CN106591474A - 一种虾肝肠微孢子虫lamp检测试剂盒 - Google Patents

一种虾肝肠微孢子虫lamp检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括组织裂解液及LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液各组分如下：LAMP内引物各1.4mM，LAMP外引物各0.2mM，20mM Tris‑HC，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X‑100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl2，水余量。本发明特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，克服现有检测方法在养殖病害监测中无法直接应用的问题，适合虾肝肠微孢子虫病的筛查与预防。

Description

一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明涉及水生动物病害检测技术领域，特别涉及一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒。
背景技术
虾肝肠微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)病是由一种微孢子虫(microsporidia)寄生引起的，根据2009年在泰国斑节对虾(Penaeus monodon)上表现出来的症状而命名，主要存在于虾肝胰腺(HP)中，2014年以来EHP疫情正在中国、印尼、印度、马来西亚和泰国等地广泛发生，因此EHP是养殖虾病害中的一个新兴问题，已给全球养殖虾产业造成极大的危害，迫切需要控制。研究已发现EHP能够感染南美白对虾(Penaeusvannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、日本沼虾、斑节对虾等，而且既可以垂直传播也可以水平传播，虾与虾之间的直接传播方式可能是经口传播；EHP主要感染虾的肠道表皮，进而感染肝胰腺，引起对虾肠道吸收功能下降，严重的出现肠炎和肝胰腺萎缩，导致虾在养殖过程中出现生长速度缓慢，个体差异大、参差不齐的现象，但并不会立即死亡，相反虾肠道饱满，食欲正常，所以从表面上看起来，虾并没有明显疾病症状，仅偶尔伴随有白便或者在应激条件下才出现大量死亡；由于患病对虾也一直吃饲料，所以养殖投入高，结果收获甚微，给养殖业造成巨大的经济损失。
EHP是一种很小的孢子虫，比一般的微孢子虫小很多，比一般的细菌都小，又不形成肉眼可见的胞囊，没有经验很难辨别。其在肝胰腺细胞质中由早期原生质阶段发育成成熟的孢子，胞质中的多核原生质体阶段在原生质体表面存在大量的小泡，在早期原生质发育阶段以质核二分裂方式形成大量的孢子前体，待胞质形成电子密度盘和极管前体后，早期孢子于原生质表面以出芽方式释放。成熟孢子椭圆形，大小为0.7×1.1μm，具单核，有一锚盘连着极丝、后端有一个空泡，孢子壳电子密度高，壳由质膜、透明芽孢和透明外壁组成。目前该病原的检测方法主要是利用染色的活组织印片、涂片或切片光镜检查，或者采用电镜法以及PCR检测法，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是操作繁琐，对实验人员技术要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作；二是对检测设备要求高，养殖企业和基层检测机构无法实现常规检测；三是检测方法耗时长，灵敏度不高，容易漏检。
LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶作用下进行恒温扩增，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。其中荧光染料法具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该技术在虾肝肠微孢子虫(EHP)的检测中未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，克服现有检测方法在养殖病害监测中无法直接应用的问题，适合虾肝肠微孢子虫病的筛查与预防。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括组织裂解液及LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液各组分如下：LAMP内引物各1.4mM，LAMP外引物各0.2mM，20mM Tris-HC，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl2，水余量。
本发明开发了适用于虾肝肠微孢子虫LAMP检测的反应体系，LAMP扩增反应液各成分的组合实现了LAMP扩增后能进行荧光检测得到结果，而常规的LAMP扩增反应体系则难以实现荧光检测，无荧光或荧光无法分辨结果。
本发明针对虾肝肠微孢子虫基因组DNA设计开发了特异性强、灵敏度高的特异性LAMP引物，相对于普通的PCR引物检测效果更好，特异性更强、灵敏度更高。
本发明利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与绿色荧光染料相结合快速便捷的检测养殖虾(南美白对虾、罗氏沼虾、日本沼虾、斑节对虾)肝肠微孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)。本发明根据扩增反应前后钙黄绿素(Calcein)和锰离子的结合不同来展现颜色变化。在扩增反应结束后，检测管中反应液显示浅橙色表明反应结果为阴性，当检测管反应液显示绿色，表明反应结果为阳性。
作为优选，所述LAMP外引物为引物对，具体如下：
引物EHP-F3：5’-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3’，
引物EHP-B3:5’-CAGCACAATCCACTCCTGG-3’。
作为优选，所述LAMP内引物为引物对，具体如下：
引物EHP-FIP:5’-AAGCATCGCTCTCGCAACACCACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3’，
引物EHP-BIP:5’-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACGGTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3’。
具体地，所述LAMP扩增反应液各组分如下：引物EHP-FIP 1.4mM，引物EHP-BIP1.4mM，引物EHP-F3 0.2mM，引物EHP-B3 0.2mM，20mM Tris-HC，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl2，水余量。
作为优选，所述Tris-HC的pH为8.0～9.0.
作为优选，所述组织裂解液各组分的组成为：50～100mM Tris-HCl，20～40mMEDTA，40～100μg/mL蛋白酶K，40～100μg/mL RNase A，0.5％～1.5％SDS，100～200mMNaCl，水余量。
作为优选，所述EDTA的pH为7.0～8.0。
作为优选，所述虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒还包括阳性对照样品以及阴性对照样品，其中阳性对照样品为虾肝肠微孢子虫基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNasefree water。
与现有检测技术比较，本发明所提供的虾肝肠微孢子虫LAMP荧光检测方法具有以下优点：
1、本发明所采用的LAMP引物是根据EHP保守基因的六个不同区域设计的，特异性比仅有一对引物的常规PCR强。
2、本发明的试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的100倍。
3、本发明的试剂盒检测时间短，可以在90min左右获得检测结果，比常规PCR节约3～4小时。
4、本发明的试剂盒对仪器设备要求低，不需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，仅需要恒温水浴锅与便携式离心机即可。
5、本发明的检测试剂盒操作简单，结果直观易判定，易于推广应用。
6、本发明的检测试剂盒对人和环境较安全，整个过程不使用有毒物质。
附图说明
图1为扩增温度对LAMP反应的影响图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：60℃恒温条件下扩增结果；泳道2：61℃恒温条件下扩增结果；泳道3：62℃恒温条件下扩增结果；泳道4：63℃恒温条件下扩增结果；泳道5:64℃恒温条件下扩增结果；泳道6：65℃恒温条件下扩增结果。
图2为本发明的特异性实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：对虾肝肠微孢子虫(EHP)；泳道2：南美白对虾白斑综合症病毒(WSSV)；泳道3：罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)；泳道4：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)；泳道5：对虾桃拉病毒(TSV)；泳道6：阴性对照。
图3为本发明检测EHP的灵敏度实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；左侧泳道1～9：模板分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9倍稀释的基因组DNA；泳道10：无模板。
图4为PCR方法检测EHP的灵敏度实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；左侧泳道1～9：模板分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍稀释的基因组DNA；泳道7：无模板。
图5为本发明检测感染EHP样品实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；左侧检测管：为无荧光染料样品检测结果；中间检测管：为阳性样品检测结果；右侧检测管：为阴性对照样品检测结果。
图6为扩增时间对LAMP反应的影响图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：60min扩增结果；泳道2：45min扩增结果；泳道3：30min扩增结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，包括组织裂解液、LAMP扩增反应液、阳性对照样品以及阴性对照样品，其中阳性对照样品为虾肝肠微孢子虫基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。
所述LAMP扩增反应液各组分如下：
引物EHP-FIP 1.4mM，引物EHP-BIP 1.4mM，引物EHP-F3 0.2mM，引物EHP-B30.2mM，20mM Tris-HC(pH 8.0～9.0)，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％TritonX-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mMMnCl2，水余量。
引物EHP-F3：5’-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3’(SEQ ID No.1)；
引物EHP-B3：5’-CAGCACAATCCACTCCTGG-3’(SEQ ID No.2)。
引物EHP-FIP：
5’-AAGCATCGCTCTCGCAACACCACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3’(SEQ ID No.3)，
引物EHP-BIP：
5’-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACGGTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3’(SEQ ID No.4)。
所述组织裂解液各组分的组成为：50～100mM Tris-HCl(pH 8.0～8.5)，20～40mMEDTA(pH 7.0～8.0)，40～100μg/mL蛋白酶K，40～100μg/mL RNase A，0.5％～1.5％SDS，100～200mM NaCl，水余量。
本发明试剂盒的使用方法：
1、虾组织DNA的提取：
取25～50mg的虾肝胰腺或肠，加入50～100μL组织裂解液匀浆混合，37～56℃温育25～30min，95℃变性5min。
2、虾肝肠微孢子虫LAMP扩增：
(1)根据待检样品数，加入所需的LAMP扩增反应液(含阳性对照、阴性对照)，每管检测预反应液体积为20μL；
(2)在核酸检测反应管中加入5μL待检样品DNA；
(3)标记清楚后，将检测反应管置于60～65℃，反应30～60min；
3、虾肝肠微孢子虫LAMP检测结果判定：
在扩增反应结束后，检测管中反应液显示浅橙色表明反应结果为阴性，当检测管反应液显示绿色，表明反应结果为阳性。
试验部分：
1、材料
感染虾肝肠微孢子虫的对虾样采集自浙江省杭州市萧山区某养殖场；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司；dNTP、购自promega公司；钙黄绿素、氯化锰、甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。
2、南美白对虾样品DNA的提取：
(1)取25mg的虾肝胰腺，加入50μL组织裂解液匀浆混合，56℃温育30min，95℃变性5min，5000rpm离心2min。
(2)取10μL离心上清进行10-1～10-9的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。
3、虾肝肠微孢子虫EHP-LAMP恒温扩增：
(1)根据待检样品数，加入相应倍数的核酸检测反应液(1.4mM EHP-FIP和1.4mMEHP-BIP，0.2mM EHP-F3和0.2mM EHP-B3,20mM Tris-HCl,10mM氯化钾,15mM硫酸铵,8mM硫酸镁,0.1％Triton X-100,0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP,8U BstDNA聚合酶大片段，1.25mMCalcein，25mM MnCl2)，每管检测预反应液体积为20μL；
(2)分别吸取5μL不同浓度的待检样品DNA加入核酸检测反应管中，混合均匀；
(3)标记清楚后，将检测反应管置于60℃水浴锅中，反应45min；
4、虾肝肠微孢子虫EHP PCR扩增(对比试验)：
(1)根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测反应液：2×PCR Master Mix 25μL,10μM PCR扩增引物各0.5μL，模板5μL，用双蒸水补足至50μL。扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1s、55℃退火45s、72℃延伸30s，30个循环后72℃10min。
PCR扩增引物为：
EHP-F:5’-GAAATCTCAAGACCCCACCT-3’(SEQ ID No.5)，
EHP-R:5’-CTGTTATTGCCTTCTCCCTC-3’(SEQ ID No.6)。
(2)将PCR扩增产物置于4℃保存。
5、虾肝肠微孢子虫LAMP扩增产物进行凝胶电泳：
(1)配置2％的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5μL的反应产物；
(2)电泳30分钟后凝胶成像，EHP-LAMP结果见图2和图3，EHP-PCR结果见图4。
6、本发明试剂盒检测感染EHP样品，肉眼观察结果如图5所示。
利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测虾肝肠微孢子虫，经过凝胶电泳，由图1、2、3可见阶梯状的扩增条带；图2特异性实验结果和图3灵敏度检测结果表明本发明检测试剂盒具有较好的特异性和灵敏度；图6表明EHP-LAMP检测用时较短，远低于PCR方法；利用荧光染料展示反应结果，图5结果表明色差对比度高，易于分辨。
根据以上实验结果表明，本发明的检测试剂盒和检测方法可以为EHP提供快速、简便、灵敏的现场检测。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒
<130> 2017.01.11
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggatcaagg acgaaggct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagcacaatc cactcctgg 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcatcgct ctcgcaacac cacaccgctg tagttctagc a 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcgggctct ggggatagta cggtccttcc gtcaatttcg ct 42
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaaatctcaa gaccccacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgttattgc cttctccctc 20

Claims (7)

1.一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括组织裂解液及LAMP扩增反应液，所述LAMP扩增反应液各组分如下：LAMP内引物各1.4mM，LAMP外引物各0.2mM，20mMTris-HC，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mMdNTP，2.5U/μL Bst DNA聚合酶大片段，1.25mM钙黄绿素，25mM MnCl2，水余量。
2.根据权利要求1所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP外引物为引物对，具体如下：
引物EHP-F3：5’-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3’，
引物EHP-B3:5’-CAGCACAATCCACTCCTGG-3’。
3.根据权利要求1所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP内引物为引物对，具体如下：
引物EHP-FIP:5’-AAGCATCGCTCTCGCAACACCACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3’，
引物EHP-BIP:5’-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACGGTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3’。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HC的pH为8.0～9.0。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述组织裂解液各组分的组成为：50～100mM Tris-HCl，20～40mM EDTA，40～100μg/mL蛋白酶K，40～100μg/mL RNase A，0.5％～1.5％SDS，100～200mM NaCl，水余量。
6.根据权利要求5所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述EDTA的pH为7.0～8.0。
7.根据权利要求1所述的一种虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述虾肝肠微孢子虫LAMP检测试剂盒还包括阳性对照样品以及阴性对照样品，其中阳性对照样品为虾肝肠微孢子虫基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。
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