CN102329886A - MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法。所述的MRSA中QacA基因携带情况的检测引物，其特征在于，包括：QacA基因正向引物：5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；QacA基因反向引物：5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。所述的检测方法为：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacA基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacA序列，构建携带QacA基因的重组质粒为阳性对照品；进行PCR反应。本发明检测率高、可重复性强。

Description

MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法

技术领域

 本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒剂QacA基因携带情况的检测引物及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌的qac 转运系统属于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS) ，由QacA 和qacR 基因构成，由质粒编码，QacA 是多药转运蛋白，因介导对亲脂性消毒剂季胺类化合物(quaternary ammonium compounds，Qac) 外排而命名；QacR 是188 个氨基酸的多药结合蛋白，属TerR 类转录抑制蛋白。无诱导底物时，QacR 结合在QacA 启动子下游的假回文序列( IR1) 上，抑制QacA 的转录。因为该假回文序列(IR1) 与转录起始位点重叠， 所以推测QacR 通过结合IR1结构而阻止RNA 聚合酶2启动子复合体形成有效的转录状态而抑制QacA 的转录，并不是通过阻止RNA 聚合酶的结合。QacA基因表达多种化合物外排泵蛋白，细菌获得QacA基因可表现为对胺类(如苯扎溴铵) 、胍类(如氯己定) 、腙类消毒剂耐药，由此在医学领域带来了极大的危险因素。

目前检测QacA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。

发明内容

本发明的目的是提供耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒剂QacA基因携带情况的PCR检测引物及检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一组MRSA中QacA基因携带情况的检测引物，其特征在于，包括：

QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。

本发明还提供了一种MRSA中QacA基因携带情况的检测方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacA基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacA序列，构建携带QacA基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5～15umol/L 的QacA基因正向引物溶液，浓度为5～15umol/L 的QacA基因反向引物溶液以及浓度为5～15umol/L 的QacA基因检测探针溶液，其中，引物和探针序列如下：

 QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′；

QacA基因探针：FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ；

    第三步：在每一个PCR反应孔中加入PCR Master Mix 10～15ul，第二步所得的QacA基因正向引物溶液0.1～1ul，QacA基因反向引物溶液0.1～1ul，QacA基因检测探针溶液0.1～1ul，第一步所得的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0.1～1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40～60℃保温1～3分钟，80～100℃保温1～3分钟，再运行30～50个循环，每个循环包括在80～100℃保温10～20秒再在50～70℃保温0.5～1.5分钟；

    第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacA基因。

本发明是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中是否还有耐消毒剂QacA基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中QacA基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。

本发明检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。

附图说明

图1为携带QacA基因的阳性对照品的Realtime PCR曲线图；

图2为Realtime PCR阴性对照品的Realtime PCR曲线图；

图3为携带QacA基因检测样品的Realtime PCR曲线图；

图4为QacA基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为QacA基因检测样品的测序图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、常规方法制备一组MRSA中QacA基因携带情况的检测引物，包括：

QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。

2、一种MRSA中QacA基因携带情况的检测方法，具体步骤为：

（1）取经培养后鉴定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒（深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002）提取样本DNA，稀释至30ul（浓度10ng/ul），置-20℃保存，待用；将标准金黄色葡萄球菌株（保藏编号：ATCC Number: 43300），高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒（深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002）提取样本DNA，稀释至30ul（浓度10ng/ul），作为阴性对照品；人工合成QacA序列（由上海生工合成），构建携带QacA基因的重组质粒，稀释至30ul（浓度10ng/ul），为阳性对照品。

（2）根据QacA基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物及Taqman探针，探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料（由上海生工合成），用无菌水配制浓度为10umol/L 的QacA基因正向引物溶液，浓度为10umol/L 的QacA基因反向引物溶液以及浓度为10umol/L 的QacA基因检测探针溶液，其中，引物和探针序列如下：

QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′；

QacA基因探针：FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ；

（3）在每一个PCR反应孔中加入PCR Master Mix（Applied Biosystems公司生产的Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA 聚合酶） 12.5ul， QacA基因正向引物溶液0.5ul，QacA基因反向引物溶液0.5ul，QacA基因检测探针溶液0.5ul，第一步所得的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0.5ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50℃保温2分钟，95℃保温2分钟，再运行40个循环，每个循环包括在95℃保温15秒再在60℃保温1分钟；

（4）用软件SDS2.2进行结果分析，如图1所示，阳性对照品的Realtime PCR曲线呈S形，如图2所示，阴性对照品的Realtime PCR曲线为非S形，如图3所示，检测样品的Realtime PCR曲线呈S形，判断为携带QacA基因菌株。

携带QacA基因菌株可使多种消毒剂如吖啶黄、氯化苯甲烷铵、氯化苄乙氧铵等的MIC值几倍或几十倍的升高，对消毒剂表现为耐受。

利用本发明对超过100例MRSA样本的检测结果显示，根据上述方法进行的QacA基因携带情况检出率可达99%以上，可重复性达到100%。而琼脂糖凝胶电泳法的检出率只有75%（如图4所示）；上述方法与直接测序法相比，结果一致性可达到99.5%以上（如图5所示）。

<110>上海中优医药高科技有限公司

<120>MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法

 

<160> 4

 

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213>金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

 

<220>

<221>gene

 

<400> 1

atgatttcat tttttacaaa aactactgat atgatgacat caaaaaaaag atggactgca 60

ctagtagtat tagctgttag tttgtttgtt gttacaatgg atatgacaat attaattatg 120

gctttaccgg aattagtaag agagttagag ccttctggta cccaacagtt atggatagtt 180

gatatatact ctcttgtttt agctggcttt ataattccat tgagtgcctt tgctgataaa 240

tggggaagaa aaaaagcatt attaactgga tttgctttat ttggcctcgt ttcattagct 300

atatttttcg cagaaagtgc agagttcgta atagctattc gatttttact tggtattgca 360

ggtgctttaa taatgccaac tactctttca atgataagag taatttttga aaaccctaaa 420

gaaagggcca ctgcattagc tgtatggtca atcgcttcat cgataggtgc tgtttttgga 480

ccaattatcg gaggagcttt acttgagcaa ttttcatggc actcggcatt tttaattaat 540

gtaccgtttg cgataatagc agttgtagca ggtttatttt tattaccaga gtctaagtta 600

tcaaaagaaa agtctcactc gtgggatatt ccttctacaa ttttatcaat tgcaggcatg 660

attggactgg tatggagtat caaagaattt tcaaaagaag gactagcaga tattattcca 720

tgggttgtaa tagtattagc aattaccatg atagtgatat ttgttaaacg taatttatca 780

agttctgatc caatgttaga cgtaagactt tttaaaaaga gatcattttc agctggtaca 840

attgctgcat ttatgacaat gtttgcaatg gcatctgttt tgttattagc ttcacaatgg 900

ttacaggttg tggaagaact ttctcctttt aaagctggct tatacctatt acctatggca 960

ataggagata tggtgtttgc accaattgca cccggattag cggcgcgatt tggaccgaaa 1020

atagtgttac cttccggaat tggaattgca gccattggca tgtttattat gtatttcttt 1080

ggtcatccat tatcatattc tacaatggct ttagcattaa ttttagttgg agctggtatg 1140

gcttcactag cagttgcatc tgctctaata atgttagaaa cacctacatc aaaagcaggt 1200

aatgcagctg ctgttgaaga gtctatgtat gaccttggaa atgtttttgg tgtagcagta 1260

cttggtagcc tatcttctat gctttatcgt gtatttttag atatttcatc tttttcatca 1320

aaaggtatag ttggagattt agctcatgta gctgaagaat ctgtagtggg cgctgtcgaa 1380

gtagctaaag ctacggggat aaaacagctt gcaaacgagg ctgtaacatc atttaatgat 1440

gcttttgtag caactgcttt agtaggtggg attatcatga ttatcatttc aatagttgtc 1500

tatttgttaa ttcccaaatc acttgatata actaaacaaa aatag  1545

 

<210>2

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于qacA基因序列扩增的正向引物。

 

<400>2

ggttgtggaa gaactttctc ctt 23

 

<210>3

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>用于qacA基因序列扩增的反向引物。

 

<400>3

ccaattccgg aaggtaacac 20

 

<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223> 含有FAM荧光的探针，用于与qacA基因结合。

 

<400>4

ccaattccgg aaggtaacac 20

Claims (2)

1.一组MRSA中QacA基因携带情况的检测引物，其特征在于，包括：

QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。

2.一种MRSA中QacA基因携带情况的检测方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacA基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacA序列，构建携带QacA基因的重组质粒为阳性对照品；

第二步：用无菌水配制浓度为5～15umol/L 的QacA基因正向引物溶液，浓度为5～15umol/L 的QacA基因反向引物溶液以及浓度为5～15umol/L 的QacA基因检测探针溶液，其中，引物和探针序列如下：

 QacA基因正向引物： 5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物： 5′-ccaattccggaaggtaacac-3′；

QacA基因探针：FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ；

    第三步：在每一个PCR反应孔中加入PCR Master Mix 10～15ul，第二步所得的QacA基因正向引物溶液0.1～1ul，QacA基因反向引物溶液0.1～1ul，QacA基因检测探针溶液0.1～1ul，第一步所得的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0.1～1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40～60℃保温1～3分钟，80～100℃保温1～3分钟，再运行30～50个循环，每个循环包括在80～100℃保温10～20秒再在50～70℃保温0.5～1.5分钟；

    第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacA基因。

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