CN104745688A - 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒能够在MRSA的早期诊断出结果，为MRSA早期治疗起到至关重要的作用，同时，具有灵敏度高、检测速度快的特性。

Description

一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，硬壁菌门(Firmicutes)，革兰染色阳性。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，可有荚膜，能产生金黄色色素，能分解甘露醇，血浆凝固酶实验、乳糖发酵实验及脱氧核糖核酸酶试验阳性。青霉素的发现开创了抗生素用于感染治疗的时代，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病得到较好的控制，但随着青霉素的普遍使用，金黄色葡萄球菌表现出耐药性。之后，科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(Methicillin)。1961英国科学家Jevons首次报道分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，至今MRSA感染几乎遍及全球，已成为院内感染及社区感染的重要病原菌之一，被称为“超级细菌”。MRSA具有较高的感染率和致死率，金黄色葡萄球菌可引起一系列的化脓性感染、食物中毒及中毒性休克综合征等，其化脓性感染从小的皮肤感染病变如疖、痈到严重的感染如组织坏死、坏死性肺炎、骨髓炎和心内膜炎等。

由于抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染率逐渐上升，MRSA的治疗非常棘手，因此，早期诊断和及时有效的治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也就越发重要了。但是现有技术中并没有针对MRSA的早期诊断的方法。

发明内容

为了解决现有技术中没有针对MRSA的早期诊断的方法，本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针，其中，

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQID NO.3所示；

所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。

具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。

具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，

所述工作标准品1为1×10⁷拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品2为1×10⁶拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品3为1×10⁵拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品4为1×10⁴拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。

具体地，所述阳性质控品为1.0×10⁶拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。

具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。

具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。

具体地，所述核酸释放剂包括：无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。

具体地，所述临界阳性质控品为1.0×10⁴拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的基因片段。

具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，具有灵敏度高的特性，能够在MRSA的早期诊断出结果，为MRSA早期治疗起到至关重要的作用，同时，本发明实施例提供的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，可在MRSA的早期诊断出结果，且具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；

图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；

图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；

图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；

图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；

图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为LogStarting Quantity copy number，纵坐标为Threshold Cycle。

图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，Log Starting Quantity copy number为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因起始浓度的对数值，Ct(Threshold Cycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例1.一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因核酸定量检测的引物和荧光探针

本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针，其中，

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQID NO.1所示；

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQID NO.2所示；

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQ IDNO.3所示；

探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：

表1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因引物和探针

表1中：F：forward，正向；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因-F表示耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物。R：reverse，反向；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因-R表示耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因-P表示耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因荧光探针，荧光探针可以为TaqMan荧光探针、TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1中的引物和探针均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。

本发明实施例提供的引物和探针具有灵敏度高的特性，且能够准确检测出待测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的含量。

实施例2.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒

本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因核酸定量的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物和探针，该试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。

具体地，PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。在本实施例中，PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL、浓度为10mmol/L的dNTPs2μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液5μL。

具体地，正向引物和反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM(正向引物和反向引物均为0.05-0.9μM)，探针的终浓度为0.05-0.9μM。在本实施例中，浓度为10μmol/L引物加入2.5μL，浓度为10μmol/L探针加入2.5μL。

在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中构成反应体系，再添加无菌水至体积为49.5μL。

具体地，核酸释放剂：Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)的终浓度为0.03％、NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)的终浓度为0.04％和pH值为8.3的终浓度为0.01M的Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷)，溶剂为无菌水。

具体地，阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。称量0.008g氯化钠固体溶于1ml双蒸水，混匀，直接吸取0.5μL作阴性质控品。

具体地，阳性质控品为1.0×10⁶拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。取含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液，菌株由中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，CCTCC)提供，经培养后，取含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因液100μL加入等体积的核酸释放剂充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×10⁶拷贝/mL，即可作为阳性质控品模板。

具体地，临界阳性质控品为1.0×10⁴拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的DNA片段溶液。取含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因液，菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，经培养后，取含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因液100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，再离心5min，12000rpm，取上清液用分光光度计测A260定量，然后稀释至1.0×10⁴拷贝/mL，即可作为临界阳性质控品。

具体地，工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，工作标准品1为1.0×10⁷拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的非传染性DNA片段；

工作标准品2为1.0×10⁶拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的非传染性DNA片段；

工作标准品3为1.0×10⁵拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的非传染性DNA片段；

工作标准品4为1.0×10⁴拷贝/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的非传染性DNA片段。

工作标准品，为含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的高度保守基因的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁸拷贝/mL，于-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁸拷贝/mL，使用前用无菌生理盐水或0.1mol/L PBS缓冲液(pH值为7.6)进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×10⁷拷贝/mL，1.0×106拷贝/mL，1.0×10⁵拷贝/mL和1.0×10⁴拷贝/mL，使用前，经10,000rmp离心30s，取上清液作为工作标准品。本实施例提供的试剂盒成分如下：

表2.试剂盒配置(24人份/盒)：

该试剂盒可在-10℃±5℃避光储存，避免反复冻融，该试剂盒适用的荧光定量PCR仪包括：Roche LightCycler480、ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P和达安7000等。

用本发明实施例2提供的试剂盒在Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪上检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因，具体方法如下：

(1)采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中5个为经检测已知的阳性样品，3个为经检测已知的阴性样品，样品可以为痰液或咽拭子，在5个经检测已知的阳性样品中有3个样品为痰液，其余2个为咽拭子，在3个经检测已知的阴性样品中有1个样品为痰液，其余2个为咽拭子。

①痰液的预处理：1)取0.5ml痰样品加入样品体积1-3倍的4％NaOH溶液，液化15min，其中NaOH溶液的加入量视痰液样品的粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2)吸出1ml液化后样品置于1.5ml离心管中，15000r/min离心5min，去上清。加800μL灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀用TE缓冲液重复洗涤2次，样品于4℃保存备用。

②咽拭子样品处理：取出采集的样品，放入装有1mL PBS缓冲液(市售试剂，pH值为7.4)的玻璃管中，充分震荡摇匀后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清，加入500μl PBS缓冲液(pH值为7.4)，12,000rpm离心5min，弃上清，再加入500μl PBS缓冲液(pH值为7.4)，12,000rpm离心5min，弃上清，样品于4℃保存备用。

样品保存和运输：如果样品不立即测试，应储存于-20℃，避免反复冻融。样品长途运送应采用0℃冰壶。

(2)样品处理：取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品。

(3)加样：向装有PCR反应液、引物和探针的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品各0.5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品或工作标准品的体积比为99：1，经5,000rpm离心10s。

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品选及临界阳性质控品选Unknown。

按下面程序进行PCR扩增：

95℃3分钟；

95℃10秒，60℃1分钟(收集荧光信号)，40个循环。

(5)分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于等于28且小于等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的扩增结果如图1所示(图1在Ct值为32时已经可以判断出样品结果)，具体检测结果见下表3。

表3 为实施例2提供的样品对应的Ct值

序号	Ct值
		1	24.63
2	N/A
		3	N/A
4	19.38
		5	26.32
6	25.78
		7	24.08
8	N/A

其中，样品1，4，5，6，7在阳性范围内，为阳性样品；N/A表示阴性，样品2，3，8在阴性范围内，为阴性样品，结果与已知的一致，可见本发明实施例2提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％，以图1为例，在图1中将阳性样品扩增结果标出，图2-图5中的排布规律参见图1。

实施例3.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒

本发明实施例提供了一种检测样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：

PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.1μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液3μL。

浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入0.25μL，浓度为10μmol/L探针加入0.25μL。

在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为10μL。

DNA提取液包括终浓度为0.15％的氯仿、终浓度为0.25％的异丙醇和终浓度为0.36％的乙醇。

表4.实施例3提供的试剂盒配置(24人份/盒)：

采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中8个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：

加样：向装有10μLPCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品40μL，盖好管盖，5,000rpm离心10s。

将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图2所示，得到具体检测结果见表5。

表5 为实施例3提供的样品对应的Ct值

序号	Ct值
		1	31.67
2	25.46
		3	18.24
4	N/A
		5	22.38
6	24.38
		7	N/A
8	23.45
		9	21.09
10	28.45

表5中，样品2、3、5、6、8和9在阳性范围内，为阳性样品；样品1和10在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共8个且与已知检测结果相符；样品4和7在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例3提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。

实施例4.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒

本发明实施例提供了一种检测样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因核酸的试剂盒，该试剂盒的成分与实施例2中提供的试剂盒中的成分区别在于：

PCR反应液的各组分含量的配比为：浓度为5U/μL的Taq酶0.5μL、浓度为10mmol/L的dNTPs 3μL、10×PCR Buffer 5μL和浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液10μL。

浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各加入4.5μL，浓度为10μmol/L探针加入4.5μL。

在实际应用过程中，可以将引物和探针一同加入PCR反应液中，再添加无菌水至体积为45μL。

DNA提取液包括终浓度为0.3％的氯仿、终浓度为0.4％的异丙醇和终浓度为0.6％的乙醇。

其余试剂与实施例2中提供的试剂相同。

采集样品：样品均来源于武汉市传染病医院，其中6个为经检测已知的阳性样品，2个为经检测已知的阴性样品。其他步骤参见实施例2，区别在于：

加样：向装有10μL PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品各5μL，PCR反应液与处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品的体积比为9：1，盖好管盖，5,000rpm离心10s。

将上述10个样品按照实施例2中的步骤进行操作，本发明实施例提供的扩增结果如图3所示，得到具体检测结果见表6。

表6 为实施例4提供的样品对应的Ct值

序号	Ct值
		1	24.21
2	30.37
		3	31.44
4	31.54
		5	N/A
6	N/A
		7	25.53
8	26.64

表6中，样品1、7和8在阳性范围内，为阳性样品；样品2、3和4在临界阳性范围内，为临界阳性样品，阳性样品共6个且与已知检测结果相符；样品5和6在阴性范围内，为阴性样品，与已知检测结果相符，可见本发明实施例4提供的试剂盒特异性为100％，阳性检出率为100％。

实施例5.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒

在利用本发明实施例4提供的试剂盒进行定量检测时，需绘制标准曲线，除8个样品反应管外，另取3个反应管分别为阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还有4个反应管，对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5μL，按照实施例4的方法配制PCR反应体系，5000rpm离心10s，然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工作标准品选Standard。对于Standard，需要在Quantity栏中分别输入1.0×10⁷拷贝/ml、1.0×10⁶拷贝/ml、1.0×10⁵拷贝/ml、1.0×10⁴拷贝/ml及1.0×10³拷贝/ml。

采用使用仪器Bio-Rad iQ5TM进行检测。

参照结果：

a.如果扩增曲线不呈S型或Ct值＞32，判定样品耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因DNA含量小于检测下限；

b.如果扩增曲线S型不明显或28≤Ct值≤32，则样品耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因DNA含量处于临界阳性范围；

c.如果扩增曲线呈S型且Ct值﹤28，则按以下方法进行定量：若样品的C(“C”表示样品浓度或含量)＜5.0000E+01，则该样品的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因DNA总含量＜50基因拷贝；若样品的5.0000E+01≤C≤5.0000E+07，则该样品的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因DNA总含量等于C基因拷贝；若样品的C＞5.0000E+07，则该样品的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因DNA总含量＞5.0000E+07基因拷贝，将样品稀释至线性范围内再检测，具体检测结果见表7；

表7 为Ct值及其对应的起始浓度

工作标准品	Ct值	C(起始浓度)
			1.0e+007	18.43	1.0e+007
1.0e+006	21.73	1.0e+006
			1.0e+005	25.03	1.0e+005
1.0e+004	28.33	1.0e+004
			Slope	-3.3	-
Intercept	41.53	-
			R2	1	-
标准方程	y＝-3.3x+41.53	-

本发明实施例5提供的样品的扩增曲线如图5所示，本发明实施例5提供的工作标准品和8个样品在一起检测，根据扩增后得到的Ct值，查图6的标准曲线，再经换算，最终得到8个样品的初始浓度如下表。

序号	Ct值	C(起始浓度)
			阳性质控品	19.16	6.009e+006
临界阳性质控品	29.36	4.874e+003
			阴性质控品	N/A	-
1	26.18	4.482e+004
			2	25.35	7.999e+004
3	34.54	1.313e+002
			4	22.37	6.398e+005
5	N/A	-
			6	N/A	-
7	N/A	-
			8	26.24	4.299e+004

扩增曲线均呈光滑″S″型，标准曲线为一条直线，Ct值在14-28之间，每个浓度梯度的Ct值差约为3.31。检测下限可精确到5.000e+002，由此可见，该试剂盒具有高灵敏度。

本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针能够在MRSA的早期诊断出结果，为MRSA早期治疗起到至关重要的作用，本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒可在MRSA的早期诊断出结果并能够精确定量，该试剂盒能够快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因。实时TaqMan荧光定量PCR通过序列特异性TaqMan荧光探针以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而可以增加特异性和降低交叉污染的可能性。另外，本发明实施例不需要进一步的下游分析，节约了凝胶电泳观察结果的时间，整个检测过程共仅需2～3小时。在实时TaqMan荧光定量PCR中，PCR产物累积的每个循环都被实时监控和分析，分析达到荧光阈值的循环数(Ct值)就可以直接报告出DNA起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针，其中，

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQID NO.3所示；

所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

2.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，

所述工作标准品1为1×10⁷拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品2为1×10⁶拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品3为1×10⁵拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段；

所述工作标准品4为1×10⁴拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0×10⁶拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括：无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。

9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0×10⁴拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的基因片段。

10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0.8％的生理盐水。