CN112143798A - Nt5c3a作为结核病诊断分子标识的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物NT5C3A在诊断结核病中的应用。本发明提供检测分子标记物NT5C3A表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

Description

NT5C3A作为结核病诊断分子标识的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物NT5C3A在诊断结核病中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前活动性结核病的诊断主要依据病原学检测和患者影像学诊断。病原学检测被认为是结核诊断的“金标准”，包括患者痰涂片、痰培养以及分子生物学检测方法，主要针对宿主标本中存在的结核分枝杆菌活菌及其基因组份进行检测；然而，现有数据显示菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。另一方面，影像学诊断虽然快捷、灵敏，但存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷。而针对宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。
目前结核病毒诊断方法有：(一)病原学检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。(二)Ⅹ射线检查：胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5.聚合酶链反应(PCR)，优点是敏感性可达98％-100％，缺点是特异性较差。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题，因此迫切需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法，以快速、准确地诊断结核病。
NT5C3A(Cytosolic 5'-nucleotidase 3A)基因位于人类第7号染色体编码胞质5’核苷酸酶，参与胞苷单磷酸(CMP)和7－甲基鸟苷单磷酸(m7GMP)代谢过程，定位细胞内质网。NT5C3A蛋白受干扰素和细胞因子信号通路的负调节。其表达需要内在IFN刺激应答反应和IFN转录因子IRF1，并通过阻断NF－κB途径抑制细胞因子生成。根据不同的剪切方式，NT5C3A基因可表达多个蛋白亚型，如亚型1，2，3,4,5,6，氨基酸长度为264-331氨基酸。亚型1，3，4在质网红细胞中表达，亚型2在骨髓和胎肝细胞中表达。该基因为已知基因，相关序列信息见参考文献(Aksoy,P.et al.Cytosolic 5'-nucleotidase III(NT5C3A):genesequence variation and functional genomics.2009.Pharmacogenet Genomics19,567-576.)目前有该基因突变与溶血性贫血有关，以及NT5C3蛋白与肿瘤组织分析相关应用的报道。未见与结核病相关的报道。
我们的研究结果显示，相比结核潜伏感染者(LTBI,Latent TuberculosisInfection)与非结核感染对照组(HC，Health Control)，在活动性结核(ActiveTuberculosis,ATB)患者体内，其基因表达量呈上升状态。因此，该基因可作为活动性结核诊断，鉴别活动性结核与潜伏感染的分子标识。
发明内容
本发明的目的在于提供分子标记物NT5C3A在诊断结核病中的应用。同时，提供一种适合该标记物在宿主体内表达量变化的敏感的检测方法。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。
本发明所述的分子标记物NT5C3A，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。
本发明更加详细的描述如下：
检测分子标记物NT5C3A表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
检测NT5C3A蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
检测分子标记物NT5C3A表达水平方法为荧光定量PCR法。
检测分子标记物NT5C3A表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。
其中，该试剂盒还包括如下组分：
CD15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总RNA提取分离柱及相关试剂，cDNA合成逆转录酶及相关试剂，NT5C3A序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR相关试剂。
具体的，本发明的试剂盒，包括以下成分：
CD15+细胞特异抗体筛选磁珠(Invitrogen.)；
RNeasy Plus Mini Kit(Qiangen.)
SuperScriptTM IV Reverse Transcriptase(Invitrogen.)
TaqMan DNA polymerase
TaqMan探针及基因扩增特异引物
本发明还提供NT5C3A在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
本发明还提供NT5C3A在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以NT5C3A作为诊断分子标记物。
凡是能够检测体内NT5C3A基因含量变化的检测方法都包含在本发明之内，如本发明提供的以下方法：
(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；
(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；
(3)总RNA提取：对中性粒细胞的总RNA进行提取；
(4)cDNA的合成：对RNA进行反转录，得到样本cDNA；
(5)实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，使用NT5C3A特异引物，内参引物进行实时荧光定量PCR检测，经过计算即可得到样本中NT5C3A基因的相对表达量。
结论：
以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。优选的，本发明的检测方法，步骤如下：
(1)全血样本处理
吸取人0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，(2)磁性分离
a、孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
b、1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清；
c、从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次；
d、350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用；
(3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，
(4)cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix进行反转录，得到样本cDNA，
(5)实时荧光定量PCR检测NT5C3A基因的相对表达量
采用步骤(4)中制备的cDNA为模板，对NT5C3A特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中NT5C3A基因的相对表达量。
最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
(2)磁性分离
a、孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；b、1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清；
c、力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次；
d、350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用；
(3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，操作如下：
a、配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中，12,000rpm离心30s；
b、向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀，转移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
c、加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
d、加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，
e、加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，
f、将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用，
(4)cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix进行反转录，得到样本cDNA，
(5)实时荧光定量PCR检测NT5C3A基因的相对表达量
采用步骤(4)中制备的cDNA为模板，对NT5C3A特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中NT5C3A基因的相对表达量，具体步骤如下：
a、配制反应体系1和反应体系2
反应体系1为20μL，由qPCR反应多聚酶
Figure BDA0002711666160000061
Fast Advanced Master Mix，目的基因
Figure BDA0002711666160000062
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成，
反应体系2为20μL，由
Figure BDA0002711666160000063
Fast Advanced Master Mix，
Figure BDA0002711666160000064
Assayprimer,及样本cDNA和无核酸酶水组成，
其中，NT5C3A特异引物为商业化探针(Hs05574347_g1,Thermo Fisher).
其中，NT5C3A内参引物为商业化探针(Hs01027595_m1,Thermo Fisher)
b、实时定量PCR检测
将步骤a配制的各个反应体系在QuantStudioTM 6 and 7Flex实时荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测，使用2-ΔΔCt法计算各个模板中NT5C3A基因的相对表达量，反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集，
C、统计分析使用GraphPad Prism 6对步骤b的结果进行统计分析。
本发明根据上述方法，制备了一种检测试剂盒，所述试剂盒中，包括必要组分，如：引物。
除必要组分外，也可以包括或不包括任何一种上述检测过程中使用的组分，如其中的任何一种试剂。
本发明相对于现有技术而言，具有哪些有益效果：
现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。NT5C3A基因可区分活动性结核病患者与结核潜伏感染，活动性结核与非结核感染者，以及活动性结核与其他肺部感染，可以作为活动性结核病诊断的生物标志物。本发明为结核诊断的宿主分子标识，不限于病原学检测阳性人群，同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断，可有效提高临床结核病检出率。
对于说明书中出现的术语，在此进行相应的解释和说明：
TB：Tuberculosis，结核病
M.tb：Mycobacterium tuberculosis。结核分枝杆菌
TST：tuberculin skin test，结核菌素试验
IGRA：interferon gamma release assays，γ干扰素释放试验
ATB：Active Tuberculosis,活动性结核
LTBI：Latent Tuberculosis Infection，结核潜伏感染者
HC：Health Control，非结核感染对照组
PN：pneumonia，肺部感染
CD15：白细胞分化抗原15
Hula Mixer：Hula混匀器
Buffer RLT：RLT缓冲液
RNeasy Plus Mini Kit：RNA提取试剂盒
gDNA：基因组DNA
Buffer RW1：RW1缓冲液
Buffer RPE：RPE缓冲液
SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix:SuperScriptTMIV VILOTM混合液
cDNA：反转DNA
Figure BDA0002711666160000081
Fast Advanced Master Mix：
Figure BDA0002711666160000082
快速混合液
附图说明
图1、实时定量PCR结果图，
图中：ATB：活动性肺结核患者；LTBI：潜伏感染者；HC：非结核感染正常对照者。Relative Expression:相对表达量。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、
1.研究对象及纳入标准
本研究对象包括ATB、LTB及HC。ATB组由医院确诊住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(WS 288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及X射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；LTBI组为有临床接触史，无临床症状，且IGRA阳性；PN组，为排除ATB，临床确诊的肺部感染(排除病毒性肺炎)；HC组，为体检相关指标正常，IGRA阴性。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。
2.样本信息
本研究共收取207例宿主样本，分为三组，包括活动性结核组(ATB,ActiveTuberculosis,51例)、结核感染组(LTBI,Latent Tuberculosis Infection,54例)及正常对照组(HC，Health Control,102例)。年龄、性别等详细信息见表1
表1.样本人口统计学资料
Figure BDA0002711666160000091
标本来源
分别抽取上述研究对象的外周血2.5mL，置于含肝素锂抗凝采血管(BDBiosciences，US)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。
3研究方法
磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。
3.1全血样本处理
按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer(Invitrogen，US)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。
3.2磁性分离
⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
⑵加入1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。
⑶从磁力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。
⑷加入350μL的Buffer RLT(Qiagen,Germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。
3.3总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取，具体操作如下：
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中，12,000rpm离心30s；
⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混匀。转移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。
⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得RNA冰上放置备用。
3.4 cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(Invitrogen，US)进行反转录，得到样本cDNA。
3.5实时荧光定量PCR检测NT5C3A基因的相对表达量
采用步骤1.1.4中制备的cDNA为模板，对NT5C3A特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中NT5C3A基因的相对表达量。具体步骤如下：
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1(目的基因)为20μL，由qPCR反应多聚酶
Figure BDA0002711666160000101
Fast AdvancedMaster Mix，目的基因
Figure BDA0002711666160000102
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。
反应体系2(内参基因)为20μL，由
Figure BDA0002711666160000111
Fast Advanced Master Mix，
Figure BDA0002711666160000112
Assay primer,及样本cDNA和无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM 6 and 7Flex实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，US)上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔΔCt法计算各个模板中NT5C3A基因的相对表达量。
反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。
(3)统计分析使用GraphPad Prism 6对步骤(2)的结果进行统计分析。
4.研究结果
将定量PCR结果处理后，使用GraphPad Prism 6对数据进行分析，结果见图1.由图可见，与LTBI和HC组相比，活动性结核病组的NT5C3A基因的相对表达水平升高，TB组、LTBI组及HC组中基因的相对表达量的中位数分别为1.53,0.8845和0.917，组间差异倍值大于1.5倍；均值分别为2.342,0.9684，和1.02，组间差异倍值大于2倍，差异显著(P<0.0001)。
实施例2、试剂盒
本发明的试剂盒由以下成分组成：
1.特定细胞富集抗体标记磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)
2.细胞总RNA提取试剂盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)
3.cDNA反转录酶，SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(Invitrogen，US)
4.qPCR荧光定量PCR检测体系，包括
Figure BDA0002711666160000113
PCR多聚酶，缓冲体系，以及
Figure BDA0002711666160000114
AssayNT5C3A外显子区域特异性检测引物及探针。
本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞NT5C3A基因表达量变化的检测，相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化，使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。
参考文献：
1 Aksoy,P.et al.Cytosolic 5'-nucleotidase III(NT5C3):gene sequencevariation and functional genomics.Pharmacogenet Genomics 19,567-576,doi:10.1097/FPC.0b013e32832c14b8(2009).

Claims (10)

1.检测分子标记物NT5C3A表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
2.检测NT5C3A蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物NT5C3A表达水平方法为荧光定量PCR法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测分子标记物NT5C3A表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结核病为肺结核或肺外结核。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该试剂盒还包括如下组分：
CD15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总RNA提取分离柱及相关试剂，cDNA合成逆转录酶及相关试剂，NT5C3A序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR相关试剂。
8.NT5C3A在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
9.NT5C3A在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以NT5C3A作为诊断分子标记物。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)全血样本处理
吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入CD15+磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，
(2)磁性分离
a、孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；
b、1.6mL分离液，轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清；
c、力架上取下，加入1.6mL分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次；
d、350μL的Buffer RLT裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用；
(3)总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取；
(4)cDNA的合成
取细胞总RNA，采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix进行反转录，得到样本cDNA，
(5)实时荧光定量PCR检测NT5C3A基因的相对表达量
采用步骤(4)中制备的cDNA为模板，对NT5C3A特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR，进而得到各个样本模板中NT5C3A基因的相对表达量。
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屈艳琳等: "实时荧光定量PCR对结核病潜伏感染快速诊断的研究", 《中国病原生物学杂志》 *

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