CN110616272B - 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。用本发明引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

Description

检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
技术领域
本发明属于水产病原生物检测试剂技术领域，具体涉及一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒。
背景技术
近年来，随着养虾业的再次兴旺，对虾养殖规模不断扩大，但由于对虾病害严重，给对虾养殖业造成了较大的经济损失。对虾肝肠胞虫病(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是对虾养殖中危害严重的病害之一。目前，EHP已在中国多个对虾养殖区被检出，且检出率有增加的趋势。
肝肠胞虫属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。成熟的孢子呈椭圆形，长度0.75-1μm，后端有一个空泡，胞内含一个细胞核，5-6个极丝圈，1个与极丝相连的锚盘，和1层电子致密的孢子壁。我国最早于2013年在养殖的凡纳滨对虾中检出了EHP的感染，并且检测样品中具有很高的阳性检出率；对虾虾肝肠胞虫寄生发病率约为25％，导致养殖产量减少15-20％，在全年较少发生白斑综合症的情况下，EHP的感染产生的经济损失达3亿元。EHP感染可导致虾免疫力降低，继而由水体中的条件致病菌引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等多种病症。EHP可以直接通过养殖水体在对虾中直接水平传播，即通过虾传播，虾经口摄食寄生EHP的死虾/病虾、鲜活饵料或环境中的孢子体而感染。孢子可在养殖环境中累积，从而导致疫情的传播。
隐孢子虫在世界上的分布非常广，是一种体积微小的球虫类寄生虫，众多脊椎动物都有隐孢子虫。但目前EHP感染还没有有效的防治药物，而EHP比一般的微孢子虫小，且不形成肉眼可见的胞囊，且感染EHP的对虾不表现出明显的疾病症状，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大批死亡。因此，需要在实验室采用组织学或分子生物学方法确诊。也就是说苗种产地检疫工作中进行该病原的定性或定量检测，对于该病的预防具有重要意义。
通常采用PCR方法检测对虾肝肠胞虫，虽然灵敏度高，但对仪器的要求严格，易出现假阳性。随着分子生物学的发展，新型PCR检测方法不断涌现，例如，专利文件201510287845.8提供了一种套式引物用于养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警，其主要是基于两对引物进行PCR扩增，虽然该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，但是，其检测过程仍需依赖PCR仪，检测过程也需要专门仪器。专利文件201610429433.8公开了一种引物组配合使用的探针采用TaqMan实时荧光定量PCR检测虾肝肠胞虫，其检测方法虽比普通PCR的灵敏度高，而且免去了电泳等复杂的操作，但是其检测设备仍需依赖荧光定量PCR仪。专利201710538284.3提供一种南美白对虾肝肠胞虫LAMP检测的方法，降低了肝肠胞虫检测对大型昂贵仪器的依赖，简化了常规PCR检测繁琐的操作流程；但是，其染料选择羟基萘酚蓝，可通过肉眼辨别接测结果为紫罗兰色或天兰色来判别检测结果的阴性或阳性；然而相对于目标物拷贝数少的样品则难以区分颜色差别；而且现有LAMP等温扩增技术由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用比较局限。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本发明引物组检测对虾肝肠胞虫，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
检测对虾肝肠胞虫的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列的第76～279位、第240～439位或479～671位核酸序列或与其互补的碱基序列或其转录的RNA序列设计。
在上述方案的基础上，所述引物组序列为：
F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’；
B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’；
FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’；
BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’；
LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’；
或
F3：5’-TGAGTTTGTTGAGAGTAGCGG-3’；
B3：5’-CCCAGCATTGTCGGCATAG-3’；
FIP：5’-GCTTTCGCCTCCGTTGGTCCGAGCATGGTATAGGTGGGC-3’；
BIP：5’-GACGTATCTGGGGATCAAGGACGGCTAGAACTACAGCGGTGTC-3’；
LF：5’-AGGTGGGGTCTTGAGATTTCATTC-3’；
LB：5’-AAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATT-3’；
或
F3：5’-TTTCGGGCTCTGGGGATA-3’；
B3：5’-TCGCCCCATCAATTTCCAAC-3’；
FIP：5’-AGCACAATCCACTCCTGGTAGTGGCTCGCAAGGGTGAAACT-3’；
BIP：5’-TCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGCACCACTCTTGTCTACCTC-3’；
LF：5’-TCCTTCCGTCAATTTCGCTTT-3’。
上述引物组在制备对虾肝肠胞虫检测试剂中的应用。
一种对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，包含上述的至少一组引物组。
在上述方案的基础上，所述对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
在上述方案的基础上，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
本发明的有益效果：
本发明应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)，根据对虾肝肠胞虫基因中的一段序列SEQ ID No:1，采用PrimerExploer V4软件设计3套LAMP特异性引物组合，分别记为EHP-1、EHP-2、EHP-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和环引物(LF和/或LB)。通过筛选，最终确定将EHP-1和EHP-3用于检测对虾肝肠胞虫，并对其特异性和灵敏度进行验证，结果显示，EHP-1和EHP-3对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌均无非特异性扩增，EHP-1和EHP-3最低检测含量为83-27copies/μL。
本发明应用LAMP法可以从分子水平上直接、快速、准确的检测对虾肝肠胞虫，并具有如下优点：1、操作简单：在恒温热水浴即可完成操作，不需要对模板进行热变性处理，节省了因温度循环而消耗的时间，对仪器依赖性小；2、反应迅速：在10～20min即可完成反应；3、特异性强：本发明的引物对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌均无非特异性扩增；4、鉴定方便：反应中从dNTPs中解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，用肉眼即可观察到反应结果，借助浊度仪可获得精确的结果；此外，在反应体系中添加钙黄绿素，有核酸扩增的反应产物在紫外光下可观察到黄绿色荧光；5、灵敏度高：本发明EHP-1和EHP-3最低检测含量为83-27copies/μL。6、本发明试剂盒中的阳性对照为含有SEQ ID No:1序列的阳性质粒，稳定性好，浓度高，能够对检测的样品起到定性定量分析的作用。
附图说明
图1对虾肝肠胞虫引物初步筛选结果；
图2EHP-1引物组灵敏性实验结果；
图3紫外光下EHP-1引物组灵敏性实验结果(从左到右各管依次为：100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL、水)；
图4EHP-2引物组灵敏性实验结果；
图5紫外光下EHP-2引物组灵敏性实验结果(从左到右各管依次为：100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、33fg/μL、11fg/μL、3.7fg/μL、1.2fg/μL、0.4fg/μL、水)；
图6EHP-3引物组灵敏性实验结果；
图7紫外光下EHP-3引物组灵敏性实验结果(从左到右各管依次为：100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL、水)；
图8EHP-1引物组特异性试验结果；
图9紫外光下EHP-1引物组特异性试验结果(从左到右各管依次为：虾肝肠胞虫、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌)；
图10EHP-3引物组特异性试验结果；
图11紫外光下EHP-3引物组特异性试验结果(从左到右各管依次为：虾肝肠胞虫、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌)。
具体实施方式
本发明中的试样可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自活体的标本和培养细胞等含对虾肝肠胞虫的样本，也可以来自于被怀疑感染对虾肝肠胞虫生物的活体样本，这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。
使用本发明的引物进行核酸扩增检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化，具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡聚核酸、作为核酸合成底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、具有反转录活性的酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、阳性对照核酸、使酶和模板稳定化的保护试剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。
实施例1
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
1、引物的设计与合成
根据序列SEQ ID No:1采用PrimerExplorer V4软件设计LAMP引物，选取内引物FIP/BIP的Tm值在65度左右，外引物F3/B3的温度为60度左右，FIP/BIP的5′端dataG值小于等于-4kcal/mol，F3/B3的3′端dataG值小于等于-4kcal/mol，GC含量在40％-60％之间，引物扩增片段在200bp左右的引物作为初筛引物，并分别记为EHP-1、EHP-2、EHP-3，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条或两条环引物(LF和/或LB)。其核苷酸序列分别如下：
EHP-1：
F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’(SEQ ID No:2)；
B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’(SEQ ID No:3)；
FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’(SEQ ID No:4)；
BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’(SEQ ID No:5)；
LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’(SEQ ID No:6)；
EHP-2
F3：5’-TGAGTTTGTTGAGAGTAGCGG-3’(SEQ ID No:7)；
B3：5’-CCCAGCATTGTCGGCATAG-3’(SEQ ID No:8)；
FIP：5’-GCTTTCGCCTCCGTTGGTCCGAGCATGGTATAGGTGGGC-3’(SEQ ID No:9)；
BIP：5’-GACGTATCTGGGGATCAAGGACGGCTAGAACTACAGCGGTGTC-3’(SEQ ID No:10)；
LF：5’-AGGTGGGGTCTTGAGATTTCATTC-3’(SEQ ID No:11)；
LB：5’-AAGGCTAGAGTATCGAAAGTGATT-3’(SEQ ID No:12)；
EHP-3
F3：5’-TTTCGGGCTCTGGGGATA-3’(SEQ ID No:13)；
B3：5’-TCGCCCCATCAATTTCCAAC-3’(SEQ ID No:14)；
FIP：5’-AGCACAATCCACTCCTGGTAGTGGCTCGCAAGGGTGAAACT-3’(SEQ ID No:15)；
BIP：5’-TCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGCACCACTCTTGTCTACCTC-3’(SEQ ID No:16)；
LF：5’-TCCTTCCGTCAATTTCGCTTT-3’(SEQ ID No:17)。
将上述引物序列交由上海生工生物工程有限公司合成。
2、对虾肝肠胞虫阳性质粒的构建
将SEQ ID No:1所示核酸序列构建到克隆载体pMD18-T中，转化、筛选获得阳性质粒。
3、引物的初步筛选
将EHP-1、EHP-2和EHP-3引物组合分别以制备的对虾肝肠胞虫的阳性质粒和水为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B35pmol，环引物20pmol；反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
Figure BDA0002271641620000061
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
试验结果如图1所示：
由图1可知，本发明设计的引物组EHP-1、EHP-2、EHP-3针对于EHP阳性质粒在10～20分钟之间均出现扩增，因而，本发明三组引物均具有较高的扩增效率，水对照组均未出现非特异性扩增，后续针对灵敏度特异性等进一步确定引物。
4、灵敏度检测
4.1 EHP-1的灵敏度检测
将上述合成的浓度为1ng/μL的EHP阳性质粒依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL等，用作灵敏度试验。
采用EHP-1引物组，分别以100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL浓度的EHP阳性质粒为模板，25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上64℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图2和图3所示：EHP阳性质粒含量在100pg/μL～333ag/μL均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见EHP-1引物组的最低检测限为333ag/μL～111ag/μL，约83-27copies/μL。
4.2 EHP-2的灵敏度检测
将上述合成的浓度为1ng/μL的EHP阳性质粒依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、33fg/μL、11fg/μL、3.7fg/μL、1.2fg/μL、0.4fg/μL等，用作灵敏度试验。
采用EHP-2引物组，分别以100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、33fg/μL、11fg/μL、3.7fg/μL、1.2fg/μL、0.4fg/μL浓度的EHP阳性质粒为模板，25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上64℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图4和图5所示：EHP阳性质粒含量在100pg/μL～100fg/μL均能检测到扩增，阴性对照未见扩增，可见EHP-2引物组的最低检测限为100fg/μL～33fg/μL，约2.5×104-8.3×103copies/μL。灵敏度太低，故舍弃。
4.3EHP-3的灵敏度检测
将上述合成的浓度为1ng/μL的EHP阳性质粒依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL等，用作灵敏度试验。
采用EHP-3引物组，分别以100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、333ag/μL、111ag/μL、37ag/μL、12ag/μL浓度的EHP阳性质粒为模板，25μL体系中加入模板2μL，在LAMP实时浊度仪上64℃反应60分钟。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图6和图7所示：EHP阳性质粒含量在100pg/μL～333ag/μL，均能检测到扩增，其中37ag/μL也出现扩增，但是111ag/μL未出现扩增，因而将37ag/μL舍弃，阴性对照未见扩增，可见EHP-3引物组的最低检测限为333ag/μL～111ag/μL，约83-27copies/μL。
5、特异性试验
5.1 EHP-1特异性试验
采用EHP-1引物组，在添加FD的条件下，分别以对虾肝肠胞虫、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B3 5pmol。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图8和图9所示：EHP-1引物组对对虾肝肠胞虫能够有效检测出，而对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌等都未检测出，特异性良好。
5.2 EHP-3特异性试验
采用EHP-3引物组，在添加FD的条件下，分别以对虾肝肠胞虫、水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌为模板，在64℃下进行LAMP反应60分钟，其中，各引物的用量分别为FIP、BIP 40pmol，F3、B3 5pmol。反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
试验结果如图10和图11所示：EHP-3引物组对对虾肝肠胞虫能够有效检测出，而对水、石斑鱼虹彩病毒、石斑鱼神经坏死病毒、白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、哈维氏弧菌、阴性核酸、副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、镰刀真菌等都未检测出，特异性良好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 913
<212> DNA
<213> 肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 1
gatggctccc acgtccaagg gatgcagcag gcgcgaaaat tgtccactct tttgagagga 60
gacagttatg aaacgtgagt agaagggtcg agtgtaaaaa ccttgacgtg aagcaattgg 120
agggcaagtt ttggtgccag cagccgcggt aattccaact ccaagagtgt ctatggtgga 180
tgctgcagtt aaagggtccg tagtcgtaga tgcaattaaa aggtggtgtt aaaagccatt 240
gagtttgttg agagtagcgg aacggatagg gagcatggta taggtgggca aagaatgaaa 300
tctcaagacc ccacctggac caacggaggc gaaagcgatg ctcttagacg tatctgggga 360
tcaaggacga aggctagagt atcgaaagtg attagacacc gctgtagttc tagcagtaaa 420
ctatgccgac aatgctgggt gttgcgagag cgatgcttgg tgtgggagaa atcttagttt 480
tcgggctctg gggatagtac gctcgcaagg gtgaaactta aagcgaaatt gacggaagga 540
cactaccagg agtggattgt gctgcttaat ttaactcaac gcgggaaaac ttaccagggt 600
caagtctatc gtagattgga gacatgaggt agacaagagt ggtgcatggc cgttggaaat 660
tgatggggcg acttttagct taagtgctgg aaccagtgag atcttctaga caggtgttat 720
ttaggcacag gagggagaag gcaataacag gtccgtgatg cccttagata tcctgggcag 780
caagcgcaat acaatatctc ttgagaagac aaagcaattt gagatgagta ggattagctt 840
ttgtaaataa gctatgaatg aggaattcct agtaacagtg tctcatcaag gcattgtgaa 900
tgtgtccctg ttc 913
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 2
tgagtagaag ggtcgagtgt a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 3
accatgctcc ctatccgt 18
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 4
agttggaatt accgcggctg caccttgacg tgaagcaatt gg 42
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 5
tgcagttaaa gggtccgtag tcgtccgcta ctctcaacaa actc 44
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 6
tggcaccaaa acttgccct 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 7
tgagtttgtt gagagtagcg g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 8
cccagcattg tcggcatag 19
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 9
gctttcgcct ccgttggtcc gagcatggta taggtgggc 39
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 10
gacgtatctg gggatcaagg acggctagaa ctacagcggt gtc 43
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 11
aggtggggtc ttgagatttc attc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 12
aaggctagag tatcgaaagt gatt 24
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 13
tttcgggctc tggggata 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 14
tcgccccatc aatttccaac 20
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 15
agcacaatcc actcctggta gtggctcgca agggtgaaac t 41
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 16
tcaacgcggg aaaacttacc agggcaccac tcttgtctac ctc 43
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 17
tccttccgtc aatttcgctt t 21

Claims (5)

1.检测对虾肝肠胞虫的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：
F3：5’-TGAGTAGAAGGGTCGAGTGTA-3’；
B3：5’-ACCATGCTCCCTATCCGT-3’；
FIP：5’-AGTTGGAATTACCGCGGCTGCACCTTGACGTGAAGCAATTGG-3’；
BIP：5’-TGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTCCGCTACTCTCAACAAACTC-3’；
LF：5’-TGGCACCAAAACTTGCCCT-3’；
或
F3：5’-TTTCGGGCTCTGGGGATA-3’；
B3：5’-TCGCCCCATCAATTTCCAAC-3’；
FIP：5’-AGCACAATCCACTCCTGGTAGTGGCTCGCAAGGGTGAAACT-3’；
BIP：5’-TCAACGCGGGAAAACTTACCAGGGCACCACTCTTGTCTACCTC-3’；
LF：5’-TCCTTCCGTCAATTTCGCTTT-3’。
2.权利要求1所述引物组在制备对虾肝肠胞虫检测试剂中的应用。
3.一种对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的至少一组引物组。
4.根据权利要求3所述对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，其特征在于，还包含反应缓冲液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)、钙黄绿素和阳性对照。
5.根据权利要求4所述对虾肝肠胞虫的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有SEQ ID No:1所示核酸序列的T克隆载体。
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