CN109337990A - 一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒 - Google Patents
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A，试剂B，试剂C，试剂D，试剂E，试剂F，试剂G，装有试剂H的检测管。本发明试剂盒检测的特异性和灵敏度高，采用磁珠提取核酸，可充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，极大降低了假阳性率；本发明的试剂盒的整个操作过程简便，在1.5‑2个小时之内就可以完成检测，并且不需要高端的仪器设备。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖中病原的检测技术，具体涉及虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)的检测试剂盒。
背景技术
虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)，全称为肠道上皮细胞微孢子虫，属微孢子虫科，肠胞虫属，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名。2013年，EHP在国内首次被发现。感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色发白，肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，一般不会有大规模死亡现象，但是会造成对虾生长缓慢，造成饲料损耗，产量低，从而给渔民造成较大的经济损失。目前针对EHP还没有有效的治疗手段，及早发现并采取必要措施阻止病原传播是公认最有效的方法。因此建立灵敏、准确、快速、便捷的检测技术是减少虾肝肠胞虫病暴发的重要途径。
目前，诊断EHP的方法主要有：组织切片观察、原位杂交、PCR、实时荧光定量PCR等技术。这些方法多数需要昂贵精密的设备仪器，并且操作复杂，耗时长，需要专业技术人员操作，并不能满足现场快速诊断的要求。因此，目前迫切需要一种操作简单、结果准确可靠、结果判断直观、成本低廉的现场快速检测方法，为疾病的防控提供技术保障。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，在60-65℃的恒温条件下，经过30-50分钟就可以完成核酸扩增反应。在LAMP反应体系中事先加入与Mn2+螯和的钙黄绿素，Mn2+可以使钙黄绿素的绿色荧光淬灭，当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn2+结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出绿色荧光，通过颜色的变化来判断反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便等特点，广泛应用于各种病原体的检测。目前，已有研究人员开发建立了EHP的LAMP检测技术，但由于传统病毒核酸的提取需要实验室的专业设备，操作较为繁琐复杂等问题，阻碍了LAMP检测技术在养殖过程中的推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种不需要实验室专业仪器设备，操作简便快速的虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO4 2μl，5M的甜菜碱1μl，
100μM的引物EHP-FIP 0.4μl，所述引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；
100μM的引物EHP-BIP 0.4μl，所述引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；
100μM的引物EHP-LF 0.2μl，所述引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；
100μM的引物EHP-LB 0.2μl，所述引物EHP-LB的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；
100μM的引物EHP-F3 0.05μl，所述引物EHP-F3的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；
100μM的引物EHP-B3 0.05μl，所述引物EHP-B3的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示；
8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料灭菌双蒸水11.7μl混合的试剂H；
研磨棒，一次性吸管，牙签，1.5ml样品管和磁力架。
虾肝肠胞虫阳性质粒是用下述方法制成：将人工合成的用SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。
本发明的优点：
我们优选了虾肝肠胞虫的SSU基因保守序列区设计了6条特异性引物，相比较4条特异性引物不仅提高了检测的特异性和灵敏度，而且极大缩短了反应时间；采用磁珠提取核酸的方法，可以充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，避免了SYB-Green等其它显色原理类似的染料必须在扩增反应结束后开盖再加入的情况，极大降低了假阳性率；该试剂盒的整个操作过程十分简便，在1.5-2个小时之内就可以完成虾肝肠胞虫的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成，适合在实际生产的过程中推广使用。
附图说明：
图1本发明的试剂盒检测结果的颜色判定，其中1号管为空白对照反应结果，2号管为阳性对照反应结果，3号管为实施例4检测结果。
具体实施方式
组织裂解液Ⅰ和组织裂解液Ⅱ购自天根生物试剂公司；
核酸提取磁珠购自厦门鑫海东方生物科技有限公司；
Bst DNA聚合酶(含10×Buffer)，40mM的脱氧核糖核苷酸，100mM的MgSO4购自NewEngland Biolabs；
5M的甜菜碱购自Sigma；
钙黄绿素染料购自荣研生物科技有限公司；
pMD-18T载体，TOP10细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
质粒提取试剂盒购自天根生物试剂公司。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
虾肝肠胞虫阳性质粒优选下述方法制成：将人工合成的用SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。
人工合成的用SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的来源：
文献中查阅虾肝肠胞虫的SSU基因保守序列，根据这段基因保守序列设计以SEQID NO.8所示的核苷酸序列为上游引物F，以SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列为下游引物R，以虾肝肠胞虫的DNA为模板，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，其核苷酸序列用SEQ ID NO.7所示，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。
各实施例中，引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；引物EHP-LB的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；引物EHP-F3的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；引物EHP-B3的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示；
实施例1
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：100mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO4 2μl，5M的甜菜碱1μl，100μM的引物EHP-FIP 0.4μl，100μM的引物EHP-BIP 0.4μl，100μM的引物EHP-LF 0.2μl，100μM的引物EHP-LB 0.2μl，100μM的引物EHP-F3 0.05μl，100μM的引物EHP-B3 0.05μl，8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料灭菌双蒸水11.7μl混合的试剂H；
研磨棒，一次性吸管，牙签，1.5ml样品管，磁力架。
实施例2
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：
用体积百分比浓度为65％的乙醇水溶液替换实施例1试剂D的体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
用90mg核酸提取磁珠替换实施例1试剂F中的100mg核酸提取磁珠；其它同实施例1。
实施例3
一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，包括：
用体积百分比浓度为80％的乙醇水溶液替换实施例1试剂D的体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
用110mg核酸提取磁珠替换实施例1试剂F中的100mg核酸提取磁珠；其它同实施例1。
实施例4
使用实施例1的一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒对虾肝肠胞虫快速检测，包括如下步骤：
步骤一：核酸的提取：
(1)取成虾的肝胰腺组织30mg，置于1.5ml样品管中，用一次性吸管加入4滴试剂A，用研磨棒快速将样品充分研磨；
(2)向匀浆液中加入4滴试剂B，充分颠倒混匀，10000rpm离心3min，用一次性吸管吸取上清液至一新的1.5ml样品管中；
(3)将试剂F颠倒混匀，加入一滴试剂F至步骤(2)中的样品管中；
(4)向样品管中滴入4滴试剂C，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上，静置5min，用一次性吸管将上清液吸出并弃掉；
(5)向样品管中滴入8滴试剂D，充分颠倒混匀后，放回磁力架上，静置3min，用一次性吸管将上清液吸出并弃掉；
(6)重复步骤(5)1次；
(7)将样品管盖打开，55℃水浴放置4分钟后，从水浴锅中取出；
(8)向样品管中滴入1滴试剂E，充分颠倒混匀后，放回磁力架上；
步骤二：核酸的扩增反应：
(9)用三个牙签分别蘸取试剂G、试剂E以及步骤一中(8)获得的上清液，分别至装有试剂H的检测管内，置于65℃保温45分钟，80℃保温4分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色。
含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂E的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，样品结果显示为荧光绿色，阳性，见图1。耗时约1.5个小时。
实施例5
使用实施例2的一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒对虾肝肠胞虫可视化快速检测，步骤一(1)取不同于实施例4的幼虾头胸部约20mg，置于1.5ml的样品管中；
其它步骤同实施例4；
检测结果显示为橙黄色，阴性。耗时约1.5个小时。
实施例6
使用实施例3的一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒对虾肝肠胞虫可视化快速检测，步骤一(1)取仔虾个体，置于一个1.5ml的样品管中；
其它步骤同实施例4；
检测结果显示为荧光绿色，阳性。耗时2小时。
本申请的技术方案得到天津市农业科技成果转化项目(201502070)，天津市科技支撑计划项目(14ZCZDNC00007)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)的资助。
本申请的各人工序列均为自行设计后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
序列表
<110> 天津市水生动物疫病预防控制中心
<120> 一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcagcaca atccactcct gggctcgcaa gggtgaaact 40
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgcgggaa aacttaccag gggcaccact cttgtctacc tc 42
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtccttcc gtcaatttcg c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaagtctat cgtagattgg agaca 25
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttcgggctc tggggata 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccccatcaa tttccaacgg 20
<210> 7
<211> 588
<212> DNA
<213> 虾肝肠胞虫(enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 7
tgtctatggt ggatgctgca gttaaagggt ccgtagtcgt agatgcaatt aaaaggtggt 60
gttaaaagcc attgagtttg ttgagagtag cggaacggat agggagcatg gtataggtgg 120
gcaaagaatg aaatctcaag accccacctg gaccaacgga ggcgaaagcg atgctcttag 180
acgtatctgg ggatcaagga cgaaggctag agtatcgaaa gtgattagac accgctgtag 240
ttctagcagt aaactatgcc gacaatgctg ggtgttgcga gagcgatgct tggtgtggga 300
gaaatcttag ttttcgggct ctggggatag tacgctcgca agggtgaaac ttaaagcgaa 360
attgacggaa ggacactacc aggagtggat tgtgctgctt aatttaactc aacgcgggaa 420
aacttaccag ggtcaagtct atcgtagatt ggagacatga ggtagacaag agtggtgcat 480
ggccgttgga aattgatggg gggactttta gcttaagtgc tggaaccagt gagatcttct 540
agacaggggg tatttaagga caaggaggaa aaaggcaata acaggttc 588
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccgcggtaa ttccaactcc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaacctgtta ttgccttt 18
Claims (2)
1.一种虾肝肠胞虫可视化快速检测试剂盒，其特征是包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：虾肝肠胞虫阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，10mM的脱氧核糖核苷酸2.5μl，100mM的MgSO4 2μl，5M的甜菜碱1μl；
100μM的引物EHP-FIP 0.4μl，所述引物EHP-FIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；
100μM的引物EHP-BIP 0.4μl，所述引物EHP-BIP的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示；
100μM的引物EHP-LF 0.2μl，所述引物EHP-LF的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；
100μM的引物EHP-LB 0.2μl，所述引物EHP-LB的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示；
100μM的引物EHP-F3 0.05μl，所述引物EHP-F3的核苷酸序列用SEQ ID NO.5所示；
100μM的引物EHP-B3 0.05μl，所述引物EHP-B3的核苷酸序列用SEQ ID NO.6所示；
8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料灭菌双蒸水11.7μl混合的试剂H；
研磨棒，一次性吸管，牙签，1.5ml样品管和磁力架。
2.根据权利要求1所述的一种虾肝肠胞虫可视快速检测试剂盒，其特征是所述虾肝肠胞虫阳性质粒是用下述方法制成：将人工合成的用SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为虾肝肠胞虫阳性质粒。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190215 |