KR101643748B1 - 결핵 진단용 바이오마커 마이크로 rna - Google Patents

Abstract

본 발명은 결핵의 조기 진단에 유용한 바이오마커로 사용될 수 있는 마이크로 RNA 조성물 및 이의 발현량을 측정할 수 있는 결핵 진단 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 miRNA-302f로 이루어지며 결핵 감염에 의해 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 발현량을 측정할 수 있는 결핵 진단 키트에 관한 것이다.

Description

결핵 진단용 바이오마커 마이크로 RNA{Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis}

본 발명은 결핵의 조기 진단에 유용한 바이오마커로 사용될 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 'miRNA'라 한다) 조성물 및 이의 발현량을 측정할 수 있는 결핵 진단 키트에 관한 것이다.

결핵(tuberculosis)은 미코박테륨, 특히 결핵균의 감염에 의해 발생하는 전염성 질환이다. 세계적으로 전체 인구의 1/3이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되며 매년 약 800백만 명의 새로운 환자가 발생한다. 대부분의 감염자들은 증상이 없고 그 중 1/10 정도가 발병하며, 발병 시 적절한 치료를 하지 않으면 그 중 절반 이상이 사망에 이르게 된다. 전형적인 증상은 피가 섞인 가래를 동반한 기침, 오한, 식은땀, 체중 감소로 몸의 어느 기관에나 감염될 수 있기 때문에 감염된 기관에 따라 다양한 증상을 초래한다.

결핵의 초기 진단은 결핵의 확산을 방지하고 적절한 치료를 위하여 필수적이나 결핵은 진단이 어려운 질병중의 하나다. 결핵 진단의 가장 표준적인 방법(gold standard)은 선택된 배지에서 결핵균의 성장을 확인하는 것이다. 그러나 미코박테륨은 성장 속도가 느리기 때문에 검체 내에서 이러한 배양에는 3~12주의 오랜 시간이 소요된다. 객담 도말(sputum smear)은 빠른 결말을 얻을 수 있어 임상 실험실에서 널리 이용되고 있지만, 민감도가 낮다. PCR 기반의 핵산 증폭 방법과 면역학적 방법은 결핵의 초기 진단 및 빠른 진단에 커다란 진전을 가져왔다. 그러나 위양성 또는 위음성의 결과를 초래하는 결핵균의 내생성 증폭 저해 인자(endogenous amplification inhibition factor)나 신뢰도 낮은 품질관리(quality control) 등은 PCR 방법의 임상적 사용에 방해요소로 작용한다. 이에 결핵의 진단을 위한 새로운 바이오마커나 새로운 진단방법이 요구되고 있다.

miRNA는 소형의 비암호화(noncoding) RNA로 숙주세포에서 면역반응을 포함한 다양한 생리활성의 조절에 중요한 역할을 담당한다. 최근 들어, miRNA는 암, 심장질환, 임신, 당뇨, 정신질환 등 다양한 분야의 진단에서 새로운 형태의 바이오마커로서 심도 깊게 연구되어 지고 있다. miRNA-302 군은 인간배아줄기세포에서 주로 발견되며, 다기능 줄기세포를 유도하는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 그 역할에 대해서는 알려진 바가 적다.

본 발명은 결핵의 조기 진단 및 빠른 진단에 유용한 결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 결핵의 진단을 위하여 상기 바이오마커의 발현수준을 측정하는 데 사용될 수 있는 결핵진단용 진단 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 miRNA-302f(서열번호 1)로 이루어지며 결핵 감염에 의해 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

서열번호 1 : UAAUUGCUUCCAUGUUU

"바이오마커"는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 말한다. 말초혈액 유래 단핵세포에 결핵균을 감염시키면 miRNA-302f는 급속한 발현 변화를 나타내며 결핵균이 감염되지 않은 정상 세포에 비하여 2배 이상 발현량이 감소하였다. 실제 결핵환자와 결핵에 감염되지 않은 정상군의 말초혈액 유래 단핵세포나 감염조직에서 miRNA-302f는 발현이 감소하였으며, 이로부터 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료에서 발현량을 측정함으로써 결핵균의 감염 여부를 유의적으로 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 또한 miRNA-302f의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 결핵 진단용 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 진단 키트를 이용한 바이오마커의 동정 또는 검출에는 당업계의 모든 방법이 포함될 수 있다. 즉, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이를 활용하여 상기 바이오마커의 발현량을 측정할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 본 발명의 진단 키트는 상기 분석 방법에 따라 적절한 형태로 구성되며, 각 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR용 키트는 테스트 튜브, 완층액, 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs), 각종 효소, 사용 매뉴얼 등을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 공지되어 있는 miRNA-302f의 서열로부터 종래기술을 이용하여 이들 유전자 혹은 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있도록 디자인할 수 있으며, 이러한 프라이머의 디자인은 당업자라면 용이할 것이다. 하기 실시예에서는 miRNA-302f와 동일한 서열의 프라이머을 사용하였으나, 물론 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 프로브는 miRNA-302f와 특이적 결합을 이룰 수 있는 표지된 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편으로, 표지의 검출에 의해 miRNA-302f의 발현량을 측정할 수 있다. 프로브 역시 공지된 miRNA-302f의 서열로부터 종래기술을 이용하여 miRNA-302f와 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인하는 것은 당업자라면 용이할 것이다.

본 발명에서의 검체는 miRNA-302f가 발현되는 조직, 세포, 혈액 등 그 종류에 한정되는 것은 아니나, 채취의 용이성을 고려하면 혈액을 시료로 사용하는 것이 바람직하다.

이상과 같이 본 발명의 결핵 진단용 바이오마커 조성물에 의하면, 검체로부터 miRNA-302f의 발현량을 측정하는 것에 의해 종래 결핵 감염검사에 비해 환자에게 부담이 적고 결핵을 조기에 빠르게 효율적으로 진단할 수 있다.

도 1은 말초혈액 유래 단핵세포에서 결핵균 감염에 의한 miRNA-302f의 발현 변화를 보여주는 그래프.
도 2는 결핵환자의 말초혈액 유래 단핵세포에서 miRNA-302f의 발현량의 변화를 보여주는 그래프.
도 3은 결핵환자의 결핵균 감염 조직에서 miRNA-302f의 발현량의 변화를 보여주는 그래프.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

실시예

실시예 1 : 말초혈액 유래 단핵세포에서의 결핵균 감염에 의한 miRNA-302f 발현 분석

1) 말초혈액단핵세포의 수집 및 배양

결핵균에 감염되지 않은 정상인의 정맥혈을 제공받아 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)을 이용한 밀도구배 원심분리로 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells)를 수집하였다. 수집한 세포는 배양액 [RPMI 1640 (Gibco-BRL, 미국) with 10% human serum]에 2×10⁶/ml의 농도로 부유시켜 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48 well culture plate에 2시간 부착시킨 후 실험에 사용하였다. 분리된 단핵구의 순도는 항 CD14 항체를 이용한 유세포 측정으로 95% 이상임을 확인하였다.

2) 결핵균의 감염

1)에서 준비한 말초혈액 유래 단핵세포에 병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis를 배양 세포 1개당 감염된 균의 개체 평균수(multiplicity of infection, MOI)가 1:3이 되도록 첨가하여 37℃에서 2시간 감염시켰다. 결핵균이 감염된 단핵세포는 세포 외 결핵균을 제거하기 위하여 PBS 완충액으로 2회 세척한 후 추가적으로 37℃의 세포 배양기에서 배양하였다. 비교를 위하여 결핵균이 감염되지 않은 세포를 별도로 동일한 조건에서 배양하였다.

3) 말초혈액 유래 단핵세포에서의 miRNA 발현 분석

2)에서 6시간동안 배양한 실험군과 대조군의 세포로부터 Qiazol lysis reagent 시약(Qiagen, USA)을 사용하여 miRNeasy mini kit(Qiagen)의 제조사 방법에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 제조사 방법에 따라 miScript II RT Kit(Qiagen)을 사용하여 mature miRNA를 합성하였다. 이후, miScript SYBR Green kit(Qiagen) 및 miRNA-302f와 동일한 서열의 프라이머(Qiagen)로 real-time PCR에 의해 miRNA-302f 발현량을 정량하였다(normalization : small nuclear RNA(Rnu 6)).

도 1은 결핵균 감염에 따른 세포 내 miRNA-302f의 상대적 발현량 변화를 나타내는 그래프로, U는 대조군(결핵균 무처리군), Mtb는 실험군(결핵균 처리군)을 나타낸다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 결핵균이 감염된 정상인의 대식세포에서 miR-302f의 발현이 현저하게 감소되어 있음을 알 수 있다.

실시예 2 : 결핵균 감염 환자의 말초혈액 유래 단핵세포에서의 miRNA-302f 발현 분석

패결핵 감염 환자군(TB) 6명과, 결핵에 감염되지 않은 대조군(Non-TB) 6명의 정맥혈을 제공받아, 실시예 1의 1)과 동일한 방법에 의해 말초혈액 유래 단핵세포를 수집하였다. 실시예 1의 2)에 기재된 방법에 의해 수집된 말초혈액 유래 단핵세포에서 miRNA-302f의 발현을 정량하고 그 결과를 도 2에 도시하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 결핵 감염 환자는 비결핵 감염 대조군에 비해 miRNA-302f의 발현이 현저하게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 정맥혈을 시료로 사용하여 따라서 검사대상이 되는 사람의 정맥혈을 활용하여 단핵세포에서 발현된 miRNA-302f의 양을 측정함으로써, 결핵균 감염을 진단할 수 있음을 나타낸다.

실시예 3 : 결핵균 감염 환자의 감염 조직의 miRNA-302f 발현 분석

폐결핵은 진단 시 폐와 관련된 종양 혹은 박테리아성 폐렴 등으로 오인될 가능성이 높으며, 오진으로 인하여 외과적 수술에 이르는 경우가 발생한다. 따라서 간단한 폐 조직 검사를 통한 진단의 가능성을 확인하기 위하여, 폐조직에서의 miRNA-302f의 발현량을 조사하였다.

패결핵 감염 환자군(TB) 12명과, 결핵에 감염되지 않은 대조군(Non-TB) 13명의 파라핀 고정 조직 또는 생검 조직으로부터 miRNeasy kit(Qiagen) 혹은 miRNeasy mini kit을 이용하여 제조사의 방법에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA는 실시예 1의 3)과 동일한 방법에 의해 mature miRNA를 합성하고, real-time PCR에 의해 miRNA-302f의 발현을 정량하였다.

도 3은 대조군과 폐결핵 감염 환자군의 폐조직에서의 miRNA-302f의 발현량을 나타낸 그래프로, 말초혈액 유래의 단핵세포에 대한 실시예 1 및 실시예 2의 결과와 마찬가지로 폐결핵 감염 환자군의 폐조직에서도 miRNA-302f의 발현이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis <130> P0815-622 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uaauugcuuc cauguuu 17

Claims (5)

1. 서열번호 1의 miRNA-302f을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 바이오마커 조성물.
   
2. miRNA-302f의 발현량을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 결핵 진단용 키트.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 키트는 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인 결핵 진단용 키트.
   
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 프라이머는 miRNA-302f와 동일한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 키트.
   
5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 진단 키트의 검체는 혈액 또는 결핵균 감염 의심 조직인 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 키트.

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