CN113278718A - 一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用。本发明通过设计检测虾肝肠胞虫的引物对，该引物对由引物EHP‑F和EHP‑R组成；以及设计了荧光探针EHP‑P。可以成功实现基于RPA技术对虾肝肠胞虫靶标基因的扩增，本发明检测方法为基于RPA技术，可用于特异性检测虾肝肠胞虫，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，能满足养殖场现场检测的基本需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，进一步地说，是涉及一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
随着南美白对虾养殖规模的不断扩大，对虾疫病的发生成为了对虾养殖业发展的瓶颈之一。虾急性肝胰腺坏死/虾早死综合症(AHPND/EMS)、虾肝肠孢虫病(EHP)等新发疫病，更加重了养殖企业的风险和负担，使得我国对虾养殖成功率逐年下降，严重影响了对虾进出口贸易和对虾养殖产业的发展。
虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)是近几年新发现的寄生于对虾肝胰腺组织的新病原，2009年在泰国的斑节对虾中首次被分离和命名。尽管虾肝肠胞虫不会引起对虾很高的死亡率，有时也不会出现明显症状，但它与对虾生长缓慢有关，特别如果和其他疫病混合感染时，更加重对虾疫情，增加致死率。目前，虾肝肠胞虫的传播越来越广泛，有信息表明在中国、印度尼西亚、马来西亚、越南、印度和泰国中都有检出，因此，EHP的疫情发展迫切需要引起足够的重视，做好疫病监测和控制。
国内外已有相关EHP检测方法的研究，包括SYBR Green实时荧光PCR方法、LAMP检测方法、普通PCR方法以及巢式PCR方法等。Amornrat Tangprasittipap等人建立了套式PCR检测虾肝肠胞虫，同时通过扩增SSU rDNA基因构建系统进化树确定其为肝肠胞虫属的一个新的种。Nicholas等利用Taqman探针real-time PCR方法检测美洲鳊鱼组织中微孢子虫的情况，最低能够检测到微孢子虫10个以下的基因组拷贝数。但现有的EHP检测技术检测主要是通过荧光PCR方法，该方法对仪器的依赖性太大，同时耗时长，不利于现场快速检测。
因此，若能开发建立一种简便的检测EHP的方法具有重要的意义。
发明内容
为解决现有技术中出现的问题，本发明提出了一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用，可以明显缩短南美白对虾肝肠胞虫的检测时间；同时检测环节操作更加简单，灵敏度高和特异性更好，满足快速检测及使用方便的试剂需求。
本发明的目的之一是提供一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对，所述引物对由引物EHP-F和EHP-R组成，
所述EHP-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；
所述EHP-R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子；
EHP-F：CTCTTAGACGTATCTGGGGATCAAGGACGAAGGC(SEQ ID NO.1)
EHP-R：AAACTAAGATTTCTCCCACACCAAGCATCG(SEQ ID NO.2)
本发明的目的之二是提供一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的扩增试剂，所述扩增试剂含有本发明的目的之一所述引物对。
优选的，所述扩增试剂还包括荧光探针EHP-P，所述荧光探针EHP-P如SEQ ID NO.3所示。
所述荧光探针EHP-P如下：
5’-TATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGHAGTAAACTATGCCGAC-3’(SEQ IDNO.3)
其中，32位碱基T标记荧光基团(FAM-dT)，35位碱基H表示四氢呋喃连接子(THF)，38位碱基T标记荧光淬灭基团BHQ1-dT，3'末端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(如C3-SPACER)，在RPA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高RPA检测的特异性。
优选的，所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
本发明的目的之三是提供一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的扩增试剂盒，所述扩增试剂盒含有本发明的目的之一所述的引物对或本发明的目的之二所述的扩增试剂。
优选的，所述试剂盒还含有酶混合液；所述酶混合液中包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
优选的，所述酶混合液中包括T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶。
优选的，所述EHP-F引物的浓度为0.3μmol/L，所述EHP-R引物的浓度为0.3μmol/L，所述EHP-P探针的浓度为0.2μmol/L。
本发明的目的之四是提供一种本发明的目的之一的引物对或本发明的目的之二的扩增试剂或本发明的目的之三的扩增试剂盒在南美白对虾肝肠胞虫检测中的应用。
本发明的目的之五是提供一种南美白对虾肝肠胞虫的RPA检测方法，采用本发明的目的之三的扩增试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1)提取待测南美白对虾的DNA；
2)以该DNA为模板，采用上述引物对和荧光探针进行RPA扩增，得到扩增产物；并用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对南美白对虾中肝肠胞虫进行定性检测。
优选的，所述RPA扩增的条件为37～42℃，反应时间5～50min。
优选的，所述RPA扩增的条件为40℃，反应时间30min。
发明原理
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，RPA利用T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶在37～42℃对目标片段进行等温扩增，可以在20～40min完成数十亿的DNA拷贝。RPA与荧光探针相结合，向反应体系中加入特异性的特定类型探针，可以达到实时荧光检测。进行检测时应用Twist Amp exo探针，此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭剂，分别与一个胸腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃(THF)碱基隔开，当此结构完整时，荧光强度低。探针的3'端予以封闭，阻断以此寡核苷酸序列充当引物进行扩增。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的THF碱基位点就会被核酸内切酶识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强；酶切后产生的游3’-OH作为DNA聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强，检测时间也大大缩短。
有益效果
现在主流的检测方法是荧光定量PCR方法。荧光定量PCR方法需要使用荧光定量PCR仪，设备价格昂贵；设备需要使用220V交流电源，需要在实验室环境下使用，不利于在野外实施检测；同时荧光定量PCR方法需要循环升降温，检测时间比较长，一般需要1-1.5小时。
本发明主要是建立一种简便的检测EHP的方法，在单一的温度下(恒温)就可以完成检测，设备结构简单，成本更低，更适合畜牧，水产类对成本敏感的客户使用。
本发明不需要使用复杂的设备，使用的仪器结构简单，能耗更低，适合在野外开展检测，如在养殖场现场即可以检测，有实际的使用需求。
本发明的检测时间更短，一般情况下5-50分钟左右能够完成一次检测。
附图说明
图1为本发明的灵敏度检测结果图；
图2为本发明对68例样本的检测结果图。
其中，扩增曲线从左至右，配置浓度依次是104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应、50拷贝/反应、10拷贝/反应、5拷贝/反应、1拷贝/反应的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对，所述引物对由引物EHP-F和EHP-R组成，
所述EHP-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；
所述EHP-R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子。
本发明的又一个具体实施方式中，提供一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的扩增试剂，所述扩增试剂含有上述引物对。
本发明的又一个具体实施方式中，所述扩增试剂还包括荧光探针EHP-P，所述荧光探针EHP-P如SEQ ID NO.3所示。
所述荧光探针EHP-P如下：
5’-TATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAGHAGTAAACTATGCCGAC-3’(SEQ IDNO.3)
其中，32位碱基T标记荧光基团(FAM-dT)，35位碱基H表示四氢呋喃连接子(THF)，38位碱基T标记荧光淬灭基团BHQ1-dT，3'末端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(如C3-SPACER)，在RPA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高RPA检测的特异性。
优选的，所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
实施例1
虾肝肠胞虫实时荧光RPA检测试剂盒及方法的建立：
原材料的来源：
引物、探针自行设计后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备；
RPA反应液和RPA冻干粉采购自英国TwistDx Inc公司；
RPA冻干粉中包括重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶。
1、引物、探针序列的设计及制备
根据MT539781.1、MN308365.1、MN453588.1、MN453587.1、MH260592.1、MH260591.1、MH260590.1,、MH260589.1、MH259891.1、MH259890.1、MH259889.1、MH259888.1、MH259887.1、MH259886.1、MF134829.1、MF134828.1、MF134827.1、MF134822.1、MF134817.1、MF134816.1、MF134814.1和MF134811.1的18s rRNA基因同源序列进行对比分析，确定扩增区的保守序列。根据RPA引物探针设计原则，针对该区域设计引物对和探针。引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和探针(SEQ ID NO.3)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计引物对和探针如表1所示：
表1引物对和探针
2、样本
本研究所用到的样本由本实验室保存，具体为使用消毒处理的器具将待检测南美白对虾取样到无菌封口袋，待用或带回待用。
3、基因组DNA提取
所有组织样本，先经过研磨、离心后取上清提取基因组DNA。采用所有组织样本，先经过研磨、离心后取上清提取基因组DNA。采用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen,德国)提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。
4、选择包含扩增区在内的350bp基因片段，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并插入至pUC57载体中，命名pEHP-18s-rRNA。克隆，提取纯化质粒，-20℃保存备用。
5、荧光RPA扩增检测方法建立
以上述质粒为模板，梯度稀释至合适浓度。实验体系如下：
在购买的Twist Dx试剂盒中进行检测，测试温度在37-42℃，分别测试了37℃，38℃,39℃,40℃,41℃,42℃不同反应温度，并且将检测时间设置为40分钟，结果显示在41℃是检测结果最好。
在确定41℃扩增温度后，我们测试了5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，50分钟的检测，结果表明，在30分钟是能是最合适的检测时间。
6、反应灵敏度检测
用微量紫外分光光度计测定质粒浓度，换算质粒的拷贝数浓度。将质粒梯度稀释，按照上述反应体系，检测104拷贝/反应、103拷贝/反应、102拷贝/反应、50拷贝/反应、10拷贝/反应、5拷贝/反应、1拷贝/反应7个浓度梯度。在41℃，30分钟条件下检测。检测结果如图所示，其中，104-5拷贝/反应为阳性结果，1拷贝/反应为阴性结果(1拷贝/反应的扩增曲线是几乎水平的扩增线)。因此，该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。
7、临床样本检测
为测试检测方法的准确性及临床应用有效性，用该方法和荧光PCR方法对一批临床样本进行检测。EHP荧光RPA检测临床样本的扩增结果见图2，和荧光PCR结果对比见下表2。
表2 EHP荧光RPA方法和荧光PCR方法检测临床样本的结果对比
从图2和表2中可以看出，本发明涉及的试剂盒可以快速检测虾肝肠胞虫，且该方法简单、快速，检测结果和荧光PCR法相当。
SEQUENCE LISTING
<110>湛江海关技术中心
<120>一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对、扩增试剂、扩增试剂盒、检测方法和应用
<160>3
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ctcttagacg tatctgggga tcaaggacga aggc 34
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aaactaagat ttctcccaca ccaagcatcg 30
<210>3
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tatcgaaagt gattagacac cgctgtagtt ctaghagtaa actatgccga c 51
Claims (10)
1.一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的引物对，其特征在于，所述引物对由引物EHP-F和EHP-R组成，
所述EHP-F为SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子；
所述EHP-R为SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子。
2.一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂含有权利要求1所述引物对。
3.根据权利要求2所述的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂还包括荧光探针EHP-P，所述荧光探针EHP-P如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
5.一种用于检测南美白对虾肝肠胞虫的扩增试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂盒含有权利要求1所述的引物对或权利要求2-4任一所述的扩增试剂。
6.根据权利要求5所述的扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有酶混合液；所述酶混合液中包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
7.根据权利要求5所述的扩增试剂盒，其特征在于，所述EHP-F引物的浓度为0.3μmol/L，所述EHP-R引物的浓度为0.3μmol/L，所述EHP-P探针的浓度为0.2μmol/L。
8.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4任一所述的扩增试剂或权利要求5-7任一所述扩增试剂盒在南美白对虾肝肠胞虫检测中的应用。
9.一种南美白对虾肝肠胞虫的RPA检测方法，其特征在于，采用权利要求5-7任一所述的扩增试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1)提取待测组织匀浆液的DNA；
2)以该DNA为模板，采用所述引物对和荧光探针进行RPA扩增，得到扩增产物；并用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对南美白对虾中肝肠胞虫进行定性检测。
10.如权利要求9所述RPA检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的条件为37～42℃，反应时间5～50min。
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