CN103409555B - 罗氏沼虾野田村病毒rt-lamp-lfd检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列的保守区域设计了MrNVRT-LAMP-LDF反应系统所需引物与探针；采用本发明人配制的病毒RNA提取试剂提取MrNV病毒RNA，使用本发明建立的MrNVRT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断与预防。
Description
技术领域
本发明涉及水生动物病毒检测领域，特别涉及一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
罗氏沼虾白体病(white tail disease, WTD)，又称白尾病，是由罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV）引起的一种主要危害罗氏沼虾淡化苗，以病虾肌肉出现白斑、白浊或全身发白为特征的传染病，死亡率最高达100%，对罗氏沼虾养殖业造成极大的危害。目前，WTD是世界性的罗氏沼虾疾病，该病已被列为OIE申报疫病和我国水生动物二类疫病。
研究表明，罗氏沼虾野田村病毒颗粒为均匀对称的20面体结构，表面光滑，无囊膜，直径为26-27nm,由两个RNA片段组成，其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号分别为AY222839，AY222840）。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-ELISA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。
RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术（LAMP）的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。
侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带不显色表明检测结果为阴性。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）的检测中未见报道。
发明内容
本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸来检测罗氏沼虾野田村病毒的方法，特异性强，敏感率高。
本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合罗氏沼虾白体病的筛查与预防。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤：
病毒RNA的提取：
（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；
（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；
（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；
（4）用RNase free water（无核糖核酸酶水）洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；
RT- LAMP扩增反应：
（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段；
引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5；
（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在60℃-65℃下反应15-60min；
LFD试纸检测：
（7）取步骤（6）所得RT- LAMP扩增反应产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液，5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。
本发明的检测方法是根据GenBank公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列的保守区域设计了MrNV RT-LAMP-LDF反应系统所需引物与探针；采用本发明人配制的病毒RNA提取试剂提取MrNV病毒RNA，使用本发明建立的MrNV RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在61℃ 30min，MrNV病毒RNA获得了高效特异性扩增。同现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断与预防。
作为优选，所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA。
作为优选，所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇。
作为优选，所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。
作为优选，引物MrNV-FIP为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。
一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，包括RT- LAMP扩增反应液，16-21μL的RT- LAMP扩增反应液包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段；
引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5。
作为优选，引物MrNV-FIP为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。
作为优选，罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。
本发明的有益效果是：
1、本发明所采用引物组是根据MrNV衣壳蛋白基因的六个不同区域设计的，又有RNA的特异性探针相结合，特异性比常规PCR强。
2、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的102-103倍。
3、本发明的检测试剂盒检测时间短，可以在30-60min内获得检测结果，比常规PCR节约3-4小时。
4、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。
5、本发明中的病毒RNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质。
6、本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定，处于生产一线的技术员和养殖户都可以按步骤指导进行操作。
7、本发明的检测试剂盒对人和环境较安全，整个过程不使用有毒物质。
附图说明
图1为扩增温度对RT-LAMP反应的影响图。M：100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 61℃恒温条件下扩增结果； 泳道2：63℃恒温条件下扩增结果；泳道3: 65℃恒温条件下扩增结果。
图2为MrNV RT-LAMP特异性实验结果图。M：100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)；泳道1：罗氏沼虾野田村病毒；泳道2：南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV）；泳道3：草鱼呼肠孤病毒（GCRV）；泳道4：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）；泳道5：对虾桃拉病毒（TSV）；泳道6：阴性对照。
图3为本发明的检测方法检测感染MrNV样品实验结果图。M：100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)；左侧泳道1：MrNV样品RT-LAMP反应30min检测结果；左侧泳道2：MrNV样品RT-LAMP反应45min检测结果；NT：为阴性对照样品检测结果；右侧为LFD试纸检测显色结果。
图4为本发明的检测方法检测MrNV的灵敏度比较图和LFD试纸显色对比图。M：100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa公司)；左侧泳道1～6：模板分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍稀释的基因组RNA；泳道7：无模板；右侧1～7：为左侧实验结果的LFD试纸检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明实施如下：
一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤：
病毒RNA的提取：
（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心（12000rpm离心1-2min）。
所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA，其余为RNase free water。
（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为：将混合液转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心1-2min，弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结合。
（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。
去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入400-600μL去蛋白液，室温静置1-2min，12000rpm离心30-60s，弃掉废液。
所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇，其余为RNase free water。
漂洗液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为：向吸附柱中加入400-600μL漂洗液，12000rpm离心30-60s，弃掉废液，重复该步骤一次。
所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇，其余为RNase free water。
（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA，具体操作为：在吸附柱中加入30-50μL RNase free water（市售），室温放置1-2min，12000rpm离心1-2min。可重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。
RT- LAMP扩增反应：
（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段，其余为RNase free water。
引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5。
MrNV RT-LAMP引物、探针设计与筛选
本发明所述的引物是根据GenBank公布的RNA2序列，由在线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针。
引物MrNV-F3（SEQ ID NO：3）: GATACAACAACTATTCCATTGATTG。
引物MrNV-B3（SEQ ID NO：4）: TGTAGGATTAATTTGTGGCATG。
引物MrNV-FIP（SEQ ID NO：1）:
GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT-TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA。
引物MrNV-BIP（SEQ ID NO：2）:
AGTGGTGAAGCCATTACAAATGA-GAAAATCCACAGACCCAATC。
探针MrNV-FTIC-PROBE（SEQ ID NO：5）:
CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA。
其中MrNV-FIP为5’端生物素（biotin）标记引物；MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。
（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在60℃-65℃下反应15-60min。
LFD试纸检测：
（7）取步骤（6）所得RT- LAMP扩增反应产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液（1×TAE缓冲液），5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。
一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，包括RT- LAMP扩增反应液，16-21μL的RT- LAMP扩增反应液包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段，其余为RNase free water。
引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5。
RT- LAMP扩增反应液装于RT-LAMP核酸反应管中，RT-LAMP核酸反应管中添加有稳定液，稳定液为液体石蜡油。稳定液滴加在RT-LAMP核酸反应管中中，用于液封，稳定液用量在5-10μL。
检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。
本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的，以下以一个典型实施方案来具体说明本发明的具体操作步骤。
典型实施方案：
1、材料
感染罗氏沼虾野田村病毒的虾样采集自浙江省杭州市西湖区某养殖场；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司；逆转录酶AMV、dNTP购自promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。
2、罗氏沼虾样品病毒RNA的提取：
（1）取25mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入500μL裂解液后用一次性研磨棒研磨，等彻底匀浆后，12000rpm离心2min，吸取上清液至新的离心管；
（2）向装有上清液的新的离心管中加入等体积（与上清液等体积）的70%无水乙醇后，混合均匀；
（3）将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心1min，弃掉废液；
（4）向吸附柱中加入600μL去蛋白液，室温静置1min，12000rpm离心30s，弃掉废液；
（5）加入600μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液；重复该步骤一次。
（6）将吸附柱置于新的无RNase的离心管中，在吸附柱中加入50μL RNase free water，室温放置1min，12000rpm离心1min。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。
（7）取5μLRNA洗脱液进行10-1～10-7的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。
3、罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP恒温扩增：
（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测的预反应液：
1.6mmol/L 引物MrNV-FIP，1.6mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 硫酸铵，8mmol/L 硫酸镁，0.1% Triton X-100，0.6mol/L 甜菜碱，1.4mmol/L dNTP，1U逆转录酶AMV，8U Bst DNA 聚合酶大片段，其余为RNase free water。每管检测预反应液体积为21μL。
（2）分别吸取4μL不同浓度的待检样品RNA加入核酸检测反应管中，混合均匀。
（3）标记清楚后，将检测反应管置于61℃水浴锅中，反应30min。
4、罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP扩增产物进行凝胶电泳：
（1）配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5μL的反应产物；
（2）电泳30分钟后凝胶成像，结果见图3和图4左侧图。
5、RT-LAMP扩增产物的LFD试纸检测：
（1）取罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP扩增产物6μL，置于LFD试纸加样孔；
（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50μL缓冲液（1×TAE缓冲液），待缓冲液移动基本结束，判断RT-LAMP-LFD检测结果，见图3与图4右侧图。
利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测罗氏沼虾野田村病毒，经过凝胶电泳，由图3左侧图可见阶梯状的扩增条带；再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图3右侧图可见与电泳结果吻合。而图2特异性实验结果和图4灵敏度检测结果表明本检测方法具有较好的特异性和灵敏度。其中图1为筛选本体系最佳的反应温度，如图所示温度61℃较佳。
根据以上实验结果表明，罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒和检测方法可以为MrNV提供快速、简便、灵敏的现场检测。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒
<130> 2013.07.15
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaagaggta aaatacaccc tgtttactat actggtcaag ataaagaga 49
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtggtgaag ccattacaaa tgagaaaatc cacagaccca atc 43
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatacaacaa ctattccatt gattg 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtaggatta atttgtggca tg 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcttgcaag tgactacact acttaa 26
Claims (1)
1.一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-21μL的RT- LAMP扩增反应液包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段；
引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5；
引物MrNV-FIP为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针；
罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为罗氏沼虾野田村病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water。
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