧菌（VP）探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述小肠结肠炎耶尔森菌（Yent）探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述黏附性大肠埃希菌（EAEC）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述产毒性大肠埃希菌（ETEC）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述致病性大肠埃希菌（EPEC）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述出血性大肠埃希菌（EHEC）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述侵袭性大肠埃希菌（EIEC）探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述志贺菌(SD)探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述霍乱弧菌（Vc）探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；管家基因探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

进一步的，一种同步检测12儿童消化道感染相关的细菌类病原菌的试剂盒，包括权利要求2所述的12种细菌的上游引物、下游引物及探针、细菌病原菌标志物标准品、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶。

进一步的，所述引物探针组合中的引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述引物探针组合中的TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

进一步的，所述的试剂盒的检测样本为粪便。

进一步的，所述病原菌标志物的标准品的浓度为10¹³copies/μL。

本发明的有益效果：

本发明中提供的引物探针组合可以作为标志物用于消化道细菌感染的风险预估与检测，具有灵敏度高、准确性强的优点，为消化道感染诊断提供了一定的应用价值，对我国儿童消化道感染的筛查、预防及治疗有较大的帮助。

另外，本发明还提供了用于诊断消化道细菌感染的试剂盒，包含相关试剂和使用说明。其引物特异性强，灵敏度高。可以定性检测的同时区分出儿童消化道的12种细菌，是目前较为全面的儿童消化道感染细菌类病原菌检测方法，检测快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床诊断和治疗。

附图说明

图1示出了1号反应管检测5×10⁷copies/ml至5×10² copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图1中，从左至右依次为5×10⁷ copies/ml、5×10⁶ copies/ml、5×10⁵ copies/ml、5×10⁴copies/ml、5×10³copies/ml、5×10² copies/ml的参考品的扩增曲线。

图2示出了2号反应管检测5×10⁷ copies/ml至5×10² copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图2中，从左至右依次为5×10⁷ copies/ml、5×10⁶ copies/ml、5×10⁵ copies/ml、5×10⁴copies/ml、5×10³copies/ml、5×10² copies/ml的参考品的扩增曲线。

图3示出了3号反应管检测5×10⁷ copies/ml至5×10² copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图3中，从左至右依次为5×10⁷ copies/ml、5×10⁶ copies/ml、5×10⁵ copies/ml、5×10⁴copies/ml、5×10³copies/ml、5×10² copies/ml的参考品的扩增曲线。

图4示出了4号反应管检测5×10⁷ copies/ml至5×10² copies/ml 6种梯度的参考品的扩增曲线，其中，在图4中，从左至右依次为5×10⁷ copies/ml、5×10⁶ copies/ml、5×10⁵ copies/ml、5×10⁴copies/ml、5×10³copies/ml、5×10² copies/ml的参考品的扩增曲线。

图5示出了1号、2号、3号、4号反应管检测6份阴性参考品的扩增曲线。

具体实施方式

使用细菌阳性对照作为样本。该试剂盒由引物探针混合液、RT-PCR buffer、混合酶液、阳性质控品和无RNase水组成；RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl₂；混合酶液包括Hot Start Taq酶、逆转录酶和UNG酶；阳性质控品中含有对应消化道病原体的扩增基因序列的质粒。

所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

该试剂盒的反应体系为30μL，具体为：核酸模板7μL、RT-PCR buffer20μL、混合酶液1μL和引物探针混合液2μL。

试剂盒的操作和结果判定

(1) 将样品DNA共提取模板(从患儿粪便中提取)、无RNase水、阳性质控品各7μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20μL、混合酶液1μL和引物探针混合液2μL，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。

(2) 设置仪器中的PCR扩增反应的条件为：55℃逆转录15min；95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；40个循环。

(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。

(4)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35，否则实验视为无效；

(5)结果判读：

样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本DNA提取失败、待测样本中不含DNA或含量低于检测限；

样本检测孔Ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测孔Ct值为35-40，需要复检一次，如果Ct值仍为35-40，则判断为阴性。

灵敏度验证：

采取6份线型灵敏度样本（浓度分别为5×10⁷ copies/ml、5×10⁶ copies/ml、5×10⁵ copies/ml、5×10⁴copies/ml、5×10³copies/ml、5×10² copies/ml）对试剂的线性进行验证。检测结果见图1、2、3、4。

由图1、2、3、4可以看出，1号、2号、3号、4号反应管检测线型灵敏度样本均为阳性，试剂的线性良好，最低检测下限达到5×10² copies/ml。

特异性验证：

分别检测6份与本试剂盒不涵盖的消化道病原体阴性样本，实验结果见图5。

由图5可以看出，1号、2号、3号、4号反应管检测6份阴性样本无扩增曲线，皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。

各反应管组份如表1所示：

表1

通道	FAM	ROX	HEX/ VIC	CY5
					1号反应管	鼠伤寒沙门菌	出血性大肠埃希菌	志贺菌	管家基因
2反应号管	产毒性大肠埃希菌	黏附性大肠埃希菌	小肠结肠炎耶尔森菌	管家基因
					3反应号管	致病性大肠埃希菌	空肠弯曲杆菌	艰难梭菌	管家基因
4号反应管	侵袭性大肠埃希菌	霍乱弧菌	副溶血性弧菌	管家基因

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。

序列表

<110> 爱科睿特生物医疗科技（南京）有限公司

<120> 一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合及试剂盒

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 22

<212> DNA

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cggctacagc ttcaccacca 20

Claims

1.一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合，其特征在于，包括：空肠弯曲杆菌的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；艰难梭菌上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物序列如SEQID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；鼠伤寒沙门菌上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；副溶血性弧菌上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ IDNO.12所示；小肠结肠炎耶尔森菌上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物序列如SEQID NO.14所示，探针序列如SEQ ID NO.15所示；黏附性大肠埃希菌上游引物序列如SEQ IDNO.16所示，下游引物序列如SEQ ID NO.17所示，探针序列如SEQ ID NO.18所示；产毒性大肠埃希菌上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，探针序列如SEQ ID NO.21所示；致病性大肠埃希菌上游引物序列如SEQ ID NO.22所示，下游引物序列如SEQ ID NO.23所示，探针序列如SEQ ID NO.24所示；出血性大肠埃希菌上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物序列如SEQ ID NO.26所示，探针序列如SEQ ID NO.27所示；侵袭性大肠埃希菌上游引物序列如SEQ ID NO.28所示，下游引物序列如SEQ ID NO.29所示，探针序列如SEQ ID NO.30所示；志贺菌上游引物序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物序列如SEQ ID NO.32所示，探针序列如SEQ ID NO.33所示；霍乱弧菌上游引物序列如SEQID NO.34所示，下游引物序列如SEQ ID NO.35所示，探针序列如SEQ ID NO.36所示；管家基因上游引物序列如SEQ ID NO.37所示，下游引物序列如SEQ ID NO.38所示，探针序列如SEQID NO.39所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合，其特征在于：所述空肠弯曲杆菌探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述艰难梭菌探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述鼠伤寒沙门菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述副溶血性弧菌探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述小肠结肠炎耶尔森菌探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述黏附性大肠埃希菌探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述产毒性大肠埃希菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述致病性大肠埃希菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述出血性大肠埃希菌探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；所述侵袭性大肠埃希菌探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述志贺菌探针的5’端标记有HEX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；所述霍乱弧菌探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；管家基因探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

3.一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合、病原菌标志物的标准品、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶，其中，所述的试剂盒的PCR扩增条件为：55℃逆转录15min；95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；40个循环。

4.根据权利要求3所述的用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组合中的引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述引物探针组合中的TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

5.根据权利要求3所述的用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本为粪便。

6.根据权利要求3所述的用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的试剂盒，其特征在于，所述病原菌标志物的标准品的浓度为10¹³copies/ml。