CN116219071B - 一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒 - Google Patents
一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒。本发明所述多重qPCR试剂盒中含有用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合，所述试剂盒的检测特异性好、灵敏度高，检测样本的浓度为200copies/mL及以上时的检出率为100％。除所述多重qPCR引物和探针组合外，该试剂盒中同时还含有内标基因的检测引物和探针，可以对采集样本的质量及PCR抑制因素进行评估，对检测过程进行质量控制，使检测结果更加准确，重复性极好，对于猴痘病毒感染者的正确治疗及疫情的控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒。
背景技术
猴痘病毒(MPXV)是一种可引发与天花类似症状(毒血症状和皮肤脓包)的双链DNA病毒，潜伏期为6～16天，通过血液和体液在人与人之间传播。目前已知感染人类的猴痘病毒分为猴痘病毒I型(中非分支)和猴痘病毒II型(西非分支)两种；其中，猴痘病毒II型又包含两个亚型，分别为猴痘病毒IIa型和IIb型。与猴痘病毒I型相比，猴痘病毒II型的致死率更低，致使感染不同型别的猴痘病毒后的处置方式有所不同。猴痘病毒IIb型虽很少引起致命的感染，但对免疫系统薄弱，有湿疹病史，以及处于妊娠或哺乳期等的人来说，感染后可能更容易患重病或死亡。因此，对不同型别的猴痘病毒进行区分检测，有助于开展及时、准确的治疗，也是阻碍猴痘传播的关键。
目前，检测猴痘病毒的方法主要包括形态学法、测序法、qPCR法以及血清学检测法。其中，形态学病毒检测法，主要通过根据生长特征可区分痘病毒和其他种属，该法只可鉴别正痘病毒和负痘病毒，但它不能区分种类，还得依赖血清学试验，生物学试验和DNA分析试验等实验，才得以确认猴痘病毒的存在，因而周期长，依赖设备昂贵，操作极其繁琐。测序检测需要配合测序专用的仪器进行使用，样品质量要求高、通量有限、适用性较差，且对操作人员的技术水平要求较高。血清学检测法属于抗体检测，主要是检测患者的血清中是否含有目标病毒特异性抗体，但正痘病毒基因组内抗原部分很保守，导致血清学检测时易产生广泛的交叉反应，研究进展较为缓慢：其次，患者从感染病毒到体内生成抗体需要的时间较长，通常只能检测出感染时间较长的患者，对处于潜伏期患者的检测效果不佳，且不利于患者的管控。对比之下，qPCR诊断法通过加入特异的荧光标记探针可对扩增产物进行实时检测，因而更省时、特异性高、并能精确地对多个样本进行定量分析，可以快速定位爆发人群的范围，适合于疾病爆发的流行病学评估以及回顾性人群研究。但现有用于检测猴痘病毒的试剂盒等多存在对感染初期患者的检测灵敏度低、准确性差且基因分型难确定的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合。
本发明的第二个目的是提供一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合。
本发明的第三个目的是提供任一所述多重qPCR引物和探针组合在制备检测并鉴别猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和/或猴痘病毒IIb型的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒。
本发明的第五个目的是提供一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种可用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合；所述用于检测猴痘病毒IIa型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测猴痘病毒IIb型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述探针的5’端标记有不同的荧光发生基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明同时还提供了一种可用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合，所述用于检测猴痘病毒I型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.1～2所示，用于检测猴痘病毒I型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测猴痘病毒IIa型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测猴痘病毒IIb型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述探针的5’端标记有不同的荧光发生基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明同时还基于内标基因(RNaseP)获得了可与上述多重qPCR引物和探针组合同时使用的内标基因的检测引物和探针，可以对采集样本的质量及PCR抑制因素进行评估，对检测过程进行质量控制，使检测结果更加准确，避免假阴性结果出现。
具体地，用于检测内标基因RNaseP的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.10～11所示，用于检测内标基因RNaseP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述探针的5’端标记有与上述检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的探针不同的荧光发生基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团
具体地，当检测没有检出RNaseP时，代表核酸中没有人的DNA，需要重新提取，重新提取后如果依然没有检出，则代表采样没有采集到人的细胞，需要重新采样。
具体地，所述荧光发生基团选自FAM、HEX、ROX或Cy5；所述荧光淬灭基团为MGB。
在本发明的实施例中，所述用于检测猴痘病毒I型的探针的5’端标记有荧光发生基团FAM，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的5’端标记有荧光发生基团HEX，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的5’端标记有荧光发生基团ROX，用于检测内标基因RNaseP的探针的5’端标记有荧光发生基团Cy5，上述探针的3’端均标记有荧光淬灭基团MGB。
本发明所述多重qPCR引物和探针组合可以在同管反应体系中检测并鉴别出猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型。因此，本发明还申请保护所述多重qPCR引物和探针组合在制备检测并鉴别猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和/或猴痘病毒IIb型的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.4～9所示多重qPCR引物和探针组合或SEQ ID NO.4～12所示多重qPCR引物和探针组合。
本发明同时申请保护该试剂盒在检测并鉴别猴痘病毒IIa型和/或IIb型中的应用。
本发明还提供了一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1～9所示多重qPCR引物和探针组合或SEQ IDNO.1～12所示多重qPCR引物和探针组合。
本发明同时还申请保护该试剂盒在检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和/或IIb型中的应用。
具体地，上述两种试剂盒中所含有的多重qPCR引物的使用浓度为160～200nM，探针的使用浓度为80～120nM。
具体地，上述两种试剂盒中还含有qPCR缓冲液和酶反应混合液；所述qPCR缓冲液由以下组分组成：28～32mol/L pH 8.0Tris-HCl、16～20mmol/L(NH4)2SO4、24～28mmol/LKCl、2.5～3.0mmol/L MgCl2和0.20～0.25mol/L dNTPs；所述酶反应混合液中包括热启动Taq酶尿嘧啶糖基化酶，热启动Taq酶的用量为2～10U/反应，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1～0.3U/反应。通过加入尿嘧啶糖基化酶可以防止样本被污染，避免假阳性结果的出现。
具体地，上述两种试剂盒中还含有空白对照和阳性对照；所述空白对照为无核酸酶的水；所述阳性对照为含有所检测的猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型、猴痘病毒IIb型和内标基因RNaseP的靶基因片段的质粒。
具体地，所述阳性对照可以是将各靶基因片段串联后再连接至质粒中制备得到，也可以分别将各靶基因片段连接至质粒中后再混合制备得到。
具体地，所述阳性对照中质粒的浓度为0.8×105～1.2×105copies/mL。
本发明还提供了一种利用上述多重qPCR引物和探针组合或试剂盒检测并鉴别猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和/或猴痘病毒IIb型的方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样本核酸；
S2.分别以步骤S1所得核酸、空白对照和阳性对照为模板，加入SEQ ID NO.1～12所示qPCR引物和探针配制反应体系，进行qPCR检测；
S3.根据扩增曲线和反应Ct值进行结果判断：
其中，空白对照在FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，阳性对照在FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值≤35且有明显扩增曲线时，检测过程有效；在此基础上，再进一步对样本检测结果进行判断；具体判断方法如下：
(1)若FAM、HEX和ROX通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，而Cy5通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型阴性；
(2)若FAM通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒I型阳性；
(3)若HEX通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒IIa型阳性；
(4)若ROX通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒IIb型阳性；
(5)若FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，则所测样本为无效样本，需要重新检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种可用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合。在此基础上，本发明还提供了相应的试剂盒，利用所述试剂盒可以在同个反应体系中对不同型别的猴痘病毒进行检测，缩短检测时间，且检测特异性好、灵敏度高，检测样本的浓度为200copies/mL及以上时的检出率为100％。
除用于检测猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的多重qPCR引物和探针组合外，所述试剂盒中还设置了内标基因的检测引物和探针，可以对采集样本的质量及PCR抑制因素进行评估，对检测的过程进行质量控制，使检测结果更加准确，对于猴痘病毒感染者的救治及疫情的控制具有重要意义。
附图说明
图1为表1所示用于同时检测猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的多重qPCR引物和探针组合对阳性对照的扩增曲线。
图2为本发明所述试剂盒对不同浓度(1×106、1×105、1×104、1×103、200、100copies/mL)的猴痘病毒I型基因质粒的检测扩增曲线。
图3为本发明所述试剂盒对浓度为200copies/mL的猴痘病毒I型基因质粒的20次重复检测的扩增曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1多重qPCR引物与探针的获得与检测方法的建立
1、引物与探针的获得
本发明通过对猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的基因组序列进行分析比对，选择了多个不同的基因作为目的基因，分别设计了多组qPCR引物和探针。在所设计的qPCR引物和探针的基础上，结合实际检测结果再对qPCR引物和探针的序列和组合进行创造性调整，经多次的检测、调整、再检测后，最终获得了一组可在同个反应体系中同时检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型且检测效果好的多重qPCR引物和探针组合。本发明同时还基于内标基因(RNaseP)获得了可与上述多重qPCR引物和探针组合同时使用的内标基因的检测引物和探针。本发明最终选定的用于同时检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合，以及内标基因检测引物和探针的核苷酸序列如表1所示。本发明同时提供了实验过程中所使用过的其他多重qPCR引物和探针组合的核苷酸序列作为对比，分别如表2～5所示。
表1本发明所述多重qPCR引物和探针组合
表2对比组1
表3对比组2
表4对比组3
表5对比组4
上述用于检测猴痘病毒I型的探针的5’端标记有荧光发生基团FAM，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的5’端标记有荧光发生基团HEX，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的5’端标记有荧光发生基团ROX，用于检测内标基因RNaseP的探针的5’端标记有荧光发生基团Cy5，上述探针的3’端均标记有荧光淬灭基团MGB。
2、特异性和检出敏感性检测
本发明经过相适应的检测体系优化探索，建立了上述qPCR引物和探针的扩增反应体系，并对表1～5所示多重qPCR引物和探针组合的检测特异性进行了测试，特异性检测所用病毒样本为灭活痘苗病毒、牛痘病毒、骆驼痘病毒、沙鼠痘病毒、天花病毒、小鼠脱脚病毒、浣熊痘病毒、马痘病毒、田鼠痘病毒和臭鼬痘病毒，同时使用人基因组DNA样本作为对照，使用无核酸酶的水作为空白对照，使用含有所检测的猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型、猴痘病毒IIb型和内标基因RNaseP的靶基因片段的质粒，即猴痘病毒I型基因质粒、猴痘病毒IIa型基因质粒、猴痘病毒IIb型基因质粒和内标基因质粒混合后作为阳性对照。
特异性检测结果如表6所示：
表6特异性检测结果
表1所示用于同时检测猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的多重qPCR引物和探针组合对阳性对照的扩增曲线如图1所示，由图1可知，表1所示多重qPCR引物和探针组合对阳性对照的扩增结果与预期相符，qPCR引物和探针与样本间无交叉反应，特异性好，表明反应体系无误，证明了检测结果的准确性。
在表6所示特异性检测结果的基础上，本发明以所述阳性对照为模板，对表1、表4和表5所示引物和探针组合的检出敏感性进行了检测，结果如表7所示：
表7检出敏感性检测结果
由表6和表7所示检测结果可知，相较于对比组1～4，表1所示多重qPCR引物和探针组合的检测特异性和检出敏感性最优。除上述多重qPCR引物和探针组合外，本发明也曾利用不同组别中对猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型单个检测效果较好的引物和探针进行了组合，但重新组合所得引物和探针组合的检出敏感性也不如表1所示多重qPCR引物和探针组合。表1所示多重qPCR引物和探针组合不仅可以在同个反应体系中同时对猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型进行检测，缩短检测所需时间，且检测特异性好，检测结果准确。
实施例2猴痘病毒分型检测试剂盒及检测方法
在表1所示多重qPCR引物和探针组合的基础上，本发明还提供了用于同时检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的方法，包括以下步骤：
S1.提取待测样本核酸；
S2.分别以步骤S1所得核酸、空白对照和阳性对照为模板，加入SEQ ID NO.1～12所示qPCR引物和探针配制反应体系，进行qPCR检测；
S3.根据扩增曲线和反应Ct值进行结果判断：
其中，空白对照在FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，阳性对照在FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值≤35且有明显扩增曲线时，检测过程有效；在此基础上，再进一步对样本检测结果进行判断；具体判断方法如下：
(1)若FAM、HEX和ROX通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，而Cy5通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型阴性；
(2)若FAM通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒I型阳性；
(3)若HEX通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒IIa型阳性；
(4)若ROX通道有明显扩增曲线且Ct值≤40，则所测样本为猴痘病毒IIb型阳性；
(5)若FAM、HEX、ROX和Cy5通道的Ct值>40或无明显扩增曲线，则所测样本为无效样本，需要重新检测。
反应体系为：PCR反应液20μL，模板5μL，总体积25μL。
所述PCR反应液中包括SEQ ID NO.1～12所示多重qPCR引物和探针、PCR缓冲液和酶反应混合液。所述PCR反应液中，用于检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型以及内标基因RNaseP的qPCR引物的浓度为160～200nM(最佳为200nM)，用于检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型以及内标基因RNaseP的探针的浓度为80～120nM(最佳为100nM)。
所述PCR反应液中，qPCR缓冲液中各组分的终浓度为：28～32mol/L pH 8.0Tris-HCl(最佳为28mol/L)、16～20mmol/L(NH4)2SO4(最佳为20mmol/L)、24～28mmol/L KCl(最佳为26mmol/L)、2.5～3.0mmol/L MgCl2(最佳为2.9mmol/L)和0.20～0.25mol/L dNTPs(最佳为0.25mol/L)。
所述酶反应混合液中包括热启动Taq酶尿嘧啶糖基化酶，在所述PCR反应液中，热启动Taq酶的用量为2～10U/反应(最佳为10U/反应)，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1～0.3U/反应(最佳为0.3U/反应)。
扩增程序如下所示：
50℃，2min；
95℃，30s；
95℃，1s；60℃，15s，循环45次。
本发明还提供了一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1～9或SEQ ID NO.1～12所示多重qPCR引物和探针，以及上述检测方法中配制反应体系所需试剂。
鉴于本发明实施例1中表1所示多重qPCR引物和探针组合可以在同个反应体系中对不同型别的猴痘病毒进行检测并鉴别。因此，基于该多重qPCR引物和探针组合中用于检测猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针，本发明还提供了用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，其中含有SEQ ID NO.4～9或SEQ ID NO.4～12所示多重qPCR引物和探针，以及上述检测方法中配制反应体系所需试剂。
上述试剂盒中还含有空白对照和阳性对照；其中，所述空白对照为无核酸酶的水；所述阳性对照为含有所检测的猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型、猴痘病毒IIb型和内标基因RNaseP的靶基因片段的质粒；所述阳性对照可以是将各靶基因片段串联后再连接至质粒中制备得到，也可以分别将各靶基因片段连接至质粒中后再混合制备得到；所述阳性对照中质粒的浓度为0.8×105～1.2×105copies/mL。
实施例3试剂盒的检测灵敏度
本发明还对实施例2中所述用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒的检测灵敏度进行了测试。将阳性对照中的各基因质粒用血清阴性样本梯度稀释至1×106、1×105、1×104、1×103、200、100copies/mL作为待测样本，参照实施例2中的最佳扩增反应体系和扩增程序进行扩增，结果如表8所示，结果表明最低检测限为200copies/mL。同时，对最低检测出峰的浓度进行20次重复检测，作为最低检出限验证，结果如表9所示，结果表明检出率为100％。
表8灵敏度检测结果
表9最低检出限验证结果
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本发明实施例2所述用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒对不同浓度(1×106、1×105、1×104、1×103、200、100copies/mL)的猴痘病毒I型基因质粒的检测扩增曲线如图2所示，对其余型别基因质粒的检测扩增曲线与图2相似，此处不再赘述。由图2可知，扩增曲线的线性关系较好。
本发明实施例2所述试剂盒对浓度为200copies/mL的猴痘病毒I型基因质粒的20次重复检测扩增曲线如图3所示，对其余型别基因质粒的检测扩增曲线与图3相似，此处不再赘述。由图3可知，20次重复扩增全部检出，检出率为100％。
由上述结果可知，本发明所述用于同时检测猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒的检测特异性好、灵敏度高，对猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的最低检测限均为200copies/mL，检测样本的浓度为200copies/mL及以上时的检出率为100％，检测重复性好，检测结果准确。且所述试剂盒的体系科学，使用方便，可以降低假阴性或假阳性结果的发生概率；可在同一次检测反应中对猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型进行检测，检测用时较短，检测效率高，节省了检测试剂，方便采取针对性的治疗与控制措施，应用价值极高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合，其特征在于，所述用于检测猴痘病毒IIa型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测猴痘病毒IIb型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；还包括用于检测内标基因RNaseP的qPCR引物和探针，用于检测内标基因RNaseP的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.10～11所示，用于检测内标基因RNaseP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述探针的5’端标记有不同的荧光发生基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
2. 一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR引物和探针组合，其特征在于，所述用于检测猴痘病毒I型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，用于检测猴痘病毒I型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测猴痘病毒IIa型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示，用于检测猴痘病毒IIa型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测猴痘病毒IIb型的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示，用于检测猴痘病毒IIb型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；还包括用于检测内标基因RNaseP的qPCR引物和探针，用于检测内标基因RNaseP的qPCR引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.10～11所示，用于检测内标基因RNaseP的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述探针的5’端标记有不同的荧光发生基团，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
3.权利要求1所述的多重qPCR引物和探针组合在制备检测并鉴别猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的产品中的应用。
4.权利要求2所述的多重qPCR引物和探针组合在制备检测并鉴别猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型和猴痘病毒IIb型的产品中的应用。
5.一种用于检测并鉴别猴痘病毒IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述多重qPCR引物和探针组合。
6.一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述多重qPCR引物和探针组合。
7. 根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，试剂盒中所含多重qPCR引物的使用浓度为160～200 nM，探针的使用浓度为80～120 nM。
8. 根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有qPCR缓冲液和酶反应混合液；所述qPCR缓冲液由以下组分组成：28～32 mol/L pH 8.0 Tris-HCl、16～20mmol/L (NH4)2SO4、24～28 mmol/L KCl、2.5～3.0 mmol/L MgCl2和0.20～0.25 mol/LdNTPs；所述酶反应混合液中包括热启动Taq酶和尿嘧啶糖基化酶，热启动Taq酶的用量为2～10 U/反应，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1～0.3 U/反应。
9.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有空白对照和阳性对照；所述空白对照为无核酸酶的水；所述阳性对照为含有所检测猴痘病毒IIa型、猴痘病毒IIb型和内标基因RNaseP的靶基因片段的质粒。
10.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有空白对照和阳性对照；所述空白对照为无核酸酶的水；所述阳性对照为含有所检测的猴痘病毒I型、猴痘病毒IIa型、猴痘病毒IIb型和内标基因RNaseP的靶基因片段的质粒。
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