CN112143800A - 分子标记物apol3在诊断结核病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,涉及一种分子标记物APOL3在诊断结核病中的应用。本发明的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识,并且其具有良好的敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种分子标记物APOL3在诊断结核病中的应用。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb) 感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病,全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌,并长期处于潜伏感染状态,其中5%~10%可能会在一生中发生活动性结核病。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点,结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低,一直未有突破进展。目前活动性结核病的诊断主要依据病原学检测和患者影像学诊断。针对结核分枝杆菌组分的病原学检测被认为是结核诊断的“金标准”,针对病原学的早期的快速诊断的灵敏度和检出率较低。患者的影像学诊断存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷。而针对宿主的免疫检测方法,如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)和γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays,IGRA)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核,且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此,迫切需要新的诊断方法,实现结核病患者的早期和快速诊断,从而达到有效治疗个体,控制、消灭结核传播的目标。
结核病诊断:主要有以下几种方法:
(一)痰菌检查:以患者痰样本中检出结核菌做为确诊依据,是诊断肺结核的“金指标”。主要方法有:1痰涂片检查:利用痰涂片检查结核菌的存在情况,简便易行,但结核菌检出率较低;2结核菌培养:诊断痰标本进行细菌培养。结果可信度高,并能做结核菌药敏试验,但需时6-8周,应用受到限制。3.BACTEC 法测结核分枝杆菌的代谢物,一般两周可出结果,但菌量多少影响阳性结果出现的天数。4.分子诊断:利用特异引物或探针检测痰中的结核菌,灵敏度较高,但无法检测菌阴结核。
(二)Ⅹ射线检查:胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病,而且可以确定病灶的部位、性质、范围,了解发病情况及用于治疗效果的判断,并且开展方便,病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变,可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆,需要专业医生确证。
(三)肺结核病免疫学诊断:1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验,该试验阳性是感染过结核菌的证据之一。假阳性率高,容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断,如38kDa及其许多包含38kDa抗原在内的融合蛋白抗原,用于体液免疫方面的诊断,但也不可避免的出现假阳性率。
(四)其他检查,只能作为辅助诊断,不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查:可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变,并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能,对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查:均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结,并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查:主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题,因此迫切需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法,以快速、准确地诊断结核病。
APOL3(Apolipoprotein L3)基因是载脂蛋白L基因家族的一员,与22号染色体上的其他家族成员呈簇状存在,其编码蛋白存在于细胞质中,可能影响脂质(包括胆固醇)的运动和/或使脂质与细胞器结合。APOL3在脾、肺、淋巴结等器官和组织中高表达,参与炎症反应、脂蛋白代谢、I-kappaB激酶/NF-kappaB信号传导调控。此外,TNF-ɑ可诱导APOL3在正常和动脉粥样硬化的髂动脉和主动脉内皮细胞中的表达上调。目前未见与结核病相关报道,以及相关专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供分子标记物APOL3在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识,并且其具有良好的敏感性和特异性。
本发明所述的分子标记物APOL3,为已知基因,能够根据现有方法提取得到。研究显示该基因仅存在于灵长类动物(人及非洲绿猴),进化较晚。主要在人类血管组织表皮细胞中表达,基因位于人类22号染色体q13.1区域,蛋白全长331 个氨基酸,序列见参考文献(Duchateau,P.N.,et al.Apolipoprotein L gene family: tissue-specificexpression,splicing,promoter regions;discovery of a new gene.2001, J LipidRes 42,620-630.)1,2。
本发明更加详细的描述如下:
检测分子标记物APOL3表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
检测分子标记物APOL3表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
其中,所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
其中,其特征在于,所述结核病为肺结核或肺外结核。
APOL3在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
APOL3在制备诊断结核病的医疗器械中的应用,所述的诊断结核病的医疗器械以APOL3作为诊断分子标记物。
其中,检测分子标记物APOL3表达水平方法为荧光定量PCR法。
本发明的另一个目的在于提供诊断结核病的试剂盒。
本发明所述的试剂盒,包括以下组分:
CD14+细胞富集磁珠及相关试剂,细胞总RNA提取分离柱及相关试剂,cDNA 合成逆转录酶及相关试剂,APOL3序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR 相关试剂。
本发明的另一个目的在于提供诊断结核病的试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
第1步,全血样本处理
⑴吸取混匀全血到流式管中,向流式管中加入分离液,吹吸混匀;
⑵涡旋混匀CD14+磁珠,并迅速向稀释好的血液中加入,将流式管妥善安置在Hula Mixer上,旋转孵育;
第2步,磁性分离
⑴取出孵育好的细胞,瞬时离心,在磁力架上静置,吸去上清;
⑵加入分离液,轻轻吹匀后转移至对应蛋白低吸附管,吸去上清;
⑶从磁力架上取下,加入分离液,轻轻吹匀,磁力架上静置,吸去上清;
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞,涡旋震荡;
第3步,总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取,具体操作如下:
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置,吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中;
⑵向流穿液中加入乙醇,混匀,转移至RNeasy Mini柱中,离心,弃去流穿液;
⑶加入Buffer RW1,离心,弃去流穿液;
⑷加入Buffer RPE,离心,弃去流穿液;
⑸加入Buffer RPE,离心,更换新的收集管,开盖全速离心;
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的EP管,向柱膜中心加入水,静置;离心,所得RNA冰上放置备用;
第4步,cDNA的合成
取单核细胞总RNA,采用SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix进行反转录,得到中性粒细胞样本cDNA。
第5步,实时荧光定量PCR检测APOL3基因的相对表达量
采用第4步中制备的cDNA为模板,对APOL3特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR,进而得到各个样本模板中APOL3基因的相对表达量,
其中,具体步骤如下:
(1)配制反应体系1和反应体系2
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM 6and 7Flex实时荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测,使用2-ΔΔCt法计算各个模板中APOL3基因的相对表达量;
(3)统计分析使用GraphPad Prism 7对步骤(2)的结果进行统计分析。
现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断,病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50%;其余病原性阴性患者无法被检出。本发明为结核诊断的宿主分子标识,不限于病原学检测阳性人群,同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断,可有效提高临床结核病检出率。
名词解释:
对说明书中出现的英文及缩写,在此进行相应的解释(以下仅列举部分英文,请最好将全部英文进行解释):
TNF-ɑ:TumorNecrosisfactor-ɑ,肿瘤坏死因子-ɑ
CD14:白细胞分化抗原14
Hula Mixer:Hula混匀器
Buffer RLT:RLT缓冲液
RNeasy Plus Mini Kit:RNA提取试剂盒
gDNA:基因组DNA
RNeasy Mini Kit:RNA提取试剂盒
Buffer RW1:RW1缓冲液
Buffer RPE:RPE缓冲液
SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix:SuperScriptTMIV VILOTM混合液
cDNA:反转DNA
附图说明
图1实时定量PCR结果
注:TB:活动性肺结核患者;LTBI:潜伏感染者;HC:非活动性肺结核非潜伏感染者。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明,但不作为本发明的限制。
实施例1、
1.技术方案
1.1研究对象和方法
1.1.1研究对象
研究对象及纳入标准
研究对象来自深圳第三人民医院的确诊的肺结核住院患者,诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(WS 288—2017)肺结核诊断》标准,且病原学检测阳性即:痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性,无既往结核病史(问诊及X射线胸片检查无陈旧性结核病灶),初次抗结核治疗,用药少于7天;潜伏感染者(有临床接触史,无临床症状,且IGRA阳性)以及非活动性肺结核非潜伏感染者(对照组)。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院 /北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准,并签订知情意见通知书。
样本信息
本研究共收取151例宿主样本,分为三组,包括活动性结核组(ATB,ActiveTuberculosis,44例)、结核感染组(LTBI,Latent Tuberculosis Infection,46例)及正常对照组(HC,Health Control,61例)。共选用健康对照组61人,结核病潜伏感染组46人,活动性肺结核组44人,年龄、性别等详细信息见表1
表1.样本人口统计学资料
标本来源
分别抽取上述研究对象的外周血2.5mL,置于含肝素锂抗凝采血管(BDBiosciences,US),上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀),得到外周血标本。
1.1.2研究方法
磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内,而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性,不在分选柱内停留,进而使细胞得以分离。
1.1.2.1全血样本处理
⑴吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中,已1:2的比例向流式管中加入1.6mL 的4℃预冷的分离液,吹吸混匀;
⑵涡旋混匀CD14+磁珠(Invitrogen,US)并迅速向稀释好的血液中加入40μL/样,盖紧盖子,将流式管妥善安置在Hula Mixer(Invitrogen,US)上,4℃,8rpm旋转孵育20min。
1.1.2.2磁性分离
⑴取出孵育好的细胞,瞬时离心,在磁力架上静置2min,小心吸去上清;
⑵加入0.8mL分离液,轻轻吹匀后转移至对应2mL蛋白低吸附管。磁力架上静置2min,吸去上清。
⑶从磁力架上取下,加入0.8mL分离液,轻轻吹匀。磁力架上静置2min,吸去上清。重复1次。
⑷加入350μL的Buffer RLT(Qiagen,Germany)裂解细胞,涡旋震荡1min,4℃放置备用。
1.1.3总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)对磁珠分选的中性粒细胞总 RNA进行提取,具体操作如下:
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置2min,吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中, 12,000rpm离心30s;
⑵向流穿液中加入350μL 70%乙醇,混匀。转移700μL至RNeasy Mini柱中, 12,000rpm,离心15s,弃去流穿液。
⑶加入700μL Buffer RW1,12,000rpm,离心15s,弃去流穿液。
⑷加入500μL Buffer RPE,12,000rpm,离心15s,弃去流穿液。
⑸加入500μL Buffer RPE,12,000rpm,离心2min,更换新的收集管,开盖全速离心1min。
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的1.5mL的EP管,向柱膜中心加入30μL 水,静置1min。12,000rpm,离心1min,所得RNA冰上放置备用。
1.1.4cDNA的合成
取单核细胞总RNA,采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(Invitrogen,US)进行反转录,得到中性粒细胞样本cDNA。
1.1.5实时荧光定量PCR检测APOL3基因的相对表达量
采用步骤1.1.4中制备的cDNA为模板,对APOL3特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR,进而得到各个样本模板中APOL3基因的相对表达量。具体步骤如下:
(1)配制反应体系1和反应体系2
反应体系1(目的基因)为20μL,由10μLFast Advanced Master Mix(2X)(Applied Biosystems,US)、1μL CARD16 Assay(20X)(Applied Biosystems,US)、1μL cDNA(1pg-100ng)和8μL无核酸酶水组成。
反应体系2(内参基因)为20μL,由10μLFast Advanced Master Mix(2X)、1μL GAPDHAssay(20X)、1μL cDNA(1pg-100ng)和8μL无核酸酶水组成。
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM 6and 7Flex实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,US)上进行实时定量PCR检测。使用2-ΔΔCt法计算各个模板中APOL3基因的相对表达量。
反应条件:50℃2min;5℃预变性3min;95℃1s,60℃20sec,40个循环,荧光信号在延伸阶段采集。
(3)统计分析使用GraphPad Prism 7对步骤(2)的结果进行统计分析。
2.研究结果
2.1将定量PCR结果处理后,使用GraphPad Prism 7对数据进行分析,结果见图1.。由图可见,与非活动性肺结核非潜伏感染组和潜伏感染组相比,活动性结核病组的中性粒细胞中APOL3基因的相对表达水平与健康对照组,差异显著 (*P<0.05),与潜伏感染组差异极显著量显著增加(*P<0.01)。可以区别诊断健康人和结核病患者、潜伏感染和结核病患者,因此基因APOL3可以用做结核病的分子诊断标识。
3.结论:
APOL3基因可区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者,可以作为成为诊断活动性结核病的候选生物标志物。
实施例2、试剂盒
本发明的试剂盒由以下成分组成:
1.特定细胞富集抗体标记磁珠,Dynabeads CD15(Invitrogen,US)
2.细胞总RNA提取试剂盒,RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)
3.cDNA反转录酶,SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix(Invitrogen,US)
本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞APOL3基因表达量变化的检测,相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化,使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。
Reference:
1 Duchateau,P.N.,Pullinger,C.R.,Cho,M.H.,Eng,C.&Kane,J.P.Apolipoprotein L gene family: tissue-specific expression,splicing,promoter regions;discovery of a new gene.J Lipid Res 42, 620-630(2001).
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Claims (9)
1.检测分子标记物APOL3表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测分子标记物APOL3表达水平方法为荧光定量PCR法。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测分子标记物APOL3表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述结核病为肺结核或肺外结核。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,该试剂盒还包括如下组分:
CD14+细胞富集磁珠及相关试剂,细胞总RNA提取分离柱及相关试剂,cDNA合成逆转录酶及相关试剂,APOL3序列扩增特异性引物及实时荧光定量PCR相关试剂。
7.APOL3在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。
8.APOL3在制备诊断结核病的医疗器械中的应用,所述的诊断结核病的医疗器械以APOL3作为诊断分子标记物。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
第1步,全血样本处理
⑴吸取混匀全血到流式管中,向流式管中加入分离液,吹吸混匀;
⑵涡旋混匀CD14+磁珠,并迅速向稀释好的血液中加入,将流式管妥善安置在HulaMixer上,旋转孵育;
第2步,磁性分离
⑴取出孵育好的细胞,瞬时离心,在磁力架上静置,吸去上清;
⑵加入分离液,轻轻吹匀后转移至对应蛋白低吸附管,吸去上清;
⑶从磁力架上取下,加入分离液,轻轻吹匀,磁力架上静置,吸去上清;
⑷加入350μL的Buffer RLT裂解细胞,涡旋震荡;
第3步,总RNA提取
采用RNeasy Plus Mini Kit对磁珠分选的中性粒细胞总RNA进行提取,具体操作如下:
⑴配制反应体系1和反应体系2
将细胞裂解液在磁力架上静置,吸取细胞裂解液转移至gDNA去除柱中;
⑵向流穿液中加入乙醇,混匀,转移至RNeasy Mini柱中,离心,弃去流穿液;
⑶加入Buffer RW1,离心,弃去流穿液;
⑷加入Buffer RPE,离心,弃去流穿液;
⑸加入Buffer RPE,离心,更换新的收集管,开盖全速离心;
⑹将RNeasy Mini柱放入标记好编号的EP管,向柱膜中心加入水,静置;离心,所得RNA冰上放置备用;
第4步,cDNA的合成
取单核细胞总RNA,采用SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix进行反转录,得到中性粒细胞样本cDNA。
第5步,实时荧光定量PCR检测APOL3基因的相对表达量
采用第4步中制备的cDNA为模板,对APOL3特异引物对或内参引物对进行实时定量PCR,进而得到各个样本模板中APOL3基因的相对表达量,
其中,具体步骤如下:
(1)配制反应体系1和反应体系2
(2)实时定量PCR检测
将步骤(1)配制的各个反应体系在QuantStudioTM6 and 7 Flex实时荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测,使用2-ΔΔCt法计算各个模板中APOL3基因的相对表达量;
(3)统计分析使用GraphPad Prism 7对步骤(2)的结果进行统计分析。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201229 |
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