CN104593485A - 一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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CN104593485A CN201410734495.0A CN201410734495A CN104593485A CN 104593485 A CN104593485 A CN 104593485A CN 201410734495 A CN201410734495 A CN 201410734495A CN 104593485 A CN104593485 A CN 104593485A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针。所述试剂盒包括所述的引物和探针。本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的试剂盒，针对检测肺孢子虫具有灵敏度高的特性；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。

Description

一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。
背景技术
肺孢子虫(Pneumocystis)是一种呈世界性分布的机会致病性病原体，肺孢子虫最早发现于豚鼠体内。肺孢子虫作为致病性病原体，可以引起严重的肺部疾患称肺孢子虫肺炎(Pnuemocystis Pneumonia，PCP)。
现有技术中常采用环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)检测肺孢子虫，环介导恒温扩增是一种新的核酸扩增方法，采用环介导恒温扩增法检测肺孢子虫的过程，试剂容易被污染，因此，在操作时需要非常规范，即便规范操作有时也可能会引起污染，大大降低了检测的成功率。
发明内容
为了解决现有技术中检测肺孢子虫成功率低的问题，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，
所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
具体地，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。
具体地，所述引物的终浓度为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为含有1.0×107拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品2为含有1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品3为含有1.0×105拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品4为含有1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段。
具体地，，所述阳性质控品包括含浓度为1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。
具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％生理盐水。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测肺孢子虫的试剂盒，具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为LogStarting Quantity copy number，纵坐标为Threshold Cycle。
图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，Log Starting Quantity copy number为肺孢子虫起始浓度的对数值，Ct(Threshold Cycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1.一种用于肺孢子虫核酸定量检测的引物和荧光探针
本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，
用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示
用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
表1.肺孢子虫引物和探针
表1中：F：forward，正向；肺孢子虫-F表示肺孢子虫的正向引物。R：reverse，反向；肺孢子虫-R表示肺孢子虫的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；肺孢子虫-P表示肺孢子虫荧光探针，荧光探针可以为TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1的设计的引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
本发明实施例提供的引物和探针具有灵敏度高的特性，且能够准确检测出待测样品中的肺孢子虫的含量。
实施例2.一种用于检测肺孢子虫的试剂盒
本发明实施例提供了一种用于检测肺孢子虫核酸定量的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物和探针，该试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
具体地，PCR反应液包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。具体PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 2μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液5μL。
具体地，正向引物和反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM(正向引物和反向引物均为0.05-0.9μM)，探针的终浓度为0.05-0.9μM。在本实施例中，浓度为10μmol/L引物加入2.5μL，浓度为10μmol/L探针加入2.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中构成反应体系，再添加无菌水至体积为49.5μL。
具体地，核酸释放剂：Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)的终浓度为0.03％、NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)的终浓度为0.04％和pH值为8.3的终浓度为0.01M的Tris-HCL(三(羟甲基)氨基甲烷)，溶剂为无菌水。
具体地，阴性质控品为浓度为0.8％生理盐水。称量0.008g氯化钠固体溶于1ml双蒸水，混匀，直接吸取0.5μL作阴性质控品。
具体地，阳性质控品包括含浓度为1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。取含肺孢子虫液，虫株由中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，CCTCC)提供，经培养后，取含肺孢子虫液100μL加入等体积的核酸释放剂充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×106拷贝/mL，即可作为阳性质控品模板。
具体地，临界阳性质控品包括含浓度为1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因的DNA片段溶液。取含肺孢子虫液，虫株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，经培养后，取含肺孢子虫液100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×104拷贝/mL，即可作为临界阳性质控品。
具体地，工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，工作标准品1为含有1.0×107拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
工作标准品2为含有1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
工作标准品3为含有1.0×105拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4为含有1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段。
工作标准品，为含有肺孢子虫的高度保守基因的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×108拷贝/mL，于-20℃保存。贮存浓度为1.0×108拷贝/mL，使用前用无菌生理盐水或0.1mol/L PBS缓冲液(pH值为7.6)进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×107拷贝/mL，1.0×106拷贝/mL，1.0×105拷贝/mL和1.0×104拷贝/mL，使用前，经10,000rmp离心30s，取上清液作为工作标准品。本实施例提供的试剂盒成分如下：
表2.试剂盒配置(24人份/盒)：
该试剂盒可在在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，该试剂盒适用的荧光定量PCR仪包括：Roche LightCycler480、ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P和达安7000等。
用本发明实施例2提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测肺孢子虫，具体方法如下：
(1)采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品，样品可以为痰液或咽拭子，在5个经检测已知的阳性样品中有3个样品为痰液，其余2个为咽拭子，在3个经检测已知的阴性样品中有1个样品为痰液，其余2个为咽拭子。
①痰液的预处理：1)取0.5ml痰样品加入样品体积1-3倍的4％NaOH溶液，液化15min，其中NaOH溶液的加入量视痰液样品的粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2)吸出1ml液化后样品置于1.5ml离心管中，15000r/min离心5min，去上清。加800μL灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀用TE缓冲液重复洗涤2次，样品管4℃保存备用。
②咽拭子标品处理：取出采集的样品，放入装有1mL PBS缓冲液(市售试剂，pH值为7.4)的玻璃管中，充分震荡摇匀后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，加入500μl PBS缓冲液(pH值为7.4)，12,000rpm离心5min，弃上清，再加入500μl PBS缓冲液(pH值为7.4)，12,000rpm离心5min，弃上清，样品管4℃保存备用。
标品保存和运输：如果标品不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。标品长途运送应采用0℃冰壶。
(2)样品处理：取待测样品和等量体积RNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品。
(3)加样：向装有PCR反应液、引物和探针的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品各0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品或工作标准品的体积比为99：1，经5,000rpm离心10s。
(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品选Unknown。
按下面程序进行PCR扩增：
95℃3分钟；
95℃10秒，60℃1分钟(收集荧光信号)，40个循环。
(5)分析判断：
Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的扩增结果如图1所示(图1在Ct值为32时已经可以判断出样品结果)，具体检测结果见下表3。
表3为实施例2提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 24.63
2 N/A
3 N/A
4 19.38
5 26.32
6 25.78
7 24.08
8 N/A
其中，样品1，4，5，6，7在阳性范围内，为阳性样品；N/A表示阴性，样品2，3，8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知的一致，可见本发明实施例2提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％，以图1为例，在图1中将阳性样品扩增结果标出，图2-图5中的排布规律参见图1。
实施例3.一种用于检测肺孢子虫的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中肺孢子虫核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液3μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入0.25μL，浓度为10μmol/L探针加入0.25μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为10μL。
RNA提取液包括终浓度为0.15％的氯仿、终浓度为0.25％的异丙醇和终浓度为0.36％的乙醇。
表4.实施例3提供的试剂盒配置(24人份/盒)：
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μLPCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图2所示，得到具体检测结果见表5。
表5为实施例3提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 28.45
2 23.38
3 19.14
4 N/A
5 22.38
6 25.46
7 N/A
8 21.45
9 22.09
10 31.57
表5中，样品2、3、5、6、8和9在阳性范围内，为阳性样品；样品1和10在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共8个且与已知检测结果相符；样品4和7在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例3提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例4.一种用于肺孢子虫的试剂盒
本发明实施例提供了一种检测样品中肺孢子虫核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：
PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 3μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl2溶液10μL。
浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入4.5μL，浓度为10μmol/L探针加入4.5μL。
在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为45μL。
RNA提取液包括终浓度为0.3％的氯仿、终浓度为0.4％的异丙醇和终浓度为0.6％的乙醇。
其余试剂与实施例2中提供的试剂相同。
采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：
加样：向装有10μLPCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品各5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品的体积比为9：1，盖好管盖，5,000rpm离心10s。
将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图3所示，得到具体检测结果见表6。
表6为实施例4提供的样品对应的Ct值
序号 Ct值
1 25.08
2 30.45
3 26.64
4 31.47
5 N/A
6 N/A
7 22.53
8 31.04
表6中，样品1、3和7在阳性范围内，为阳性样品；样品2、4和8在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共6个且与已知检测结果相符；样品5和6在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例4提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。
实施例5.
在利用本发明实施例4提供的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样品反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还有4个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μL，按照实施例4的方法配制PCR反应体系，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×107拷贝/ml、1.0×106拷贝/ml、1.0×105拷贝/ml、1.0×104拷贝/ml及1.0×103拷贝/ml。
采用使用仪器Bio-Rad iQ5TM进行检测。
参照结果：
a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品肺孢子虫DNA含量小于检测下限；
b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品肺孢子虫DNA含量处于临界阳性范围；
c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：若样品的C(“C”表示样品浓度或含量)＜5.0000E+01，则该样品的肺孢子虫DNA总含量＜50基因拷贝；若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的肺孢子虫DNA总含量等于C基因拷贝；若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的肺孢子虫DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测，具体检测结果见表7；
表7为Ct值及其对应的起始浓度
工作标准品 Ct值 C(起始浓度)
1.0e+007 18.03 1.0e+007
1.0e+006 21.34 1.0e+006
1.0e+005 24.65 1.0e+005
1.0e+004 27.96 1.0e+004
Slope -3.31 -
Intercept 41.2 -
R2 1 -
标准方程 y＝-3.31x+41.2 -
本发明实施例5提供的样品的扩增曲线如图5所示，本发明实施例5提供的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的初始浓度如下表。
序号 Ct值 C(起始浓度)
阳性质控品 19.86 2.800e+006
临界阳性质控品 29.67 3.044e+003
阴性质控品 N/A -
1 26.08 3.700e+004
2 25.45 5.732e+004
3 34.64 0.959e+002
4 22.47 4.566e+005
5 N/A -
6 N/A -
7 N/A -
8 26.04 3.802e+004
扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.31。检测下限可精确到5.000e+002，由此可见，该试剂盒具有高灵敏度。
本发明涉及一种引起人类肺炎等疾病的病原体基因检测技术，适用于肺孢子虫定性定量检测。本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒能够精确定量，其检测方法能够快速检测肺孢子虫。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明实施例不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间。在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数(Ct值)就可以直接报告出DNA起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，
所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2.一种用于检测肺孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，
所述工作标准品1为含有1.0×107拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品2为含有1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品3为含有1.0×105拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；
所述工作标准品4为含有1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含浓度为1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0.8％生理盐水。
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