CN104450957B - 一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种环介导等温扩增技术与核酸检测侧向层析试纸相结合快速便捷的检测家蚕核型多角体病毒的检测试剂盒及其检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域；所述检测试剂盒特征在于包括BmNPV LAMP预反应液，其中所需引物与探针根据GenBank公布的家蚕核型多角体病毒基因组序列的保守区域设计；采用所述试剂盒可有效快速检测家蚕核型多角体病毒，通过病毒DNA的提取和BmNPV LAMP反应体系的扩增步骤，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，BmNPV病毒DNA获得高效特异性扩增；本检测方法具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，适用于养殖户日常使用，有利于家蚕核型多角体病毒病的诊断与预防。

Description

一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术与核酸检测侧向层析试纸(nucleic acid detection lateral flow dipstick，LFD)相结合快速便捷的检测家蚕核型多角体病毒的检测试剂盒及其检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域。
背景技术
家蚕是重要的经济昆虫，所产蚕丝是丝绸原料的主要来源，在人类经济生活与历史文化中均具有重要的地位。然而高发的蚕病直接影响蚕茧的产量及质量，制约了养蚕业的健康和持续发展。蚕病分传染性蚕病和非传染性蚕病，以传染性蚕病危害为重。常见的传染性蚕病主要是僵病、脓病、软化病等三种。这些病的共同特点是潜伏期长、发病快、来势猛、范围广、危害性大，一般会导致减产10～20%，严重时高达80～90%，甚至颗粒无收，给蚕农带来极大的损失。而家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NuclearPolyhedrosisVirus，BmNPV）病是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类蚕病，家蚕患此病的后期常流出脓汁，内含大量的多角体病毒，俗称脓病。
目前该病毒的检测方法有电镜法、PCR检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是成本太高，不适合推广使用；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户采用。
环介导等温核酸扩增技术（LAMP）作为一种新型的核酸检测技术，主要针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶的作用下，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测目前一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。
侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，使得LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带不显色表明检测结果为阴性。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的检测中尚未见报道，因此本检测试剂盒的研发和应用，能够便于在养殖现场，快速地对家蚕病毒病进行抽检，以及蚕农能够自行针对疑似病症进行检测，有利于家蚕核型多角体病毒的预防和阻遏，降低蚕农的养殖成本和经济损失。
发明内容
本发明针对现有技术中的缺陷，目的是建立一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸来检测家蚕核型多角体病毒的检测方法，并提供一种用于以上目的的LAMP-LFD检测试剂盒。该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，适合家蚕核型多角体病毒病的筛查与预防。
本发明提供一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：BmNPV LAMP预反应液，该反应液包括：1.2-1.6mM 引物BmNPV-FIP和BmNPV-BIP，0.2-0.4mM 引物BmNPV-F3和BmNPV-B3，0.05-0.1μM 探针BmNPV-FITC-PROBE，20-40mMTris-HCl (pH8.0～9.0)，10-15mM 氯化钾，15 -20mM 硫酸铵，8-10mM 硫酸镁，0.1-0.2%Triton X-100，0.6-0.8M 甜菜碱，1.2-1.4mM dNTP，6-8U Bst DNA 聚合酶大片段；
其中，引物BmNPV-FIP序列见SEQ ID NO:1，引物BmNPV-BIP序列见SEQ ID NO:2，引物BmNPV-F3序列见SEQ ID NO:3，引物BmNPV-B3序列见SEQ ID NO:4, 探针BmNPV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO:5。
本发明所述的引物是根据NCBI公布的BmNPV基因组序列（GenBank: L33180.1），由在
线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针：
引物BmNPV-F3（SEQ ID NO:1）: CCGGCAAACAGATCGTCAA
引物BmNPV-B3（SEQ ID NO:2）: CGTCCAGTACATGGTGGC
引物BmNPV-FIP（SEQ ID NO:3）:
CAGTCGAGTCGCGTCGCTTT-TCACGGCGTTGATCAAATCG
引物BmNPV-BIP（SEQ ID NO:4）:
GGCAGAGTGGCGTGCTTGAG-ACATTCCCATTCCGTTACCG
探针BmNPV-FTIC-PROBE（SEQ ID NO:5）: TGTTGGCCAGCTGCTGATTG
其中BmNPV-FIP为5’端生物素（biotin）标记引物；BmNPV-FTIC-PROBE
为5’端FITC标记探针。
本发明所述的家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于试剂盒中还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品、阴性对照样品以及LAMP核酸反应管中添加有稳定液，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为家蚕核型多角体病毒基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water，核酸反应稳定液为液体石蜡油。
本发明还提供一种家蚕核型多角体病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用上述家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒进行检测，按照以下步骤进行：
A. 病毒DNA的提取：
（1）样品与200μL裂解液TL混匀，匀浆后高速离心，所述裂解液包括40～
60mM,pH7.4 Tris-HCL,3～6M的异硫氰酸胍，8～15mM EDTA；
（2）取步骤（1）所离心后上清，向其中加入20μL蛋白酶K溶液（20mg/ml）,
立刻振荡混匀，然后置于55℃水浴1～3小时直到组织消化完全；
（3）将消化液转移到带有玻璃纤维素膜的吸附柱AC中，吸附柱置于收集管
中，12000rpm离心1min；
（4）用漂洗液IR和去蛋白液WB洗涤上述吸附柱，所述去蛋白液含有浓度为10～50mM,pH7.4的Tris-HCL，0.4M异硫氰酸胍和30～40%无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为10～50mM,pH7.4的Tris-HCL,50～150mM NaCl和75%的无水乙醇；
（5）利用灭菌过的双蒸水洗脱所述吸附柱上吸附的DNA。
B. BmNPV LAMP反应体系的扩增
在预反应液中加入5μL DNA模板，再加入适量的DEPC水或RNase free water使反应体系总体积为25μL。然后在61℃～65℃下反应45～60min。
步骤3中所述的最适温度为61℃，最适反应时间为45min。
C. LFD试纸检测：
在扩增反应结束后，取5～10μL反应液滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50～100μL缓冲液，5～15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明反应结果为阳性。
本发明所述的LFD检测试纸，其特征是在改良胶体金技术的基础上，利用生物素（biotin）和FITC抗体等制备的侧向层析检测试纸。
与现有检测技术比较，本发明所提供的家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测方法具有以下优点：
1. 本发明所采用引物组是根据家蚕核型多角体病毒保守的核心基因的六个不同区域设计的，又有DNA的特异性探针相结合，特异性比常规PCR强；
2. 本发明的快速诊断试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的102～103倍；
3. 本发明的快速诊断试剂盒检测耗时短，单个样品可以在30～45min内获得检测结果，比常规PCR节约3～4小时；
4. 本发明的快速诊断试剂盒不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，仅需一个恒温水浴锅，甚至在条件不允许的情况下，利用温度计和热水调节也能完成该检测；
5. 本发明的检测试剂盒内容物对人和环境均是安全无害的，整个过程不使用有毒物质，不会造成环境污染和人体危害。
6. 本发明的家蚕核型多角体病毒检测试剂盒填补了目前家蚕病毒病诊断试剂盒的空白，有利于为其他家蚕病害的诊断奠定技术基础，提供借鉴。
附图说明
图1为扩增温度对LAMP反应的影响图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 57℃恒温条件下扩增结果；泳道2：59℃恒温条件下扩增结果；泳道3：61℃恒温条件下扩增结果；泳道4：63℃恒温条件下扩增结果；泳道5：65℃恒温条件下扩增结果。
图2为BmNPV-LAMP特异性实验结果图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；泳道2：家蚕浓核病毒（DNV）；泳道3：家蚕质型多角体病毒（BmCPV）；泳道4：家蚕软化病病毒(FV)；泳道5：对虾桃拉病毒（TSV）；泳道6：阴性对照。
图3为不同反应时间对BmNPV LAMP反应的影响图。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：恒温反应15min结果；泳道2：恒温反应30min结果；泳道3：恒温反应45min结果；泳道4：恒温反应60min结果；泳道5：恒温反应75min结果；泳道6：恒温反应90min结果。
图4为BmNPV LAMP-LFD方法检测BmNPV的灵敏度结果。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；左侧泳道1～8：模板分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7, 10-8倍稀释的基因组DNA；右侧1～8：为左侧实验结果的LFD试纸检测图。
图5 为常规PCR方法检测BmNPV的灵敏度结果。M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1～8：模板分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7, 10-8倍稀释的基因组DNA。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1.材料
感染家蚕核型多角体病毒的样品来源于本实验室；所用引物与探针由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司； dNTP购自promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。
2. 发病家蚕组织DNA的提取：
（1）取20mg家蚕蚕卵、血淋巴或中肠组织，加入200μL裂解液TL后用一次性研磨棒研磨，等彻底匀浆后，加入20μL蛋白酶K溶液（20mg/ml）,立刻振荡混匀，然后置于55℃水浴1～3小时直到组织消化完全；
（2）将消化液转移到吸附柱AC中，吸附柱置于收集管中，12000rpm离心1min,弃收集管中废液；
（3）向吸附柱中加入500μL去蛋白液IR， 12000rpm离心60s,弃掉废液；
（4）加入700μL漂洗液WB，12000rpm离心60s,弃掉废液；
（5）将吸附柱置于新的离心管中，在吸附柱中加入100μL RNase free water,室温放置5min，12000rpm离心1min。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加DNA洗脱量。
（6）取5μL DNA洗脱液进行10-1～10-8的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。
3. 家蚕核型多角体病毒LAMP恒温扩增：
（1）根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测反应液（1.6mM BmNPV-FIP和BmNPV-BIP,0.2mM BmNPV-F3和BmNPV-B3,0.05μM BmNPV-FITC-PROBE,20mM Tris-HCl,10mM 氯化钾, 15 mM 硫酸铵, 8mM 硫酸镁, 0.1% Triton X-100,0.6M 甜菜碱，1.4mMdNTP，8U Bst DNA 聚合酶大片段），每管检测预反应液体积为20μL；
（2）分别吸取5μL不同浓度的待检样品DNA加入核酸检测反应管中，混合均匀；
（3）标记清楚后，将检测反应管置于61℃水浴锅中，反应45min；
4. 家蚕核型多角体病毒LAMP扩增产物进行凝胶电泳：
（1）配置3%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入6μL的反应产物；
（2）电泳30分钟后凝胶成像（图4左）。
5.LAMP扩增产物的LFD试纸检测：
（1）取家蚕核型多角体病毒LAMP扩增产物8μL，置于LFD试纸加样孔；
（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加100μL缓冲液，待缓冲液移动基本结束，判断LAMP-LFD检测结果，见图4右侧图。
利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测家蚕核型多角体病毒，凝胶电泳结果表明可见阶梯状的扩增条带；再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图3右侧图可见与电泳结果吻合。而图2特异性实验结果和图4灵敏度检测结果表明本检测方法具有较好的特异性和灵敏度。与常规PCR检测方法结果（图5）相比，BmNPV LAMP-LFD检测方法的灵敏度明显优于对方，大约是常规PCR方法的103倍；此外，常规PCR反应检测单个样品至少需要3至4个小时，而LAMP-LFD反应检测单个样品最快仅需1小时左右，时效性远高于常规PCR。
根据以上实验结果表明，家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒和检测方法可以为BmNPV提供快速、简便、灵敏的现场检测，应用前景广泛。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法
<130> 一种家蚕核型多角体病毒快速检测试剂盒及检测方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccggcaaaca gatcgtcaa 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtccagtac atggtggc 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagtcgagtc gcgtcgcttt tcacggcgtt gatcaaatcg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcagagtgg cgtgcttgag acattcccat tccgttaccg 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgttggccag ctgctgattg 20

Claims (5)

1.一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
BmNPV LAMP预反应液，该反应液包括：1.2-1.6mM 引物BmNPV-FIP和BmNPV-BIP，0.2-0.4mM 引物BmNPV-F3和BmNPV-B3，0.05-0.1μM 探针BmNPV-FITC-PROBE，20-40mM 且pH为8.0～9.0的Tris-HCl，10-15mM 氯化钾，15 -20mM 硫酸铵，8-10mM 硫酸镁，0.1-0.2%Triton X-100，0.6-0.8M 甜菜碱，1.2-1.4mM dNTP，6-8U Bst DNA 聚合酶大片段；
其中，引物BmNPV-FIP序列见SEQ ID NO:1，引物BmNPV-BIP序列见SEQ ID NO:2，引物BmNPV-F3序列见SEQ ID NO:3，引物BmNPV-B3序列见SEQ ID NO:4, 探针BmNPV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO:5；
引物BmNPV-FIP为5’端生物素标记引物；探针BmNPV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。
2.根据权利要求1所述的一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒， 其特征
在于，所述试剂盒中还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品、阴性对照样品以及LAMP核酸反应管中添加有稳定液，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为家蚕核型多角体病毒基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的RNase free water，核酸反应稳定液为液体石蜡油。
3.如权利要求1所述的一种家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒的应用，其特
征在于，所述试剂盒用于非诊断目的的家蚕核型多角体病毒信息的获取。
4.一种家蚕核型多角体病毒的检测方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，采用如权利要求1所述的家蚕核型多角体病毒LAMP-LFD检测试剂盒进行，按照以下步骤进行：
A. 病毒DNA的提取：
（1）样品与裂解液TL混匀，匀浆后高速离心；
（2）取步骤（1）离心后所得上清，向其中加入20mg/mL的蛋白酶K溶液，立刻振荡混匀，然后置于55℃水浴1～3小时直到组织消化完全；
（3）将消化液转移到带有玻璃纤维素膜的吸附柱AC中，吸附柱置于收集管中，离心；
（4）用漂洗液IR和去蛋白液WB洗涤上述吸附柱；
（5）利用灭菌过的双蒸水洗脱所述吸附柱上吸附的DNA；
B．BmNPV LAMP反应体系的扩增：
在权利要求1所述试剂盒的BmNPV LAMP预反应液中加入5μL DNA模板，再加入适量的DEPC水或RNase free water使反应体系总体积为25μL，然后在61℃～65℃下反应45～60min；
C. LFD试纸检测：
在扩增反应结束后，取5～10μL反应液滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50～100μL缓冲液，5～15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。
5.根据权利要求4所述的一种家蚕核型多角体病毒的检测方法，其特征在于，步骤B
中所述的反应温度为61℃，反应时间为45min。
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