CN102839224A - 等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂。它包括：（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；（2）引物，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP。本发明还提供了一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，其利用上述试剂，可以快速准确地检测猴痘病毒。

Description

等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法

技术领域

本发明涉及检测猴痘病毒的试剂及方法，尤其涉及利用等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂和方法。 

背景技术

猴痘病毒是一种人畜共患病，多发于中非和西非，1958年首次发现于猴子体内，上世纪70年代首次发现于人类感染猴痘病毒，2003年曾在美国威斯康辛州爆发，造成82人感染。猴痘病毒为双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、头痛、淋巴结肿大、咳嗽和全身极度疼痛，俗称“猴天花”，为未输入我国的危险病毒之一，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播，毒力强的病毒株有可能致死。天花疫苗对猴痘病毒有一定的抵抗能力，目前30岁以下人群均未接种天花疫苗，一旦猴痘病毒传入将造成极大的危害。因此建立快速的猴痘病毒检测方法具有重要的现实意义。 

环介导等温扩增技术是一种高效、特异且不需要特殊仪器的核酸检测手段，针对靶基因的6个特征区域设计4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。它的产物是由多重复靶序列的茎-环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP所特有的阶梯状条带。LAMP反应过程将产生大量的焦磷酸根离子，与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据快速离心或者浊度变化，直观观察检测结果，在基层或者落后地区技术人员只需简单培训就可完成实验操作。 

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，可以用于快速准确地检测猴痘病毒。 

为此，本发明采用以下技术方案：它包括： 

（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列为CCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCATATTAAGTTGTTTAGTTAGTTGTGCAGTAGCTCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGCACACAATCTCTGTGTCAGAACGCTCGTCAATATAGATCGTAGAAATTTTTTAGAGAGAACTAACACAACTAGCAATAAAACTGATCTTATTTTATCATTTTTTTATTCATCATCCTCTGGTGGTTCGTCGTTCCTATCGAATGTAGCTCTGATTAACCCGTCATCTATAGGTGATGCTGGTTCTGGAGATTCTGGAGGAGATGGATTATTAT，如序列表SEQ NO:1所示； 

（2）引物，其基因碱基序列： 

外引物F3：5′-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3′； 

外引物B3：5′-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3′； 

内引物FIP： 

5′-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3′； 

内引物BIP： 

5′-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3′。 

本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，可以快速准确地检测猴痘病毒。 

为此，本发明采用以下技术方案： 

它的反应体系25μl，包括10×buffer2.5μl，引物混合物1μl，模板DNA1μl， 8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2μl，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl；反应体系中引物终浓度分别如下：外引物F3和外引物B3各40pM，内引物FIP和内引物BIP各800pM； 

将上述反应体系在水浴箱上63℃90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63℃1分钟，90个循环，同时进行待测样本、阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品； 

反应结束后，取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，待测样本孔中如产生阶梯状条带则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者，反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒。 

进一步地，本发明检测方法还可进行定量检测。待测样本被检测出阳性后，所述方法通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测；所述浓度检测包括以下步骤： 

将待测样本和稀释至不同浓度的权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品同时按权利要求2所述的反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应程序63℃1分钟，90个循环，读取荧光值，阴性对照采用灭菌双蒸水，反应结束后根据得到所述标准品的各个浓度的循环阈值C（t），采用计算机自动绘制标准曲线； 

通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测，将待测样本循环阈值C（t）与所述标准曲线对照，得到待测样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度，按照所述拷贝浓度判断待测样本中猴痘病毒的浓度。 

本发明具有操作简便，高效、快速、特异的优点。制备的标准品特异性强，碱基差异稳定，使设计的引物只针对猴痘病毒及其亚种，而不会把其他痘病毒或 其他物种扩增出来，纯度高，易保存。引物与整个genbank数据库进行BLAST检索，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法的建立，填补了猴痘病毒恒温核酸扩增检测方法的空白，对样本的检测只需1.5小时左右即可完成，可快速筛查猴痘病毒，对口岸输入性疾病筛查具有重要意义，为防御疾病的传入做好技术支撑和战略储备，满足当前卫生检疫的需求。 

附图说明

图1为实施例1将特异片段克隆入pGSI质粒后的图谱。 

图2为实施例1中将转入质粒的片段与特异序列测序的对比结果。 

图3为实施例2中在25μl体系中加入不同Mg2+浓度扩增后的电泳结果，1为marker:DL2000，2为加入MgSO₄0.9μl，3为MgSO₄1.05μl，4为MgSO₄1.20μl，5为MgSO₄1.35μl，6：MgSO₄1.5μl，7：阴性对照。 

图4为实施例2中在不同的温度下扩增的电泳结果，1为marker:DL2000，2为61℃，3为62℃，4为63℃，5为64℃，6为65℃。 

图5为实施例2中不同浓度的标准品在荧光定量PCR仪上读取的实施曲线，1为2.76×10⁷，2为2.76×10⁶，3为2.76×10⁵，4为2.76×10⁴，5为2.76×10³，6为2.76×10²，7为2.76×10¹，8为2.76×10⁰，9为阴性对照。 

图6为实施例2中根据不同浓度标准品在荧光定量PCR仪上的Ct值绘制的标准曲线。 

图7为实施例2中不同浓度的标准品扩增产物的电泳结果，1为marker:DL2000，2为2.76×10⁷，3为2.76×10⁶，4为2.76×10⁵，5为2.76×10⁴，6为2.76×10³，7为2.76×10²，8为2.76×10¹，9为2.76×10⁰，10为阴性对照。 

图8为实施例2中特异性试验扩增产物的电泳结果，1为marker:DL2000，2为阳性质粒标准品，3为鸡痘疫苗，4为牛痘疫苗，5为羊痘疫苗，6为水痘疫苗，7为阴性对照。 

图9为实施例2中特异性试验的扩增产物离心后的沉淀结果，1为阳性质粒 标准品，2为鸡痘疫苗，3为牛痘疫苗，4为羊痘疫苗，5为水痘疫苗，6为阴性对照。 

图10为实施例2中特异性试验的扩增产物加入荧光染料20×Eva Green后在紫外灯下观察的结果，1为阳性质粒标准品，2为鸡痘疫苗，3为牛痘疫苗，4为羊痘疫苗，5为水痘疫苗，6为阴性对照。 

具体实施方式

实施例1阳性样本标准品的制备 

根据genbank数据库，分析猴痘各亚型基因组序列，经过序列比对，选取片段在猴痘病毒基因组genbank编码HQ857563.1中的位置为48332-48780bp之间，共448个碱基，此段序列碱基差异稳定，能使设计的引物只针对猴痘病毒及其亚种，不会把其他痘病毒或其他物种扩增出来，序列见SEQ ID NO:1及图1。将目的片段克隆入pGSI质粒，转化至大肠杆菌，当外源片段插入到pGSI质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生α-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。挑选白色的阳性菌落进行细菌培养，提取质粒DNA进行测序，将测序正确的克隆，于空气浴摇床37℃振荡培养增菌，培养物用Promega质粒提取试剂盒提取质粒,做为阳性样本标准品，质粒图谱见图2，测定质粒的浓度为100ng/μl。 

将提取的质粒进行测序，并进行序列比对，比对结果见图3，重合率达到100％，从而证明质粒中含有合成的目的片段。根据质粒浓度和质粒长度，根据公式copy数＝摩尔数x6.02x10₍₂₃₎＝3x10₍₁₀₎copies/μl得到质粒的浓度为2.76×10¹⁰copies/μl。 

实施例2，猴痘病毒的检测 

1.引物设计 

根据猴痘特异性序列，用Primer Ex plorerIV软件分析设计一套引物（F3,B3，FIP，BIP），分别是前外引物B3、后外引物F3、前内引物FIP、后内引物BIP：其中FIP是由F1C的互补序列和F2序列组成，BIP是由B1C序列和B2的互补序列组成，。引物基因序列如下： 

外引物F3：5′-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3′； 

外引物B3：5′-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3′； 

内引物FIP： 

5′-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3′； 

内引物BIP： 

5′-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3′。 

2.恒温扩增的反应体系及反应温度 

反应体系为25μl，组分包括10×buffer2.5μl，引物混合物1μl（体系中引物终浓度分别如下：F3、B3各40pM，FIP、BIP各800pM），模板DNA1μl，8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，1.25μl荧光染料20×Eva Green，调节MgSO₄(100mM)用量，加入ddH₂O补足25μl。反应温度选择61-65℃之间，90分钟，根据扩增效率的选择最优的反应条件。 

2.1.反应体系Mg²⁺浓度的优化 

调节反应体系的Mg²⁺浓度，在反应体系中加入MgSO₄(100mM)0.9/1.05/1.2/1.35/1.5μl，分别用水补足25μl。如图4，在25μl体系中，加入浓度为100mM的镁离子1.20μl时扩增效率为最高。 

2.2.反应温度的优化 

比较不同温度对反应的影响，见图5，在61-65℃之间，63℃为最佳的反应扩增温度。 

3.灵敏度试验及标准曲线制备 

将克隆有目的基因片段的pGSI质粒作为阳性样本标准品DNA模板，质粒标准品的灵敏度及线性分析：取已知浓度的阳性模板，10倍倍比稀释至2.76、2.76×10¹、2.76×10²、2.76×10³、2.76×10⁴、2.76×10⁵、2.76×10⁶、2.76×10⁷，分别取1μl加入反应体系进行63℃1分钟，荧光检测，共90个循环在实时荧光定量PCR仪上进行恒温扩增检测，从图6，图7，图8，表1可见，本方法可检出27.6个拷贝的质粒DNA分子。 

如图6，图7，图8所示，将上述数据进行回归分析，得到回归方程为：Y=-0.1241X+12.29，相关系数为0.995。实验结果表明，在2.76×10¹-2.76×10⁷拷贝范围之间，样本拷贝数与其相应的CT值具有良好的相关性，因此，本方法可对2.76×10¹-2.76×10⁷拷贝范围内的模板进行定量。 

表1检测质粒DNA的灵敏度分析 

4.特异性试验 

将重组质粒阳性标准品与羊痘疫苗、鸡痘疫苗、牛痘疫苗、水痘疫苗等其他痘类病毒疫苗利用DNA抽提试剂盒根据说明书提取DNA，扩增反应体系为10×buffer2.5μl，引物混合物1μl（体系中引物终浓度分别如下：F3、B3各40pM，FIP、BIP各800pM），模板DNA1μl，8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2ul，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl。以灭菌双蒸水为阴性对照，含有猴痘特异基因序列的pGSI质粒标准品为阳性对照。反应程序为63℃，90分钟。反应结束后观察特异性试验 结果，图9可见质粒阳性标准品的电泳结果为阶梯状条带，其他病毒未扩增出条带；图10可见质粒阳性标准品离心6000rpm，3分钟后有白色沉淀，其他病毒未见；图10可见质粒阳性标准品紫外灯下可见明显的绿色荧光，其他病毒未见。结果表明该方法具有很好的检测特异性。 

实施例3，人血清中猴痘病毒的检测 

采用机场口岸入境的发热病人血清15人份，利用DNA抽提试剂盒根据说明书提取DNA，反应体系为10×buffer2.5μl，引物混合物1μl（体系中引物终浓度分别如下：F3、B3各40pM，FIP、BIP各800pM），模板DNA1μl，8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2ul，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl；以灭菌双蒸水为阴性对照，含有猴痘特异基因序列的pGSI质粒标准品为阳性对照。反应程序为63℃，90分钟。反应结束后观察结果，15例发热病人血清样本反应结果离心6000rpm，3分钟未见沉淀，紫外灯下没有强绿色荧光产生，产物电泳没有出现特异的阶梯状条带，猴痘病毒检测结果为阴性。 

<110>  浙江国际旅行卫生保健中心

 

<120>  等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  448

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cctctctcat tgatttttcg cgggatacat catctattat agcatcagca tcagaatctg     60

 

taggccgtgt atcagcatcc attgtcgtag accaacgagg aggagtatcg tcggaactgt    120

 

acaccatagt actacgttga agatcataca gagctttatt aacttctcgc ttctccatat    180

 

taagttgttt agttagttgt gcagtagctc cttagtccaa tgtttttaat aaccgcacac    240

 

aatctctgtg tcagaacgct cgtcaatata gatcgtagaa attttttaga gagaactaac    300

 

acaactagca ataaaactga tcttatttta tcattttttt attcatcatc ctctggtggt    360

 

tcgtcgttcc tatcgaatgt agctctgatt aacccgtcat ctataggtga tgctggttct    420

 

ggagattctg gaggagatgg attattat                                       448

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cattgatttt tcgcgggata                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tccatctcct ccagaatctc c                                               21

 

 

<210>  4

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gttggtctac gacaatggat gctcatcaga atctgtaggc cgtgt                     45

 

 

<210>  5

<211>  55

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tccttagtcc aatgttttta ataaccgaaa aatttctacg atctatattg acgag          55

Claims (3)

1.一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，其特征在于，它包括：

（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）引物，其基因碱基序列：

外引物F3：5′-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3′；

外引物B3：5′-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3′；

内引物FIP：

5′-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3′；

内引物BIP：

5′-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3′。

2.一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，其特征在于：

它的反应体系25μl，包括10×buffer2.5μl，引物混合物1μl，模板DNA1μl，8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2μl，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl；反应体系中引物终浓度分别如下：外引物F3和外引物B3各40pM，内引物FIP和内引物BIP各800pM；

将上述反应体系在水浴箱上63℃90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63℃1分钟，90个循环，同时进行待测样本、阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品；

反应结束后，取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，待测样本孔中如产生阶梯状条带则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者，反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒。

3.如权利要求2所述的一种等温扩增检测猴痘病毒方法，其特征在于：

待测样本被检测出阳性后，所述方法通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测；所述浓度检测包括以下步骤：

将待测样本和稀释至不同浓度的权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品同时按权利要求2所述的反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应程序63℃1分钟，90个循环，读取荧光值，阴性对照采用灭菌双蒸水，反应结束后根据得到所述标准品的各个浓度的循环阈值C（t），采用计算机自动绘制标准曲线；

通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测，将待测样本循环阈值C（t）与所述标准曲线对照，得到待测样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度，按照所述拷贝浓度判断待测样本中猴痘病毒的浓度。

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