CN111676315A - 检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法。所述引物和探针包括2019‑nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的正、反向引物、探针，RPP30内参基因的正、反向引物、探针，序列分别如SEQ ID No.1‑6所示。所述试剂盒含有上述的引物和探针。所述检测方法使用了上述方案汇总的引物和探针或使用上述方案中所述的试剂盒。本发明的检测原理是基于水解探针荧光PCR原理，以新型冠状病毒2019‑nCoV为模板，经一步法荧光RT‑PCR实验，可快速、准确对新冠病毒进行鉴定和检测，从而避免了新冠病毒检测的假阴性和假阳性，并且，从从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法。
背景技术
现已证实，该病毒属于β属冠状病毒，具有独特的刺突(spike)，其基因组序列(RNA)与蝙蝠SARS样病毒(bat-SL-CoVZC45)具85％以上的同源性。世界卫生组织已将该病毒(2019-nCoV)引发的疾病命名为：COVID-19(Corona Virus Disease 2019)。由于其传染性强及潜伏期长等特点，已成为严重威胁人们健康的传染性疾病。
实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。而一步法实时荧光RT- PCR技术是实时荧光PCR的一种，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，具有节省反应时间、能够对检测样品进行准确定量分析、更加快捷和方便、假阳性率低、特异性高的优点。因此，该技术在RNA 样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。
目前临床上针对2019-nCoV的核酸检测就采用的是一步法实时荧光RT-PCR 技术，然而，在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针成为了一个关键性的基本技术环节。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供高可靠性以及准确度的检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法。
本发明的技术方案为：
一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针，包括2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列包含如SEQIDNo.3所示，RPP30内参基因的正向引物序列如SEQ ID No.4所示，反向引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列包含如 SEQIDNo.6所示。ORF1ab基因和RPP30内参基因的引物和探针序列具体如下所示：
ORF1ab基因：
ORF1ab-F：CTTATTACAGAAGGTAGTGTTAAAGGT(SEQ ID NO:1)
ORF1ab-R：TAATTGAACTGTGTTTTTACGGCTTC(SEQ ID NO:2)
ORF1ab-P：ACAACCATCTGTAGGTCCCAAACAAGCT(SEQ ID NO:3)
RPP30内参基因：
RPP30-F：ACGAGGTGGGACTTCAGCAT(SEQ ID NO:4)
RPP30-R：CGCAGAGCCTTCAGGTCAG(SEQ ID NO:5)
RPP30-P：AACCCGCTCGCAGGTCCAAATCTG(SEQ ID NO:6)
进一步地，所述2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的探针以及RPP30 内参基因的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团TAMRA 或BHQ-1。同时为了降低反应体系的干扰，合成的引物和探针采用HPLC进行纯化。
本发明还公开了一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的试剂盒，含上述的引物和探针。
进一步地，所述试剂盒内的反应体系主要含有：PT-PCR反应液、酶混合液、 10×Solution。
更进一步地，所述试剂盒内的反应体系具体成分为：0.8uL PT-PCR反应液、 4uL酶混合液、2uL 10×Solution、0.25uL ORF1ab基因的正向引物、0.25 uLORF1ab基因的反向引物、0.2uL ORF1ab基因的探针、0.25uL RPP30内参基因的正向引物、0.25uL RPP30内参基因的反向引物、0.2uL RPP30内参基因的探针0.4uL新型冠状病毒2019-nCoV模板，无菌水补足至20uL。
更进一步地，所述酶混合液为高耐受性Taq DNA聚合酶、耐热型M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP和酶保存液，其中高耐受性Taq DNA聚合酶的用量为4-6U/反应、耐热型M-MLV逆转录酶的用量为2-2.5U/反应、RNA酶抑制剂12-20U/反应，酶保存液补充至4uL。
更进一步地，所述PT-PCR反应液的成分具体为：Tris-HCI 20-40mM、KCI 100--200mM、MgS0.3-6mM.4。
更进一步地，所述Solution的成分具体为：四甲基氯化铵20-40mM、海藻糖4％体积比、甘油0.05-0.1mM、三氮化钠4.5E～-9E。
进一步地，还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为无菌生理盐水，阳性对照为人工合成的浓度1×106Copies/ml的2019-nCoV新型冠状病毒基因序列重组的假病毒。
本发明还提供了一种使用了上述引物和探针或试剂盒对2019-nCoV新型冠状病毒进行基因检测的方法。
进一步地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒的RNA为模板；
(2)以提取的RNA作为模板，用权利要求1所述的引物以及探针配置扩增反应体系，直接经一步法RT-PCR进行实时荧光扩增，得到荧光扩增曲线；
(3)对所述银光扩增曲线进行判断是否存在2019-nCoV新型冠状病毒。
进一步地，所述扩增反应体系的反应参数以及扩增程序为：42℃逆转录30 min，1个循环；95℃5min，1个循环；94℃变形30sec，，60℃退火、延伸及荧光采集1min，45个循环。
本发明的有益效果为：本发明的检测原理是基于水解探针荧光PCR原理，以新型冠状病毒2019-nCoV为模板，采用与新冠病毒基因组互补的特异性引物及探针，该引物以及探针与其它病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括常见的核酸内切酶的酶切位点，辅以Taq DNA聚合酶、M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂，并加入非竞争性内参基因，经一步法荧光RT-PCR实验，可快速、准确对新冠病毒进行鉴定和检测，从而避免了新冠病毒检测的假阴性和假阳性，并且，从从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。本发明的检测方法及试剂盒可用于鼻/咽拭子/全血/血清样本中新冠病毒核酸定性检测，检测灵敏度高，特异性强，且操作简便、检测可靠性高。
附图说明
图1是本发明的荧光定量PCR特异性实验结果图；其中：1为2019-nCoV 新型冠状病毒；2为SARS冠状病毒；3为流感病毒A型；4为流感病毒B型； 5为流感病毒C型病毒；6为冠状病毒229E；7为偏肺病毒HMP；
图2是本发明荧光定量PCR灵敏度实验结果图；其中，以CT值为纵坐标，拷贝数为横坐标，1为1X100copies/μL；2为1X101copies/μL；3为1X102copies/ μL；4为1X103copies/μL；5为1X104copies/μL；6为1X105copies/μL；7为 1X106copies/μL；8为1X107copies/μL；9为1X108copies/μL；
图3为本发明荧光定量PCR标准曲线图；其中，标准曲线方程为： y＝15.683x0.0428；R2＝0.9963。
具体实施方式
本发明所述一种检测2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法，是基于相应型别ORF1ab基因段设计的特异性引物和探针。下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：引物和探针的设计
通过对已知2019-nCoV新型冠状病毒的核酸序列进行对比分析，以病毒 ORF1ab基因为扩增靶位点，选择高度保守区段设计特异性引物和探针序列，并对引物和探针质量进行评估，将选定的ORF1ab基因引物和探针序列以及RPP30 内参基因的引物和探针序列由TakaRa宝生物(大连)公司合成。所有引物以及探针序列如表1所示：
表1引物序列和探针序列
实施例2：2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒
制备下列组成成分的试剂盒：
0.8uL PT-PCR反应液：Tris-HCI 20-40mM、KCI 100--200mM、MgS0.3-6mM. 4；
4uL酶混合液：高耐受性Taq DNA聚合酶的用量为4-6U/反应、耐热型 M-MLV逆转录酶的用量为2-2.5U/反应、RNA酶抑制剂12-20U/反应，酶保存液补充至4uL；
2uL 10×Solution：四甲基氯化铵20-40mM、海藻糖4％体积比、甘油0.05-0. 1mM、三氮化钠4.5E～-9E；
0.25uL ORF1ab基因的正向引物(如SEQ ID NO：1所示)；
0.25uLORF1ab基因的反向引物(如SEQ ID NO：2所示)；
0.2uL ORF1ab基因的探针(如SEQ ID NO：3所示)；
0.25uL RPP30内参基因的正向引物(如SEQ ID NO：4所示)；
0.25uL RPP30内参基因的反向引物(如SEQ ID NO：5所示)；
0.2uL RPP30内参基因的探针(如SEQ ID NO：6所示)；
0.4uL新型冠状病毒2019-nCoV模板，无菌水补足至20uL。
以及，阴性对照和阳性对照各20uL，其中阴性对照为无菌生理盐水，阳性对照为由人工合成的浓度1×106Copies/ml的2019-nCoV新型冠状病毒基因序列重组的假病毒。
实施例3：应用2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒检测检测样品
1、样品的准备：以含有目的扩增区域的假病毒作为2019-nCoV新型冠状病毒的阳性对照，以SARS冠状病毒、流感病毒A型，流感病毒B型、流感病毒C型病毒、冠状病毒229E、偏肺病毒HMP作为特异性特异性参考对照，以无菌生理盐水作为阴性对照，分别提取上述阳性对照和特异性参考对照的RNA，阴性对照待用。
2、样本的采集：又临床医师根据实际情况金西行样本采集，可检测的样本包括鼻/咽拭子/全血/血清。采集的样本按照常规要求处理后，密封保存并低温送检。
3、检测方法
1)RNA提取
取上述类型的样本各100μL，通过常规RNA/DNA提取方法提取，得到50 μl核酸产物，使用DEPC水对核酸提取产物10倍稀释后作为模板。
2)PCR反应与结果分析
分别取0.8uL PT-PCR反应液、4uL酶混合液、2uL 10×Solution、0.25uL ORF1ab基因的正向引物、0.25uLORF1ab基因的反向引物、0.2uL ORF1ab基因的探针、0.25uL RPP30内参基因的正向引物、0.25uL RPP30内参基因的反向引物、0.2uL RPP30内参基因的探针0.4uL新型冠状病毒2019-nCoV模板，无菌水补足至20uL，构成2019-nCoV新型冠状病毒反应体系；
取阴性对照、特异性参考对照、阳性对照各5μl，加入2019-nCoV新型冠状病毒反应体系使用市售的荧光定量PCR仪(如ABI7500)进行PCR扩增。PCR 循环条件是：42℃逆转录30min，1个循环；95℃5min，1个循环；94℃变形 30sec，，60℃退火、延伸及荧光采集1min，45个循环。
反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。结果如图1所示，仅2019-nCoV质粒存在明显的扩增，其他样品均无扩增，说明由本发明的引物和探针构成的试剂盒具有良好的特异性。
实施例4：2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒灵敏度实验
分别由浓度为1.0×108copies/ml、1.0×107copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×105 copies/ml、1.0×104copies/mll、1.0×103copies/ml、1.0×102copies/m、1.0×101copies/ml、 1.0×100copies/ml的2019-nCoV新型冠状病毒阳性标准质粒，每个梯度设置3个重复，按照实施例2的方法分别检测这9份样本，进行荧光定量PCR反应，进行该产品的敏感性实验。结果如图2所示，该方法可以有效检测出10拷贝的样本，当样本浓度大于10copies/μL时均能出现明显的扩增。然后以CT值为纵坐标，拷贝数为横坐标，建立标准曲线，标准曲线方程为：y＝15.683x0.0428；R2＝0.9963，标准曲线如图3所示。
序列表
<110>
<120>检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法
<130>中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司职工医院
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>27
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(27)
<223>根据实验要求而设计，作为2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列
<400>1
CTTATTACAGAAGGTAGTGTTAAAGGT 27
<210>2
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(26)
<223>根据实验要求而设计，作为2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的反向引物序列
<400>2
TAATTGAACTGTGTTTTTACGGCTTC 26
<210>3
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(28)
<223>根据实验要求而设计，作为2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列
<400>3
ACAACCATCTGTAGGTCCCAAACAAGCT 28
<210>4
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(20)
<223>根据实验要求而设计，作为RPP30内参基因的正向引物序列
<400>4
ACGAGGTGGGACTTCAGCAT 20
<210>5
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(19)
<223>根据实验要求而设计，作为RPP30内参基因的反向引物序列
<400>5
CGCAGAGCCTTCAGGTCAG 19
<210>6
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<222>(1)-(24)
<223>根据实验要求而设计，作为RPP30内参基因的探针序列
<400>6
AACCCGCTCGCAGGTCCAAATCTG 24
Claims (10)
1.一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针，其特征在于，包括2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列包含如SEQIDNo.3所示，RPP30内参基因的正向引物序列如SEQ ID No.4所示，反向引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列包含如SEQIDNo.6所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针，其特征在于，所述2019-nCoV新型冠状病毒ORF1ab基因的探针以及RPP30内参基因的探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团TAMRA或BHQ-1。
3.一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的反应体系主要含有：PT-PCR反应液、酶混合液、10×Solution。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的反应体系具体成分为：0.8uL PT-PCR反应液、4uL酶混合液、2uL 10×Solution、0.25uL ORF1ab基因的正向引物、0.25 uLORF1ab基因的反向引物、0.2uL ORF1ab基因的探针、0.25uL RPP30内参基因的正向引物、0.25uL RPP30内参基因的反向引物、0.2uL RPP30内参基因的探针0.4uL新型冠状病毒2019-nCoV模板，无菌水补足至20uL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液为高耐受性Taq DNA聚合酶、耐热型M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP和酶保存液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为无菌生理盐水，阳性对照为人工合成的浓度1×106Copies/ml的2019-nCoV新型冠状病毒基因序列重组的假病毒。
8.一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的检测方法，其特征在于，使用了权利要求1所述的引物和探针或使用了权利要求3所述的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒的RNA为模板；
(2)以提取的RNA作为模板，用权利要求1所述的引物以及探针配置扩增反应体系，直接经一步法RT-PCR进行实时荧光扩增，得到荧光扩增曲线；
(3)对所述银光扩增曲线进行判断是否存在2019-nCoV新型冠状病毒。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系的反应参数以及扩增程序为：42℃逆转录30min，1个循环；95℃5min，1个循环；94℃变形30sec，，60℃退火、延伸及荧光采集1min，45个循环。
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