CN113913543A

CN113913543A - Ehp实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113913543A
Application number: CN202111260627.7A
Authority: CN
Inventors: 孙妍; 魏俊利; 陈浩楠; 董学旺; 刘群
Original assignee: Tianjin Animal Diseases Control & Prevention Center
Current assignee: Tianjin Animal Diseases Control & Prevention Center; Tianjin Changlu Hanyan Modern Aquatic Science And Technology Development Co ltd
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113913543B

Abstract

本发明提出EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，该引物探针组合包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。采用上述引物探针组合的检测方法和试剂盒能够实现高灵敏度、高特异性的EHP检测，为对虾肝肠胞虫病的早检测早防控提供条件。

Description

EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物病原检测技术领域，尤其涉及EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)2009年首次在泰国生长缓慢的养殖斑节对虾中被分离并命名，是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫，近年来在泰国、印度、越南、马来西亚、印度尼西亚和中国等主要对虾养殖国家中流行，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等养殖虾类。该病原具有非常强的传染性，可通过多途径传播，能在虾的消化器官细胞内大量繁殖，吸收营养，从而影响肝胰腺和肠道的正常消化吸收功能，使被寄生的虾类生长发育受阻碍，严重时可导致其生长停止。EHP属于胞内寄生的微孢子虫，且形成的孢子可以在各种恶劣的环境中休眠，在环境适宜的条件下又重新复活侵染宿主，极难清除，没有有效的治疗手段和药物，目前只能采取在亲虾的筛选、虾苗的培育和对虾的标粗、养殖过程中实时监测的措施来降低风险，减少损失，而国内外关于EHP的生活史、致病机理和导致该病爆发的因子等方面的研究几乎是空白，也没有有效的控制和预防该病的方法，在养殖生产过程中人们对于EHP的发生、爆发和蔓延仍束手无策。发明人的团队在对虾肝肠胞虫病的调查中发现：一些池塘的对虾从放苗开始直至养成的各阶段EHP抽检结果都显示阳性，但其体长体重指标仍符合正常对虾生长曲线，没有出现生长缓慢或生长停滞等现象；而一些池塘的对虾EHP检测结果为阳性，当生长至3-5cm的时候就不再继续长大。由此推测，对虾肝肠胞虫疾病的爆发可能与虾体内EHP的载量相关，且也已经有相关文献报道了对虾体内EHP的载量与虾体长体重呈现负相关。

因此，建立快速灵敏实用的EHP定量检测技术，不仅能及时预报预测该病原所致病害的发生，同时也是今后加强科学养殖管理，提出防控措施所必须的。然而，目前对虾疾病的检测技术如现场目视观察法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法、分子生物学法等均存在局限性，不能达到理想的检测要求，且仅是用于EHP的定性检测，不能定量。PCR技术检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作相对简便，目前已广泛应用于对虾肝肠胞虫病的检测。特别是Tagman荧光定量PCR技术提供了病原定量检测的新途径。

但是，目前报道的EHP的Tagman定量检测产品和检测方法的灵敏度和特异性还不能满足检测需要。高灵敏度、高特异性的EHP检测方法是有效控制对虾肝肠胞虫病传播，避免疫病大面积爆发的基础和前提，也是各级水生动物疫病防控机构、科研机构以及大规模对虾养殖场对该病监测、检疫的迫切需要。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提出EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，能够实现高灵敏度、高特异性的EHP检测，为对虾肝肠胞虫病的早检测早防控提供条件，同时也为水生动物疫病防控提供了技术保障，对保障我国对虾养殖业健康发展具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明第一方面提供了一种EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。

本发明第二方面提供了一种EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组合。

作为优选，该试剂盒还包括无菌无酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。

作为优选，所述阳性对照品为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU。

作为优选，所述阴性对照品为DEPC水。

作为优选，所述PCR反应液包括TagD NA聚合酶、dNTPs和缓冲液。

本发明第三方面提供了采用上述试剂盒的EHP实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)设计、合成引物和探针：根据GenBank(登录号：FJ496356.1)中公布的对虾肝肠胞虫SSU基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；

(2)制备对照品：制备重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU作为阳性对照品，以DEPC水作为阴性对照品；

(3)EHP荧光定量PCR扩增：提取待测样品DNA，使用步骤(1)中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，对待测样品进行Tagman荧光定量RT-PCR扩增反应；

(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。

作为优选，所述步骤(2)的阳性对照品制备方法为：使用EHP-SSU质粒扩增上游引物：5'-GCGGTCCATGATGGCAGC-3'和下游引物：5'-ATACGGTTATTTAA-3',以对虾肝肠胞虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU，作为阳性对照品。

作为优选，所述步骤(2)的扩增反应体系为：上游引物(10μmol)1μl；下游引物(10μmol)1μl；模板1μl；2×Premix Tag buffer 12.5μl；DEPC水9.5μl，总体积为25μl。

作为优选，所述步骤(2)的扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃50s，72℃1min，共30个循环；72℃7min，4℃保存。

作为优选，所述步骤(3)的扩增反应体系为：EHP上游引物(10μmol)0.5μL；EHP下游引物(10μmol)0.5μL；EHP探针(10μmol)1μL；模板2μL；2×Probe PCR buffer Mix 12.5μL；DEPC水8.5μL，总体积为25μL。

作为优选，所述步骤(3)的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。

作为优选，所述步骤(4)的检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾肝肠胞虫核酸阳性，待检样品Ct值＞40或显示为None，判为对虾肝肠胞虫核酸阴性，待检样品FAM通道38＜Ct值＜40，判为可疑，需重新检测，若重新检测38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判为对虾肝肠胞虫核酸阳性。

此外，本发明还提供了上述的引物探针组合在制备EHP检测产品中的应用，所述产品可为试剂盒、PCR检测试剂、检测芯片等。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：提出了EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法。本发明利用对虾肝肠胞虫的基因组保守区序列设计了一对引物及荧光探针，通过优化荧光定量PCR反应条件和反应体系，建立起对虾肝肠胞虫的荧光定量PCR检测体系，该检测方法灵敏度高，最低检出限可以达到2-3个拷贝；特异性强，不仅可以区分其它对虾常见几种重大疫病病原，还可以区分与其它水产微孢子虫类病原；适用范围广，可用于对养殖南美白对虾、斑节对虾等的对虾肝肠胞虫早期感染及跟踪监测，还能用于与该病原绝对定量相关的基础科学研究，具有很高的科学及实用价值。可为对虾肝肠胞虫病的早检测早防控提供条件，同时也为水生动物疫病防控提供了技术保障，对保障我国对虾养殖业健康发展具有重要意义。

附图说明

图1为重组质粒pUC57-SSU酶切图谱，其中：1为重组质粒pUC57-SSU经BamHI和HindIII酶切后的质粒片段和目标基因片段，M为DL10000分子质量标准；

图2为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU与EHP核酸的同源性比对结果；

图3为通过EHP实时荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线；

图4为EHP实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测结果图，其中，1-9分别为2.5×10⁸copies/μl、2.5×10⁷copies/μl、2.5×10⁶copies/μl、2.5×10⁵copies/μl、2.5×10⁴copies/μl、2.5×10³copies/μl、2.5×10²copies/μl、2.5×10¹copies/μl、2.5×10⁰copies/μl，10为阴性质控；

图5为EHP实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果图，其中1为阳性质控，2-5分别为对虾白斑病毒、对虾传染性皮下与造血器官坏死病病毒、对虾高致病性副溶血弧菌、对虾虹彩病毒，6为阴性对照；

图6为通过EHP实时荧光定量PCR检测方法对临床样品检测的结果图。

图7为实施例7的“套式PCR”方法灵敏度检测结果图，其中1-6分别为4×10⁵copies/μl、4×10⁴copies/μl、4×10³copies/μl、4×10²copies/μl、4×10¹copies/μl、4×10⁰copies/μl，7为阴性质控，M为DL2000 Marker；

图8为实施例7的EHP实时荧光定量PCR检测结果图，其中1-6分别为4×10⁵copies/μl、4×10⁴copies/μl、4×10³copies/μl、4×10²copies/μl、4×10¹copies/μl、4×10⁰copies/μl，7为阴性质控；

图9为EHP实时荧光定量PCR检测方法用于区别鉴定对虾肝肠胞虫与其它甲壳动物微孢子虫类病原的特异性检测结果图，其中1为阳性质控，2-4分别为脊尾白虾微孢子虫、三疣梭子蟹微孢子虫、河蟹微孢子虫，5为阴性对照。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1EHP实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.1特异性引物和探针设计

根据GenBank(登录号：FJ496356.1)中公布的对虾肝肠胞虫SSU基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针，利用Tagman探针技术，建立了快速、特异、灵敏的对虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法。

引物、探针序列如下：

EHP上游引物：5'-GGGATCAAGGACGAAGGC-3'，SEQ ID NO.1

EHP下游引物：5'-CTCGCAACACCCAGCATT-3'，SEQ ID NO.2

EHP探针：5'-FAM-TATCGAAAGTGATTAGACACCGCTGT-TAMRA-3'，SEQ ID NO.3，EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。

1.2 EHP阳性质控和阴性质控的建立

1.2.1阳性质控构建

将感染对虾肝肠胞虫病的对虾肝胰腺组织采用海洋动物基因组提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)进行DNA提取，以所提取的对虾肝肠胞虫基因组DNA作为PCR反应模板，使用EHP-SSU质粒扩增上游引物：5'-GCGGTCCATGATGGCAGC-3'(SEQ ID NO.4)和下游引物：5'-ATACGGTTATTTAA-3'(SEQ ID NO.5)，进行PCR扩增，其中：

扩增反应体系(总体积25μl)为：上游引物(10μmol)1μl；下游引物(10μmol)1μl；模板1μl；2×Premix Tag buffer 12.5μl；DEPC水9.5μl；

反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃50s，72℃1min，共30个循环；72℃7min，4℃保存。

所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU，作为阳性对照品(阳性质控)，即完成阳性质控构建，扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

验证实验：将所得的重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建对虾肝肠胞虫重组大肠杆菌pUC57-SSU-TOP10株，并对该重组菌进行了鉴定。结果表明，该重组菌株为革兰氏阴性杆菌，在LB琼脂平板上培养后形成大小为1-2mm、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽的黄白色圆形菌落；pUC57-SSU重组质粒经通用引物M13扩增，能够扩增出大小约为848bp的条带，且重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU经BamHI和HindIII酶切后能够得到与目标片段大小一致的酶切片段(如图1所示)，PCR产物经测序比对与GenBank中登录的对虾肝肠胞虫SSU基因序列一致性为100％(如图2所示)。表明该PCR产物构建的质粒适用于EHP核酸检测的阳性质控。

1.2.2阴性质控构建

以DEPC水(DNase、RNase free，购自天根生物公司)作为阴性对照品(阴性质控)。通过观察溶液的颜色及性状，该批次的DEPC水为无色澄清液体，按《中国兽药典》2015年版三部附录进行检验，该批次的DEPC水无菌生长。用对虾肝肠胞虫荧光PCR检测方法进行检测，结果对虾肝肠胞虫核酸均为阴性。

1.3EHP荧光定量PCR扩增

使用1.1步骤中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，进行PCR扩增，其中：

扩增反应体系为：EHP上游引物(10μmol)0.5μL；EHP下游引物(10μmol)0.5μL；EHP探针(10μmol)1μL；模板2μL；2×Probe PCR buffer Mix 12.5μL；DEPC水8.5μL，总体积为25μL；

反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s；共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。

1.4结果判定

通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值。实验成立的条件为：阳性对照Ct值均≤30，阴性对照的Ct值均显示为None，则判定实验成立。检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾肝肠胞虫核酸阳性，待检样品Ct值＞40或显示为None，判为对虾肝肠胞虫核酸阴性，待检样品FAM通道38＜Ct值＜40，判为可疑，需重新检测，若重新检测38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判为对虾肝肠胞虫核酸阳性。

1.5 EHP实时荧光定量PCR检测标准曲线的建立

使用Easy dilution(购自宝日医)将重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU进行5倍梯度稀释(2.5×10⁷copies/μl～6.4×10¹copies/μl)，以9个浓度梯度的重组质粒作为建立标准曲线的模板,进行荧光定量PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.3相同。

上述9个浓度梯度，每个浓度重复3次，取3次的均值，以循环数为横坐标，荧光强度的对数值为纵坐标，绘制得标准曲线如图3所示，得到的相关系R²＝0.9934，方程式为Y＝-0.3202x+12.952，从图3可以看出，2.5×10⁷copies/μl～6.4×10¹copies/μl浓度的PCR扩增曲线均有效。

实施例2灵敏度评价

采用了Easy dilution(购自宝日医)梯度稀释的重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU作为灵敏度检验的模板，进行PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.3相同。

以拷贝数来衡量灵敏度，实验结果如图4所示，从该实验结果可以看出，本发明的检测方法对重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU的最低检出限为2.5copies/μl(以核酸浓度来衡量灵敏度，最低检出限为9.4×10^-9ng/μl)。

实施例3特异性评价

采用实施例1的EPH实时荧光定量PCR检测方法对虾肝肠胞虫、对虾白斑病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病病毒、对虾虹彩病毒、高致病性副溶血弧菌进行检测，用于该方法区别鉴定对虾肝肠胞虫(EHP)与其它对虾常见几种重大疫病病原的特异性检测，检测结果如图5所示，从图5的检测结果可以看出，除对虾肝肠胞虫外，其他病原菌均未出现有效扩增曲线，表明所述试剂盒及检测方法在检测鉴定对虾常见几种病原间具有良好的特异性。

实施例4重复性评价

以重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU标准品浓度为2×10⁵copies/μl、1×10⁶copies/μl、5×10⁶copies/μl为模板，采用实施例1的EHP实时荧光定量PCR检测方法进行重复性试验，结果如表1所示。

表1 对虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的重复性评价

标准品浓度	CT值	平均值X±SD	变异系数％CV
				2×10<sup>5</sup>copies/μl	25.228、25.25、25.24	25.24±0.01	0.04％
1×10<sup>6</sup>copies/μl	22.687、22.672、22.657	22.672±0.015	0.06％
				5×10<sup>6</sup>copies/μl	20.729、20.866、20.808	20.801±0.069	0.3％

从表1的结果可以看出，不同浓度标准品组内的变异系数(CV)在0.04％～0.3％之间，表明该方法具有较好的重复性。

实施例5检测试剂盒

一种EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒采用实施例1中步骤1.1设计的EHP上游引物、EHP下游引物、EHP探针，该试剂盒的组成还包括：无菌无核酸酶水、PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品。

其中，阳性对照品为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU；阴性对照品为DEPC水；PCR反应液(购自宝日医，主要成分为TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液)。

实施例6临床样品定量检测实验

采用实施例1的EPH实时荧光定量PCR检测方法对1份对虾体内肝肠胞虫载量进行定量检测，用不同稀释度的待测样品获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线(如图6所示)，获得用y代表的对虾肝肠胞虫拷贝数对数，与用x代表的Ct值的二元一次方程Y＝-0.3202x+12.952，根据此二元一次方程可计算出待测样品的对虾肝肠胞虫拷贝数，实现定量检测。

检测结果：本实施例的样品获得的Ct值为22.919，代入方程Y＝-0.3202x+12.952，获得样品对虾肝肠胞虫拷贝数对数(y)为5.61，所以所测样品的对虾肝肠胞虫拷贝数为10^5.61copies/μl，约为410521copies/μl。

实施例7检测效果对比试验

对比本发明的对虾肝肠胞虫(EHP)实时荧光定量PCR检测方法与中华人民共和国水产行业标准“虾肝肠胞虫病诊断规程”(SC/T7232-2020)的“套式PCR”的检测效果，评价二者在检出率和灵敏度检测结果的优劣。具体试验如下：

7.1与标准中“套式PCR”检测方法检出率的比较

采用实施例1的EPH实时荧光定量PCR检测方法和标准中“套式PCR”检测方法分别对50尾疑似感染EHP的对虾进行检测(该50尾对虾样品采集自已经确认感染EHP的对虾养殖池塘，并且部分对虾已具有典型症状，虾体大小参差不齐)，检测结果如表2所示。

表2 实施例1的检测方法与“套式PCR”检测方法的检测结果对比表

从表2的实验结果可以看出，套式PCR检测方法的阳性检出率为92％，而实施例1的EPH实时荧光定量PCR检测方法的阳性检出率为100％，同时，采用“套式PCR”检测方法检出的4个阴性样品，通过实施例1的EPH实时荧光定量PCR检测方法的重新检测判定为弱阳性，证明了本发明的EPH实时荧光定量PCR检测方法与“套式PCR”检测方法相比较，灵敏度更高，可以降低虾肝肠胞虫病的漏检率。

7.2与标准中“套式PCR”检测方法灵敏度的比较

将实施例6中用于检测对虾肝肠胞虫拷贝数的样品用Easydilution进行10倍梯度稀释，稀释后的样品对虾肝肠胞虫拷贝数分别为4×10⁵copies/μl、4×10⁴copies/μl、4×10³copies/μl、4×10²copies/μl、4×10¹copies/μl、4×10⁰copies/μl，采用标准中“套式PCR”方法将上述6个稀释后样品分别进行“套式PCR”和荧光定量PCR扩增(检测结果如图7所示)，结果显示套式PCR检测方法最低检出限为400个拷贝。而上述6个稀释后样品采用实施例1的检测方法可以全部检出(检测结果如图8所示)，说明本发明的检测方法较“套式PCR”检测方法灵敏度提高了近100倍。

实施例8EHP实时荧光定量PCR检测方法的种属间特异性

采用实施例1的检测方法对虾肝肠胞虫、脊尾白虾微孢子虫、三疣梭子蟹微孢子虫、河蟹微孢子虫进行检测，用于该方法区别鉴定虾肝肠胞虫与其它水产微孢子虫类病原的特异性检测，实验结果如图9所示，结果显示除对虾肝肠胞虫外，其他微孢子虫类病原均未出现有效扩增曲线，表明本发明的试剂盒及检测方法具有良好的种属间特异性，弥补了标准中“荧光定量PCR”检测方法对虾肝肠胞虫特异性不高的不足。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 天津市动物疫病预防控制中心

<120> EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gggatcaagg acgaaggc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctcgcaacac ccagcatt 18

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atacgaaagt gattagacac cgctgt 26

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcggtccatg atggcagc 18

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atacggttat ttaa 14

<210> 6

<211> 848

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcggtccatg atggcagcag gcgcgaaatt gtccctcttt tgagaggaga cagttatgaa 60

acgtgagtag aagggtcgag tgtaaaaacc ttgacgtgaa gcaattggag ggcaagtttt 120

ggtgccagca gccgcggtaa ttccaactcc aagagtgtct atggtggatg ctgcagttaa 180

agggtccgta gtcgtagatg caattaaaag gtggtgttaa aagccattga gtttgttgag 240

agtagcggaa cggataggga gcatggtata ggtgggcaaa gaatgaaatc tcaagacccc 300

acctggacca acggaggcga aagcgatgct cttagacgta tctggggatc aaggacgaag 360

gctagagtat cgaaagtgat tagacaccgc tgtagttcta gcagtaaact atgccgacaa 420

tgctgggtgt tgcgagagcg atgcttggtg tgggagaaat cttagttttc gggctctggg 480

gatagtacgc tcgcaagggt gaaacttaaa gcgaaattga cggaaggaca ctaccaggag 540

tggattgtgc tgcttaattt aactcaacgc gggaaaactt accagggtca agtctatcgt 600

agattggaga catgaggtag acaagagtgg tgcatggccg ttggaaattg atggggggac 660

ttttagctta agtgctggaa ccagtgagat cttctagaca gggggtattt aaggacaagg 720

aggaaaaagg caataacagg ttccggatgc ccttaaatat ccgggggcag cagcgcaata 780

caatttctct tgaaaaaaac aaacaaattt aaaaagataa ggaattaatt ttttttaaat 840

aaccgtat 848

Claims

1.一种EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合，其特征在于，包括EHP上游引物、EHP下游引物和EHP探针；所述EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。

2.权利要求1所述的EHP实时荧光定量PCR检测引物探针组合在制备EHP检测产品中的应用。

3.一种EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。

4.根据权利要求3所述的EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括无菌无酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。

5.根据权利要求4所述的EHP实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU，所述阴性对照品为DEPC水。

6.一种EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：

(1)设计、合成引物和探针：根据GenBank中公布的对虾肝肠胞虫SSU基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，EHP上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EHP下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，EHP探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EHP探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；

7.根据权利要求6所述的EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的阳性对照品制备方法为：使用EHP-SSU质粒扩增上游引物：5'-GCGGTCCATGATGGCAGC-3'和下游引物：5'-ATACGGTTATTTAA-3',以对虾肝肠胞虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾肝肠胞虫质粒pUC57-SSU，作为阳性对照品。

8.根据权利要求7所述的EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的扩增反应体系为：上游引物(10μmol)1μl；下游引物(10μmol)1μl；模板1μl；2×Premix Tagbuffer 12.5μl；DEPC水9.5μl，总体积为25μl；扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃50s，72℃1min，共30个循环；72℃7min，4℃保存。

9.根据权利要求6所述的EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。

10.根据权利要求6所述的EHP实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾肝肠胞虫核酸阳性，待检样品Ct值＞40或显示为None，判为对虾肝肠胞虫核酸阴性，待检样品FAM通道38＜Ct值＜40，判为可疑，需重新检测，若重新检测38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判为对虾肝肠胞虫核酸阳性。