CN112501278A - Smim26作为结核病诊断分子标识的用途 - Google Patents

Smim26作为结核病诊断分子标识的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112501278A
CN112501278A CN202011393850.4A CN202011393850A CN112501278A CN 112501278 A CN112501278 A CN 112501278A CN 202011393850 A CN202011393850 A CN 202011393850A CN 112501278 A CN112501278 A CN 112501278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tuberculosis
smim26
kit
000rpm
centrifuging
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011393850.4A
Other languages
English (en)
Inventor
金奇
张笑冰
刘立国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pathogen Biology of CAMS
Original Assignee
Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pathogen Biology of CAMS filed Critical Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority to CN202011393850.4A priority Critical patent/CN112501278A/zh
Publication of CN112501278A publication Critical patent/CN112501278A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物SMIM26在诊断结核病中的应用。本发明的目的在于提供分子标记物SMIM26在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。

Description

SMIM26作为结核病诊断分子标识的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物SMIM26在诊断结核病中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前活动性结核病的诊断主要依据病原学检测和患者影像学诊断。病原学检测被认为是结核诊断的“金标准”，包括患者痰涂片、痰培养以及分子生物学检测方法，主要针对宿主标本中存在的结核分枝杆菌活菌及其基因组份进行检测；然而，现有数据显示菌阳结核比例只占临床结核病例的30 －40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。另一方面，影像学诊断虽然快捷、灵敏，但存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷。而针对宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST) 和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。
目前临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、MGIT960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如GeneXpert等检测，是针对样本结核菌DNA分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前临床菌阳结核比例只占结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果作出诊断。(二)影像学检查：胸部X线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般X线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。
SMIM26(small integral membrane protein 26)，SMIM26位于第20号染色体，编码蛋白由95个氨基酸组成，同型异构体为94个氨基酸组成，又名LINC00493。 SMIM26基因是已知基因，序列信息见参考文献[1]。有文献报道，该基因表达和癌症相关。尚未有结核病相关的研究报道。我们的研究数据显示，与非结核感染对照组(HC，Health Control)相比，活动性结核(ATB，active tuberculosis)样本中的SMIM26基因表达量明显上升。于此同时，活动性结核样本中的SMIM26 表达量也明显高于结核潜伏感染组(LTBI,LatentTuberculosis Infection)和细菌性肺炎(PN，pnumonia)组。因此该基因可作为TB的分子诊断标识，以及TB和 LTBI，TB和其他肺部感染的鉴别诊断标识。
发明内容
本发明的目的在于提供分子标记物SMIM26在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。
本发明所述的分子标记物SMIM26(small integral membrane protein 26)，SMIM26位于第20号染色体，编码蛋白由95个氨基酸组成，同型异构体为94 个氨基酸组成，又名LINC00493。SMIM26基因是已知基因，序列信息见参考文献[1]。
本发明更加详细的描述如下：
本发明所述的检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
本发明所述的检测SMIM26蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
本发明所述的检测分子标记物SMIM26表达水平方法为荧光定量PCR法。
本发明所述的检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
本发明所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
本发明所述结核病为肺结核或肺外结核。
本发明所述SMIM26在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
本发明所述SMIM26在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以SMIM26作为诊断分子标记物。
具体的，本发明的试剂盒，包括以下成分：
特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)；细胞总RNA 提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)；cDNA反转录酶， SuperScriptTMIVVILOTMMaster Mix(Invitrogen，US)；qPCR荧光定量PCR检测体系，包括TaqManTM FsatAdvanced Master Mix(Thermo Fishen Scientific,US)，
Figure BDA0002813828880000031
Assay SMIM26外显子区域特异性检测引物及探针。
本发明的另一个目的在于提供检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的 4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育 20min，
2)磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，
3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中， 12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中， 12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL 水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，
4)cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix进行反转录，得到细胞样本cDNA，
5)实时荧光定量PCR检测SMIM26基因的相对表达量采用上步骤中制备的cDNA为模板，对SMIM26特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中SMIM26基因的相对表达量。
其中，步骤5)实时荧光定量PCR检测SMIM26基因的相对表达量，具体步骤如下：
采用步骤4)中制备的cDNA为模板，对SMIM26特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中SMIM26基因的相对表达量。具体步骤如下：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1(目的基因)为20μL，由qPCR反应多聚酶
Figure BDA0002813828880000041
Fast AdvancedMaster Mix，目的基因
Figure BDA0002813828880000042
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μL，由
Figure BDA0002813828880000043
Fast Advanced Master Mix，
Figure BDA0002813828880000051
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM6and 7Flex实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems，US)上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔΔCt法计算各个模板中SMIM26基因的相对表达量。
反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。
(3)统计分析使用GraphPad Prism 6对步骤(2)的结果进行统计分析。
现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。SMIM26基因可区分活动性结核病患者与其他肺部感染，可以作为活动性结核病和肺部感染诊断的候选生物标志物；同时可以区分潜伏感染和活动性结核病患者和肺炎，可以作为区分潜伏感染和活动性结核病患者和肺炎分子诊断标识。本发明为结核诊断的宿主分子标识，不限于病原学检测阳性人群，同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断，可有效提高临床结核病检出率。
对于说明书中出现的术语，在此进行相应的解释和说明：
TB：Tuberculosis，结核病
M.tb：Mycobacterium tuberculosis。结核分枝杆菌
TST：tuberculin skin test，结核菌素试验
IGRA：interferon gamma release assays，γ干扰素释放试验
ATB：Active Tuberculosis,活动性结核
LTBI：Latent Tuberculosis Infection，结核潜伏感染者
HC：Health Control，非结核感染对照组
PN：pneumonia，肺部感染
CD15：白细胞分化抗原15
Hula Mixer：Hula混匀器
Buffer RLT：RLT缓冲液
RNeasy Plus Mini Kit：RNA提取试剂盒
gDNA：基因组DNA
RNeasy Mini：RNA提取试剂盒
Buffer RW1：RW1缓冲液
Buffer RPE：RPE缓冲液
SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix:SuperScriptTMIV VILOTM混合液
cDNA：反转DNA
Figure BDA0002813828880000061
Fast Advanced Master Mix：
Figure BDA0002813828880000062
快速混合液
附图说明
图1实时定量PCR结果。
ATB：活动性肺结核患者；LTBI：潜伏感染者；HC：非活动性肺结核非潜伏感染者；PN：肺炎患者
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、
1.研究对象和方法
1.1.研究对象
研究对象及纳入标准
本研究对象包括ATB、LTB、PN及HC。ATB组由医院确诊住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(WS 288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及X射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；LTBI组为有临床接触史，无临床症状，且IGRA阳性；PN组，为排除ATB，临床确诊的肺部感染(排除病毒性肺炎)；HC组，为体检相关指标正常，IGRA阴性。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。
样本信息
本研究共收取265例宿主样本，分为4组，包括ATB，51例；LTBI，54例； PN，58例及HC，102例。年龄、性别等详细信息见表1。
表1.样本人口统计学资料
Figure BDA0002813828880000071
标本来源
分别抽取上述研究对象的外周血2.5mL，置于含肝素锂抗凝采血管(BDBiosciences，US)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。
1.2研究方法
磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。
本发明所述的试剂盒，包括以下组分：CD15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总RNA提取分离柱及相关试剂，cDNA合成逆转录酶及相关试剂，SMIM26 序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR相关试剂。
1.2.1.1全血样本处理
按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已 1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer(Invitrogen，US)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。
1.2.1.2磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。
⑷加入350μL的Buffer RLT(Qiagen,Germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。
1.2.2总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)对磁珠分选的中性粒细胞总 RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中， 12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀。转移700μL至RNeasy Mini柱中， 12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL 水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用。
1.2.3 cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen，US) 进行反转录，得到细胞样本cDNA。
1.2.4实时荧光定量PCR检测SMIM26基因的相对表达量
采用步骤1.2.3中制备的cDNA为模板，对SMIM26特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中SMIM26基因的相对表达量。具体步骤如下：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1(目的基因)为20μL，由qPCR反应多聚酶
Figure BDA0002813828880000081
Fast AdvancedMaster Mix，目的基因
Figure BDA0002813828880000082
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μL，由
Figure BDA0002813828880000083
Fast Advanced Master Mix，
Figure BDA0002813828880000084
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM6and 7Flex实时荧光定量 PCR仪(Applied Biosystems，US)上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔΔCt法计算各个模板中SMIM26基因的相对表达量。
反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。
(3)统计分析使用GraphPad Prism 6对步骤(2)的结果进行统计分析。
2.研究结果
将定量PCR结果处理后，使用GraphPad Prism 6对数据进行t-tests分析，结果见图1.由图可见，ATB组、PN组与HC组相比较，活动性结核病组的SMIM26 相对表达水平升高，差异显著(****P<0.0001)，与PN组相比，差异极显著 (****P<0.0001)。ATB组、PN组和LTBI相比较，活动性结核病组差异极显著量显著增加(****P<0.0001)，与PN组相比，差异显著(*****P<0.0001)。可以用于诊断结核病患者；区别诊断潜伏感染和结核病患者，以及细菌性肺炎和活动性ATB，因此，SMIM26可以作为结核病的分子诊断标识和鉴别诊断标识。
实施例2、试剂盒
本发明的试剂盒由以下成分组成：
特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)；细胞总RNA提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)；cDNA反转录酶，SuperScriptTM IVVILOTMMaster Mix(Invitrogen，US)；qPCR荧光定量PCR检测体系，包括 TaqManTM FsatAdvanced Master Mix(Thermo Fishen Scientific,US)，
Figure BDA0002813828880000091
Assay SMIM26外显子区域特异性检测引物及探针。
参考文献：
[1]Cogill SB,Wang L.Co-expression Network Analysis of Human lncRNAsand Cancer Genes.Cancer Inform.2014Oct 19；13(Suppl 5):49-59.doi: 10.4137/CIN.S14070.PMID:25392693；PMCID:PMC4218681.
[2]Fagerberg L,
Figure BDA0002813828880000102
BM,Oksvold P,et al.Analysis of the humantissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics andantibody-based proteomics.Mol Cell Proteomics.2014Feb；13(2):397-406.doi:10.1074/mcp.M113.035600.Epub 2013Dec 5.PMID:24309898；PMCID: PMC3916642.
[3]Agustín González-Reymúndez and Ana I.Vázquez.Multi-omic signaturesidentify pan-cancer classes of tumors beyond tissue of origin.Sci Rep.2020；10:8341.
[4]Sarah E.Moorey,Bailey N.Walker,Michelle F.Elmore,Joshua B.Elmore,Soren P.Rodning,and Fernando H.Biase.Rewiring of gene expression incirculating white blood cells is associated with pregnancy outcome in heifers(Bos taurus).Sci Rep. 2020；10:16786.
[5]Shan Zhang,Boris
Figure BDA0002813828880000101
Chao Liang,et al.Mitochondrial peptideBRAWNIN is essential for vertebrate respiratory complex III assembly.NatCommun.2020；11: 1312。

Claims (10)

1.检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
2.检测SMIM26蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物SMIM26表达水平方法为荧光定量PCR法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物SMIM26表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)；细胞总RNA提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)；cDNA反转录酶，SuperScriptTMIVVILOTMMaster Mix(Invitrogen，US)；qPCR荧光定量PCR检测体系，包括TaqManTM FsatAdvanced Master Mix(Thermo Fishen Scientific,US)，Taq
Figure FDA0002813828870000011
Assay SMIM26外显子区域特异性检测引物及探针。
8.SMIM26在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
9.SMIM26在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以SMIM26作为诊断分子标记物。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
2)磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，
3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中，12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，
4)cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix进行反转录，得到细胞样本cDNA，
5)实时荧光定量PCR检测SMIM26基因的相对表达量
采用上步骤中制备的cDNA为模板，对SMIM26特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中SMIM26基因的相对表达量。
CN202011393850.4A 2020-12-03 2020-12-03 Smim26作为结核病诊断分子标识的用途 Pending CN112501278A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011393850.4A CN112501278A (zh) 2020-12-03 2020-12-03 Smim26作为结核病诊断分子标识的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011393850.4A CN112501278A (zh) 2020-12-03 2020-12-03 Smim26作为结核病诊断分子标识的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112501278A true CN112501278A (zh) 2021-03-16

Family

ID=74969403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011393850.4A Pending CN112501278A (zh) 2020-12-03 2020-12-03 Smim26作为结核病诊断分子标识的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112501278A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115998846A (zh) * 2022-12-30 2023-04-25 暨南大学 Smim26蛋白以及slc25a11蛋白在肾癌中的应用
CN116068193A (zh) * 2022-08-26 2023-05-05 中国医学科学院病原生物学研究所 结核病分子标志物组合及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130013334A1 (en) * 2005-06-08 2013-01-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification, assessment, and treatment of patients with cancer therapy
CN104459129A (zh) * 2015-01-05 2015-03-25 复旦大学附属华山医院 一种鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒
CN110244048A (zh) * 2019-06-19 2019-09-17 中国人民解放军总医院第八医学中心 Serping1蛋白作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用
US20200018746A1 (en) * 2018-03-14 2020-01-16 The Broad Institute, Inc. Three-Dimensional Human Neural Tissues for CRISPR-Mediated Perturbation of Disease Genes
US20200209236A1 (en) * 2016-11-11 2020-07-02 Healthtell Inc. Methods for identifying candidate biomarkers

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130013334A1 (en) * 2005-06-08 2013-01-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification, assessment, and treatment of patients with cancer therapy
CN104459129A (zh) * 2015-01-05 2015-03-25 复旦大学附属华山医院 一种鉴别活动性与潜伏性结核分枝杆菌感染的诊断试剂盒
US20200209236A1 (en) * 2016-11-11 2020-07-02 Healthtell Inc. Methods for identifying candidate biomarkers
US20200018746A1 (en) * 2018-03-14 2020-01-16 The Broad Institute, Inc. Three-Dimensional Human Neural Tissues for CRISPR-Mediated Perturbation of Disease Genes
CN110244048A (zh) * 2019-06-19 2019-09-17 中国人民解放军总医院第八医学中心 Serping1蛋白作为标志物在开发诊断活动性结核病的试剂中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BING LIU等: ""LncRNAs are altered in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma"", 《ONCOTARGET》 *
DARIA KONINA等: ""Investigation of LINC00493/SMIM26 Gene Suggests Its Dual Functioning at mRNA and Protein Level"", 《INT. J. MOL. SCI》 *
SARAH E. MOOREY等: ""Rewiring of gene expression in circulating white blood cells is associated with pregnancy outcome in heifers (Bos taurus)"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
胡丽华等: ""长链非编码RNA与眼的发育和疾病"", 《国际眼科杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116068193A (zh) * 2022-08-26 2023-05-05 中国医学科学院病原生物学研究所 结核病分子标志物组合及其用途
CN116068193B (zh) * 2022-08-26 2024-07-26 中国医学科学院病原生物学研究所 结核病分子标志物组合及其用途
CN115998846A (zh) * 2022-12-30 2023-04-25 暨南大学 Smim26蛋白以及slc25a11蛋白在肾癌中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11236390B2 (en) Means for diagnosing, predicting or monitoring Pneumocystis pneumonia
CN108796074B (zh) 检测环状RNA circRNF13的试剂在制备肿瘤辅助诊断制剂上的应用及试剂盒
CN112501278A (zh) Smim26作为结核病诊断分子标识的用途
WO2019075868A1 (zh) 一种检测布鲁菌感染的方法及其应用
WO2022247523A1 (zh) 一种用于结直肠癌早期诊断的生物标志物组合物及应用
CN109991417B (zh) 一种结核病的免疫标志物及应用
CN110541030B (zh) 膀胱癌检测试剂盒及其应用
CN112143796A (zh) Card16做为分子标识用于结核的诊断与鉴别
Zou et al. Value analysis of next-generation sequencing combined with Xpert in early precise diagnosis of pulmonary tuberculosis
CN107267659B (zh) 检测trim基因和/或蛋白水平的产品的用途
CN111690746A (zh) 与肺癌相关的血小板rna标志物及其应用
CN109061191B (zh) S100p蛋白作为标志物在诊断活动性结核病中的应用
CN112143795A (zh) Clec2b基因做为结核病鉴别诊断的应用
CN115261476A (zh) 筛选血清外泌体LncRNA HULC作为肝癌早期标记物的方法及其制备试剂盒的用途
CN112899340B (zh) 一种辅助诊断结核性脑膜炎的试剂
CN111500733B (zh) 外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物
CN112143794A (zh) Ndufb1作为结核病诊断分子标识的用途
CN112481369A (zh) Msrb1作为结核病诊断分子标识的用途
CN112143798A (zh) Nt5c3a作为结核病诊断分子标识的用途
CN112143792A (zh) Rnf181作为结核病诊断分子标识的用途
CN112143793A (zh) Odf3b作为结核病诊断分子标识的用途
CN112143799A (zh) C5orf56应用于活动性结核病的鉴别与诊断
CN112143797A (zh) Hist1h2bc应用于活动性结核鉴别诊断
CN109187987B (zh) Ms4a3蛋白作为标志物在诊断活动性结核病中的应用
CN109609614B (zh) 检测trim2、trim4、trim32和/或trim46基因或蛋白产品的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210316

RJ01 Rejection of invention patent application after publication