CN105624295B

CN105624295B - 一种多形微眼藻荧光定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN105624295B
Application number: CN201610055659.6A
Authority: CN
Inventors: 甄毓; 乔玲; 米铁柱
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN105624295A

Abstract

本发明公开了一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞‑质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。本发明利用多形微眼藻的特异性引物通过荧光定量PCR技术对海水中的多形微眼藻进行检测，在确保准确性的基础上，不仅提高了灵敏度，而且实现了样品在短时间内进行大批次处理的目的，大大缩短了工作时间，为实现对多形微眼藻进行快速、准确的定性定量研究提供了强大的工具。

Description

一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法

技术领域：

本发明涉及海洋浮游植物检测的技术领域，特别涉及多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。

背景技术：

浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均匀的情况。浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件下爆发性增殖或聚集在一起而已发赤潮现象。赤潮发生时会有大量的鱼类和贝类死亡，导致重大的经济损失和严重的海洋生态灾难，毒素还会富集在贝类和鱼类的体内，人类使用后会引发疾病。

为预防赤潮的发生，需要对水体中藻类进行种类和数量检测，现阶段针对藻类的荧光定量PCR检测方法较多，如中国专利公开号，CN 101906467 A公开了一种荧光定量PCR检测微小原甲藻的方法，包括：(1) 藻液的预处理抽取海域中的样品藻液，离心收集细胞，然后用pH 7.0 的PBS 缓冲液洗涤两次后重悬，制成密度为2.5×108cell/L 的待处理藻液；(2) 荧光定量PCR 引物及浓度优SYBR 法的荧光定量引物序列为：PM-1iF ：CCCCCATGCAGAGACTCAA，PM-1iR ：CAGCAAGGACAGGCACAGAA ；引物终浓度为：200nmol/L ；(3)微小原甲藻的细胞个数和基因组DNA 检测取步骤(1) 中得到的待处理藻液于离心管中，在冰浴中进行超声波处理，显微镜观察直至所有细胞均被破碎，将藻液按1：10 倍稀释，5 个稀释度，每个稀释度重复3 次，然后进行荧光定量PCR 扩增，计算得出微小原甲藻的细胞个数。再如中国专利公开号CN 102392076 A公开了一种产2-MIB 蓝藻的PCR 定性和TaqMan荧光定量PCR 定量的检测方法，其步骤是：A、采集待测水样，经0.45μm 的醋酸纤维素膜过滤，将过滤到的藻进行总基因组DNA 的提取和纯化，将提取到的DNA 溶于无菌双蒸水中，置-20℃保存；B、定性PCR 的反应体系为：2×PCR 反应体系10μl，特异性扩增2-MIB 合成相关单萜环化酶基因的正反引物各1μl，待检测的DNA 1μl，以双蒸水校正至20μl 体积，所用引物为：CITf5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3，CITr 5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3，以产2-MIB蓝藻DNA 为阳性对照，双蒸水为阴性对照；C、定性PCR 的反应程序为：94℃预变性3min，接着40 个循环，每个循环94℃ 30s、58℃ 30s 和72℃ 30s，循环过后最后72℃延伸5min ；D、定性PCR 产物和阳性对照、阴性对照一起进行2％ w/w 琼脂糖凝胶电泳，电泳过后溴化乙锭染色，紫外灯下观测，目标条带长度为206bp 。

现有技术中，根据藻类不同建立不同的引物设计和对应性的检测方法，现有技术中少有针对多形微眼藻检测的记载，如《中国海洋大学学报》2015年3月公开的渤海海域褐潮期微型浮游生物多样性的初步研究，作者：于杰，张玲玲，孙妍等，其公开了检测时可变区V-的扩增及产物3′末端加A利用18rsDNA，V9区通用引物V9F（5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′）和V9R（5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′），扩增可变区V9：这种检测方法，发现了除抑食金球藻外的另一种优势藻－多形微眼藻，该藻属硅藻门、微眼藻属，长2.1-3.4μｍ，细胞呈圆形、近圆形或长椭圆形。褐潮爆发期间多形微眼藻丰度较高这一现象，褐潮爆发后，除抑食金球藻外，还伴随中肋骨条藻、假微型海链藻和多形微眼藻的增长。多形微眼藻能降低海湾扇贝幼虫的生长率，与渤海海域褐潮期观察到的海湾扇贝幼虫的滞长现象一致。综合以上研究结果，抑食金球藻和多形微眼藻在褐潮海域均有分布，且二者在光镜下大小相近，形态相似，都能抑制海湾扇贝的生长，研究发现二者在褐潮爆发时可大量共存。由此推测，渤海海域褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻共同作用而成。因此，研究一种针对多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类的多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种针对多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类的多形微眼藻荧光定量PCR检测方法。

为实现本发明目的，本发明提供了一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。

步骤E中多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计为：

MpF（5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC）

MpR（5’-ATACCCTACCATCCAAAG）。

步骤F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备：以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min，收集目的片段处的凝胶，选用小量胶回收试剂盒回收目标DNA片段，然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养，取部分菌液送测序公司测序。若验证为阳性克隆，用质粒提取纯化试剂盒提取质粒，制作多形微眼藻18S rDNA质粒标准品。

步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立-多形微眼藻质粒标准曲线的绘制：用核酸蛋白分析仪测得多形微眼藻质粒标准品的浓度为175.9 ng/µL，根据质粒浓度与基因拷贝数之间的关系公式：拷贝浓度（copy/µL）=(Con×6.02×10¹⁴)/( 碱基对×660)，计算得到质粒标准品中18S rDNA的拷贝浓度为1.28×10¹² copy/µL，对质粒标准品做10倍梯度稀释，获得拷贝浓度为1.28×10⁹、1.28×10⁸、1.28×10⁷、1.28×10⁶、1.28×10⁵、1.28×10⁴1.28×10³、1.28×10² copy/µL的梯度稀释样品，作为荧光实时定量PCR的梯度标准品，放入-80℃冰箱保存待用，用德国罗氏（Roche）公司的FastStart Universal SYBR GreenMaster(Rox)试剂盒，以MpF和MpR为引物，上述8个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR，每个稀释浓度样品做三个平行样，外加一个阴性对照，以样品18S rDNA基因拷贝数对数值（以10为底）为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线，标准方程为y=-2.8792x+39.255（R² = 0.989），其中y为Ct值，x为质粒拷贝数以10为底的对数值；

步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立-多形微眼藻细胞标准曲线的绘制：收集6.6×10⁷个多形微眼藻细胞，提取其DNA，最终使1 μL溶液中DNA量相当于1.1×10⁵个细胞，将其按照10倍梯度稀释至1.1 cells/μL，取1.1~1.1×10⁵ cells/μL的DNA溶液作为标准品，以MpF和MpR为引物，上述6个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR，每个稀释浓度样品做三个平行样，外加一个阴性对照，以细胞数对数值（以10为底）为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制细胞标准曲线，标准方程为y=-3.432x+34.097（R² = 0.9964），其中y为Ct值，x为细胞数以10为底的对数值；

步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立：根据上述两条标准曲线，计算出质粒标准品中每组质粒拷贝数相应的细胞数，然后分别以质粒拷贝数和细胞数的对数（以10为底）为横、纵坐标，生成回归曲线即为表示质粒拷贝数与细胞数对应关系的标准曲线，标准方程为y=0.8389x-1.503（R² = 0.989），其中y为细胞数以10为底的对数值，x为质粒拷贝数以10为底的对数值，此标准方程可以清楚地表示细胞数和质粒拷贝数的关系，在实验中可通过计算样品中的质粒拷贝数，得到样品所含多形微眼藻的细胞数。

步骤H、环境样品中多形微眼藻的定量：以某海域现场样品提取的DNA作为模板，用德国罗氏（Roche）公司的FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒，以MpF和MpR为引物，进行实时荧光定量PCR，借助多形微眼藻细胞-质粒标准曲线，计算出该藻的细胞密度，得到其季节变化图4和水平分布图。

本发明的优点为：多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类，具体为：

本发明针对以往检测方法的不足：传统的形态学检测和计数方法费时费力、操作繁琐，需要操作人员具有丰富的分类学经验和较高的操作技能，不适用于大批量复杂样品的统计分析，也难以满足种群结构和数量实时监测的需求。此外，多形微眼藻个体较小，很难将其与其它物种区分开，这会进一步增加计数的误差。

本发明改进的荧光定量PCR技术的优点：利用多形微眼藻的特异性引物通过荧光定量PCR技术对海水中的多形微眼藻进行检测，在确保准确性的基础上，不仅提高了灵敏度，而且实现了样品在短时间内进行大批次处理的目的，大大缩短了工作时间，为实现对多形微眼藻进行快速、准确的定性定量研究提供了强大的工具。

附图说明：

图1 ，多形微眼藻质粒标准曲线，

图2 ，多形微眼藻质粒标准曲线，

图3，多形微眼藻细胞-质粒标准曲线，

图4 ，2013年秦皇岛海域多形微眼藻平均细胞密度季节变化，

图5， 2013年秦皇岛海域多形微眼藻细胞密度水平分布情况

具体实施方式：

本发明多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，步骤如下：

A、藻种培养及收集：

多形微眼藻培养在f/2培养基中，光照强度为4000 lux，温度为20±1℃，光暗周期为12 h:12 h。当藻类培养至指数生长期时，先使用浮游植物计数框对其进行荧光计数，然后采用离心法进行收集，先将藻液进行 6000 rpm、10 min 离心，弃上清液，再将剩余浓缩藻液移至2 mL离心管中进行8000 rpm、8 min 离心，弃上清后迅速放入液氮中冷冻，然后置于-80℃超低温冰箱保存待用。

B、藻类总DNA的提取：

（1）向收集的样品中加入250 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH=8.0；1 mM EDTA，pH=8.0），置于振荡器上将其混合均匀后8000 rpm离心8 min，小心弃上清。

（2）向离心管中加入500 µL、55℃的抽提缓冲液（3% CTAB；1% Sarkocyl；20 mMEDTA，pH=8.0；1.4 M NaCl；0.1 M Tris-HCl；1% α-巯基乙醇），置于震荡器上使其混合均匀，置于55℃水浴一小时，期间每隔10 min将管取出，颠倒混匀20~30次。水浴结束后将其置于4℃3min。

（3）向离心管中加入1mL氯仿︰异戊醇（24︰1），颠倒混匀20~30次，使之呈乳浊液后14000 rpm、4℃离心10min。小心吸取上清液（500µL）至新的离心管中。

（4）向离心管中加入内含液体二倍体积的无水乙醇（约1mL）和1/10体积的醋酸钠（约50µL），混匀后置于-80℃冷却1h。取出后室温自然解冻，14000 rpm、4℃离心10min，出现白色DNA沉淀，小心弃上清液。

（5）用4℃、70%乙醇漂洗DNA沉淀。

（6）将离心管置于超净工作台内自然风干，用60µL TE缓冲液溶解DNA沉淀，置于-80℃保存待用。

C、核糖体18S rDNA的PCR扩增：

将按照上述方法提取的多形微眼藻DNA作为模板，用真核藻类18S rDNA通用引物Euk1A（5’- CTG GTT GAT CCT GCCA G）和 Euk516r（5’- ACC AGA CTT GCC CTC）进行PCR扩增，PCR反应体系和程序见表1。

D、电泳检测及测序：

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min。将通过验证的阳性PCR产物送测序公司（华大基因，北京）测序。测序结果如下，经BLAST验证后，确定其为多形微眼藻18S rDNA 基因序列。

E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证

从GenBank数据库中下载秦皇岛海域常见藻种的18S rDNA基因序列，使用Clustalx软件将其与多形微眼藻18S rDNA基因序列进行比对，选择相似性较低的区域，用Primer Premier 5设计引物。通过评估各项参数，设计出引物MpF（5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC）和

MpR（5’-ATACCCTACCATCCAAAG）。

上述引物的特异性采用以下方法进行验证：以2012年6月秦皇岛海域六个站位（S2、S6、F2、F6、C2、C6）的环境DNA样品为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，PCR反应体系和程序见表2。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min。将通过验证的阳性PCR产物送测序公司（华大基因，北京）测序。测序结果经BLAST验证后，确定其为多形微眼藻18S rDNA 基因序列。

F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备

以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，PCR反应体系和程序见表2。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min。收集目的片段处的凝胶，选用小量胶回收试剂盒（TakaRa，大连）回收目标DNA片段，操作步骤参照说明书。然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养。取部分菌液送测序公司（华大基因，北京）测序。若验证为阳性克隆，用质粒提取纯化试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取质粒，制作多形微眼藻18S rDNA质粒标准品。

G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立：

多形微眼藻质粒标准曲线的绘制：

用核酸蛋白分析仪测得多形微眼藻质粒标准品的浓度为175.9 ng/µL，根据质粒浓度（Con）与基因拷贝数之间的关系公式：拷贝浓度（copy/µL）=(Con×6.02×10¹⁴)/( 碱基对×660)，计算得到质粒标准品中18S rDNA的拷贝浓度为1.28×10¹² copy/µL。对质粒标准品做10倍梯度稀释，获得拷贝浓度为1.28×10⁹、1.28×10⁸、1.28×10⁷、1.28×10⁶、1.28×10⁵、1.28×10⁴ 1.28×10³、1.28×10² copy/µL的梯度稀释样品，作为荧光实时定量PCR的梯度标准品，放入-80℃冰箱保存待用。

用德国罗氏（Roche）公司的FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒，以MpF和MpR为引物，上述8个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR。反应体系和程序见表3。

每个稀释浓度样品做三个平行样，外加一个阴性对照。以样品18S rDNA基因拷贝数对数值（以10为底）为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线，如图1所示。标准方程为y=-2.8792x+39.255（R² = 0.989），其中y为Ct值，x为质粒拷贝数以10为底的对数值。

多形微眼藻细胞标准曲线的绘制：

收集6.6×10⁷个多形微眼藻细胞，提取其DNA，最终使1 μL溶液中DNA量相当于1.1×10⁵个细胞。将其按照10倍梯度稀释至1.1 cells/μL。取1.1~1.1×10⁵ cells/μL的DNA溶液作为标准品。以MpF和MpR为引物，上述6个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR。反应体系和程序见表3。每个稀释浓度样品做三个平行样，外加一个阴性对照。以细胞数对数值（以10为底）为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制细胞标准曲线，如图2所示。标准方程为y=-3.432x+34.097（R² = 0.9964），其中y为Ct值，x为细胞数以10为底的对数值。

多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立：

根据上述两条标准曲线，计算出质粒标准品中每组质粒拷贝数相应的细胞数，然后分别以质粒拷贝数和细胞数的对数（以10为底）为横、纵坐标，生成回归曲线即为表示质粒拷贝数与细胞数对应关系的标准曲线，如图3所示。标准方程为y=0.8389x-1.503（R² =0.989），其中y为细胞数以10为底的对数值，x为质粒拷贝数以10为底的对数值。此标准方程可以清楚地表示细胞数和质粒拷贝数的关系，在实验中可通过计算样品中的质粒拷贝数，得到样品所含多形微眼藻的细胞数。

H、环境样品中多形微眼藻的定量“

以2013年秦皇岛海域5个航次的现场样品提取的DNA作为模板，用德国罗氏（Roche）公司的FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒，以MpF和MpR为引物，进行实时荧光定量PCR。反应体系和程序见表3。借助多形微眼藻细胞-质粒标准曲线，计算出该藻的细胞密度，其季节变化如图4所示，水平分布如图5所示。

由图4可知，2013年秦皇岛海域多形微眼藻的平均细胞密度有明显的季节变化趋势：先升高后降低，9月份达到峰值，平均细胞密度为5.92×10⁴个/L。

由图5可知，多形微眼藻首先在秦皇岛海域南部暴发，随后向北迁移，9月，整个海域中多形微眼藻的细胞密度均较高，12月，该藻的细胞密度有所降低，且南部海域高于北部。

综上，经过步骤H的具体例子，可以发现本发明多形微眼藻的检测方法简便，灵敏度高，准确率高，有效区别多形微眼藻与其他藻类，具体为：本发明针对以往检测方法的不足：传统的形态学检测和计数方法费时费力、操作繁琐，需要操作人员具有丰富的分类学经验和较高的操作技能，不适用于大批量复杂样品的统计分析，也难以满足种群结构和数量实时监测的需求。此外，多形微眼藻个体较小，很难将其与其它物种区分开，这会进一步增加计数的误差。本发明改进的荧光定量PCR技术的优点：利用多形微眼藻的特异性引物通过荧光定量PCR技术对海水中的多形微眼藻进行检测，在确保准确性的基础上，不仅提高了灵敏度，而且实现了样品在短时间内进行大批次处理的目的，大大缩短了工作时间，为实现对多形微眼藻进行快速、准确的定性定量研究提供了强大的工具。

<110> 中国海洋大学

<120>一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法

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<210> 1

<211> 20

<212> rDNA

<213> MpF

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<307>

<400>

TTAGATAGAAACCAACCCTC

<210> 2

<211> 18

<212> rDNA

<213> MpR

<220>

<307>

<400>

ATACCCTACCATCCAAAG

<210> 3

<211> 530

<212> rDNA

<213> 多形微眼藻18S rDNA 基因序列

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<307>

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CAGATTTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAATACTTTTACTTTGAAACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTTATAGTTTATTTGATAGTCCCTTACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCATCAATACCCAACTGTTCGCGGACGGGTAGTATTTATTAGATAGAAACCAACCCTCTTCGGAGGCGCTCAGGTGATTCATGATAACTCTGCGAATCGCATGGCCTCGTGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGATAATTAGGGTTAGATTCCGGAGAGGGGGCATGAGAGATGGCCACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTCTAGGTCTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGCCTGGTAAGA

Claims

1.一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，以及包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量，

步骤E中多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物为：

MpF：5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC

MpR：5’-ATACCCTACCATCCAAAG

步骤F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备：以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min，收集目的片段处的凝胶，回收目标DNA片段，然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养，取部分菌液送测序公司测序，用质粒提取纯化试剂盒提取阳性克隆质粒，制作多形微眼藻18S rDNA质粒标准品；

所述核糖体的18S rDNA 基因序列：

CAGATTTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAATACTTTTACTTTGAAACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTTATAGTTTATTTGATAGTCCCTTACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCATCAATACCCAACTGTTCGCGGACGGGTAGTATTTATTAGATAGAAACCAACCCTCTTCGGAGGCGCTCAGGTGATTCATGATAACTCTGCGAATCGCATGGCCTCGTGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGATAATTAGGGTTAGATTCCGGAGAGGGGGCATGAGAGATGGCCACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTCTAGGTCTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGCCTGGTAAGA 。

2.根据权利要求1所述多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，包括多形微眼藻质粒标准曲线的绘制：测定多形微眼藻质粒标准品的浓度，计算得到质粒标准品中18S rDNA的拷贝浓度，对质粒标准品做10倍梯度稀释，作为荧光实时定量PCR的梯度标准品，放入-80℃冰箱保存待用，以MpF和MpR为引物，对梯度稀释标准品进行实时荧光定量PCR，每个稀释浓度样品做三个平行样和一个阴性对照，以样品18S rDNA基因拷贝数对数值为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线；

步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，包括多形微眼藻细胞标准曲线的绘制：收集6.6×10⁷个多形微眼藻细胞，提取其DNA，使1 μL溶液中DNA量相当于1.1×10⁵个细胞，将其按照10倍梯度稀释至1.1 cells/μL，取1.1~1.1×10⁵ cells/μL的DNA溶液作为标准品，以MpF和MpR为引物，将6个稀释浓度的样品为模板，进行实时荧光定量PCR，每个稀释浓度样品做三个平行样和一个阴性对照，以细胞数对数值为横坐标，以实时荧光定量PCR反应获得的平均Ct值为纵坐标，绘制细胞标准曲线；

步骤G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立：根据上述两条标准曲线，计算出质粒标准品中每组质粒拷贝数相应的细胞数，然后分别以质粒拷贝数和细胞数的对数为横、纵坐标，生成回归曲线，通过计算样品中的质粒拷贝数，得到样品所含多形微眼藻的细胞数。

3.根据权利要求1所述多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤H、环境样品中多形微眼藻的定量：以海域现场样品提取的DNA作为模板，以MpF和MpR为引物，进行实时荧光定量PCR，借助多形微眼藻细胞-质粒标准曲线，计算出该藻的细胞密度，得到其季节变化图和水平分布图。