CN112760361A - 一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒，所述引物具有4个，与现有技术相比，本发明具有如下优点：提供了4条不同的特异性引物，故而对虾肝肠胞虫的检测结果准确度更高，结合LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。

Description

一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及快速检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒。
背景技术
虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)，隶属于真菌界、肠胞虫科(Enterocytozoonidae)、肠胞虫属(Enterocytozoon)，是一种专性细胞内寄生虫。该寄生虫可以感染斑节对虾(Penaeus monodon)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)等多种养殖虾类,导致其生长缓慢，甚至引起慢性死亡。尽管在早期的报道中，EHP的流行和感染强度均较低，但近几年EHP引起的对虾肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM)在亚洲对虾养殖业中的流行逐步扩大，给对虾养殖业造成严重的经济损失。可由虾农在“池塘边”直接操作的高效检测技术的发展，对于该病原的防控具有重要意义。
分子检测方法，特别是核酸扩增，通常具有较高的灵敏度和特异性。聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是许多对虾病原诊断的传统方法。多种基于PCR的方法(包括一步PCR、巢式PCR等)已被用于EHP检测。但一步PCR技术对检测设备和操作环境有较高要求、操作较为繁琐，反应仅需1对引物，易受干扰，特异性不足，检测限通常在103-104Copies/μL，这对于检测少量病原携带者的感染状态不足够灵敏；巢式PCR需两对引物，其特异性和检测限有所提高，但其所需检测时间也相应增加，给实际生产中快捷应用理念相悖；此外，目前已建立的用于EHP检测的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescentquantitative PCR)方法(包括TaqMan PCR和SYBR Green I PCR)，可实现病原检测定量，但其所需设备昂贵，操作复杂，数据读取繁琐，难以在虾农中进行推广；核酸恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，且不受样本中常规抑制物干扰，具有简单、快速、特异性强的特点，可不依赖任何特殊的仪器设备实现现场快速检测。然而,LAMP技术具有优势的同时，由于其是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增，且开放结果观察易造成气溶胶污染，假阳性较高，影响检测结果。
微流控芯片(Microfluidics chip)检测技术是一种基于微流体界面精确操作的技术，可把样品检测过程集成到一个数平方厘米的芯片上。可通过在微米及亚微米级的微管道网络中进行微量流体的操控、处理和反应，达到分子检测的目的。该技术克服了传统检测技术的缺陷，具有制作成本低、能耗物耗少、设备小型化、分析速度快、灵敏度高，操作简单自动化、一体化、集成化等特点。基因扩增和产物的检测可一步完成，灵敏度及反应时间均优于基于PCR的多种检测方法，可实现对病原核酸的高通量快速检测，实现虾农对水产疫病的现场日常监测和早期诊断。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能快速检测虾肝肠胞虫的引物。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种应用有上述引物的试剂盒。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该检测虾肝肠胞虫的引物，其特征在于：所述引物为：
F3：GATGCAAAGAGATATGTTGAAAG；
B3：TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT；
FIP：CGCATTTTTCTGTACCTGTTTTGTTGAATACATTCATACAAAGTTACCAG；
BIP：GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTTGAAATTGTATTTGACCAATGGT。
为解决第二个技术问题，本发明还提供一种检测虾肝肠胞虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒具体由下列试剂组成：
20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，8mM MgSO4，0.1％Tween-20，1.4mM dNTPs；Bst酶，800U/mL；50μM SYBRGREEN荧光染料；内参质粒400copies/μl；金纳米颗粒4.0x10-6mol/L；0.6U FEN1；对虾肠胞虫引物90μM，0.5μL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：提供了4条不同的特异性引物，故而对虾肝肠胞虫的检测结果准确度更高，结合LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。
附图说明
图1为本发明虾肝肠胞虫病原检测的工艺流程图；
图2为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒105copies/μL的扩增结果图；
图3为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒104copies/μL的扩增结果图；
图4为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒103copies/μL的扩增结果图；
图5为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒102copies/μL的扩增结果图；
图6为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒101copies/μL的扩增结果图；
图7为本发明本实施例3中带有虾肝肠胞虫基因片段进行检测限实验的质粒100copies/μL的扩增结果图；
图8为本发明本实施例3中阴性对照的扩增结果图；
图9为本发明本实施例3中阳性对照的扩增结果图；
图10为本发明本实施例4中阳性样品的扩增结果图；
图11为本发明本实施例4中阴性对照的扩增结果图。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1)利用引物设计软件设计虾肝肠胞虫18S基因片段引物，其中所涉及的引物参照NCBI中的基因序列，基因序列编号为：MH260592.1，具体见Seq No.1；
2)将筛选出的特异性引物，固定在虾肠胞虫检测用微流控芯片中相应位置，对芯片进行封装，所设计引物序列为本发明虾肠胞虫检测用引物。
实施例2
DNA提取具体步骤为：处理虾样本时，将采集到的病灶部位放入均质袋中，充分研匀，加入2mL生理盐水，充分振荡混匀，从中吸取100μL置于1.5mL离心管中，离心1min弃上清，保留沉淀，进行以下步骤：
(1)加入500ul裂解液R，之后震荡10秒，80℃孵育5min；
(2)离心1min，吸取上清至新的离心管，加入200uL无水乙醇，涡旋或颠倒混匀；
(3)将上述溶液全部转移到吸附柱中，离心30秒，弃滤液；
(4)将吸附柱重新放回收集管中，加入500uL洗液C，离心30秒，弃滤液；
(5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500uL洗液D；
(6)离心30秒，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中离心30秒；
(7)将吸附柱放入新的离心管中，向吸附柱柱膜中央上方加入100uL洗脱液；
(8)离心1min，洗脱液即为待检核酸；
(9)从100uL中吸取15uL核酸+10uL荧光等温扩增预混液到新的离心管中，震荡10秒，离心30秒，吸取管内全部液体(25uL)加入芯片检测。
实施例3
检测虾肝肠胞虫18S基因的引物的敏感性及检测限：
3.1实验材料
3.1.1试剂：反应液；用无菌水分别稀释为1×105copies/uL、1×104copies/uL、1×103copies/uL、1×102copies/uL、1×101copies/uL、1×100copies/uL的带有虾肝肠胞虫18S基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照；
3.1.2仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器；
3.1.3检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2、3、4、5、6、7、8、9，从上面图2～9检测限的结果看，图2～图5以及图9的阳性对照的结果都出现了典型的S型扩增曲线，图7～图8的结果在基线位置，而图6结果重复性较差，说明该检测体系的最低检测限是1×102copies/uL的质粒，此时的Ct小于20，说明灵敏度较高，检测速度快。
实施例4
4.虾肝肠胞虫18S基因引物的重复性验证：
4.1.1试剂：反应液；用无菌水分别稀释为1×104copies/uL带有虾肝肠胞虫18S基因片段的质粒；阴性对照。
4.1.2仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器；
4.1.3检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图10所示，亦呈现了典型的S型扩增曲线，图11阴性结果在基线位置，每组的CV值均小于5％，说明重复性符合要求。
具体Ct值和CV值见下表。
表1微流控虾肝肠胞虫18S基因检测的重复性验证
Figure BDA0002933089970000041
Figure BDA0002933089970000051
实施例5
常规PCR方法比较
5.1样品采集
采集不同对虾养殖场对虾样品，取肝胰腺充分匀浆；
5.2样品检测
(1)取对虾肝胰腺称重，充分匀浆，按照上述实施例2中步骤进行核酸提取；
(2)用无菌水分别稀释为1×105copies/uL、1×104copies/uL、1×103copies/uL、1×102copies/uL、1×101copies/uL、1×100copies/uL的带有虾肝肠胞虫18S基因片段的质粒；
(3)取上述样品核酸提取液，采用微流控检测仪进行核酸测定；
(4)取上述质粒和核酸样品液，利用引物
EHP-F：GATGCTTGGTGTGGGAGAA；
EHP-R：CCCCCCATCAATTTCCAACG；
进行PCR验证反应；
(5)阳性对照为确定含有该病原的虾组织匀浆液提取的核酸，阴性对照是无菌水样品；
5.3.结果分析
由表2可见，常规PCR对虾肝肠胞虫基因的最低检测检出限为1×103copies/uL，表明微流控芯片具有更高的灵敏度。
表2微流控检测试剂盒方法与常规PCR方法比较
Figure BDA0002933089970000052
注：“+”代表检出结果阳性，“-”代表阴性
反应时间分析
从DNA提取完成后计算时间，PCR反应过程2小时，电泳40分种，总耗时2小时40分钟，试剂盒方法总耗时小于30min；结合检测结果分析，显示本发明的对虾肠胞虫检测系统，在保持高灵敏度的同时大幅缩短了整体反应时间。
序列表
<110> 宁波大学 宁波爱基因科技有限公司
<120> 一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 956
<212> DNA
<213> Enterocytozoon
<400> 1
gatttgctct atgcgggaag aataaccacg gtaacctgtg gctaagagtg tagaataagg 60
tgcaatccta ttagtttgtt ggtagtgtaa aggactacca aggcagtgat gggtaacggg 120
aaatcagggt ttgattccgg agagggagcc tgagagatgg ctcccacgtc caaggatggc 180
agcaggcgcg aaaattgtcc actcttttga gaggagacag ttatgaaacg tgagtagaag 240
ggtcgagtgt aaaaaccttg acgtgaagca attggagggc aagttttggt gccagcagcc 300
gcggtaattc caactccaag agtgtctatg gtggatgctg cagttaaagg gtccgtagtc 360
gtagatgcaa ttaaaaggtg gtgttaaaag ccattgagtt tgttgagagt agcggaacgg 420
atagggagca tggtataggt gggcaaagaa tgaaatctca agaccccacc tggaccaacg 480
gaggcgaaag cgatgctctt agacgtatct ggggatcaag gacgaaggct agagtatcga 540
aagtgattag acaccgctgt agttctagca gtaaactatg ccgacaatgc tgggtgttgc 600
gagagcgatg cttggtgtgg gagaaatctt agttttcggg ctctggggat agtacgctcg 660
caagggtgaa acttaaagcg aaattgacgg aaggacacta ccaggagtgg attgtgctgc 720
ttaatttaac tcaacgcggg aaaacttacc agggtcaagt ctatcgtaga ttggagacat 780
gaggtagaca agagtggtgc atggccgttg gaaattgatg gggcgacttt tagcttaagt 840
gctggaacca gtgagatctt ctagacaggt gttatttagg cacaggaggg agaaggcaat 900
aacaggtccg tgatgccctt agatatcctg ggcagcaagc gcaatacaat atctct 956

Claims (2)

1.一种检测虾肝肠胞虫的引物，其特征在于：所述引物为：
F3：GATGCAAAGAGATATGTTGAAAG；
B3：TGCTTTAAGGTTTACAGTGTT；
FIP：CGCATTTTTCTGTACCTGTTTTGTTGAATACATTCATACAAAGTTACCAG；
BIP：GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTTGAAATTGTATTTGACCAATGGT。
2.一种包含有如权利要求1所述引物的检测虾肝肠胞虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒具体由下列试剂组成：
20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，8mM MgSO4，0.1％Tween-20，1.4mMdNTPs；Bst酶，800U/mL；50μM SYBRGREEN荧光染料；内参质粒400copies/μl；金纳米颗粒4.0x10-6mol/L；0.6U FEN1；对虾肠胞虫引物90μM，0.5μL。
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