CN102534029A - MRSA中QacB基因的检测引物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组MRSA中QacB基因的检测引物及使用该引物的检测方法。所述的MRSA中QacB基因的检测引物其特征在于，包括：QacB基因正向引物：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’；QacB基因反向引物：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’。检测方法为：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株作为检测样品，取不携带QacB基因的金黄色葡萄球菌菌株作为阴性对照品，分别高温灭活，提取样本DNA；人工合成QacB序列，构建携带QacB基因的重组质粒为阳性对照品；分别进行PCR反应。本发明检测率高、可重复性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒剂QacB基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
随着抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性越来越严重，并出现了多重耐药株。研究发现，多重耐药菌株中的主动外排系统能够显著降低细胞内抗菌药物的浓度，同时由于主动外排系统转运底物的广泛性，使细菌呈现对多种化学结构完全不同的抗菌药物高度耐药。进一步研究表明，细菌的主动外排是导致细菌产生多重耐药的主要原因。研究认为MRSA的耐药可能跟细菌获得主动外排基因有关，现已发现MRSA中存在多种主动外排系统。Markham等早在1996年就推测外排系统在MRSA多重耐药机制中发挥重要作用。金黄色葡萄球菌还存在qac，smr等多种外排系统。Qac基因家族中发现有QacA，QacB，QacC，QacD，QacE等基因。细菌获得Qac基因可表现对胺类、胍类、腙类消毒剂也耐药。在Qac家族中，除对消毒剂耐药外，对多种抗菌药物存在高耐药率。
早在20世纪50年代，国外学者就已经从澳大利亚的一家医院临床分离的金葡菌中提到携带QacB基因的质粒pSK156，这是最早分离到的已知编码外排泵蛋白的质粒。此后，80年代时又在金属离子高度耐药的质粒pSK23中也发现存在QacB。基因测序和诱变试验研究表明，与qacA基因相比，两者之间仅仅7个碱基和第十个跨膜片段323位的氨基酸不同，QacA为天冬氨酸，QacB为丙氨酸，因此不能用PCR和Southernblot的检测方法对它们进行鉴别。这种差异被认为是由于临床上长期应用二价化疗药物而诱导形成的。现在发现，与QacA不同的是，QacB仅对单价阳离子化合物耐药，对少数的二价阳离子化合物呈低度耐药。
目前检测QacB基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。
发明内容
本发明的目的是提供耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒剂QacB基因携带情况的PCR检测引物及使用该引物的检测方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一组MRSA中QacB基因的检测引物，其特征在于，包括：
(A).QacB基因正向引物：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’；
(B).QacB基因反向引物：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’。
本发明还提供了一种MRSA中QacB基因的检测方法，其特征在于，采用上述MRSA中QacB基因的检测引物，具体步骤为：
第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacB基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacB序列，构建携带QacB基因的重组质粒为阳性对照品；
第二步：用无菌水分别配制浓度为5-15umol/L的QacB基因正向引物溶液、浓度为5-15umol/L的QacB基因反向引物溶液及浓度为5-15umol/L的QacB基因检测探针溶液；QacB基因正向引物的序列为：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’，QacB基因反向引物的序列为：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’，QacB基因检测探针的序列为：FAM-gagctatggtgtttgc-MGBNFQ；
第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的QacB基因正向引物溶液0.1-1ul、QacB基因反向引物溶液0.1-1ul、QacB基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，然后运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；
第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacB基因。
本发明是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中是否还有耐消毒剂QacB基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中QacB基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。
本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品，使结果判读更直观。
附图说明
图1为携带QacB基因的阳性对照品的Realtime PCR曲线图；
图2为Realtime PCR阴性对照品的Realtime PCR曲线图；
图3为携带QacB基因检测样品的Realtime PCR曲线图；
图4为QacB基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；
图5为QacB基因检测样品的测序图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例
1、采用固相亚磷酰胺三酯法制备一组用于检测MRSA中QacB基因携带情况的引物，包括：
QacB基因正向引物：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’；
QacB基因反向引物：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’。
2、检测方法：
(1)取经培养后鉴定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，置-20℃下保存，待用；将标准金黄色葡萄球菌株(保藏单位：中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：
Number：43300)，高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，作为阴性对照品；人工合成QacB序列(由上海生工合成)，构建携带QacB基因的重组质粒，稀释至30ul(浓度10ng/ul)，为阳性对照品。
(2)根据QacB基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物及Taqman探针，探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料(由上海生工合成)，用无菌水配制浓度为10umol/L的QacB基因正向引物溶液，浓度为10umol/L的QacB基因反向引物溶液以及浓度为10umol/L的QacB基因检测探针溶液，其中，引物和检测探针序列如下：
QacB基因正向引物：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’；
QacB基因反向引物：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’；
QacB基因检测探针：FAM-gagctatggtgtttgc-MGBNFQ。
(3)在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix(Applied Biosystems公司生产的Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶)12.5ul，QacB基因正向引物溶液0.5ul，QacB基因反向引物溶液0.5ul，QacB基因检测探针溶液0.5ul。然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤(1)得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各0.5ul，最后用灭菌重蒸馏水补足25ul。在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50℃保温2分钟，95℃保温2分钟，然后运行40个循环，每个循环包括在95℃保温15秒，再在60℃保温1分钟。
(4)用软件SDS2.2进行结果分析，如图1所示，为阳性对照品的Realtime PCR曲线，呈S形。如图2所示，为阴性对照品的Realtime PCR曲线，为非S形。如图3所示，为检测样品的Realtime PCR曲线，呈S形。得出判断，该样品为携带QacB基因菌株。
利用本发明对超过100例MRSA样本的检测结果显示，根据上述方法进行的QacB基因携带情况检出率可达99％以上，可重复性达到100％。而琼脂糖凝胶电泳法的检出率约75％，如图4所示，为QacB基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；本发明与直接测序法相比，结果一致性可达到99.5％以上，如图5所示，为QacB基因检测样品的测序图。
Claims (2)
1.MRSA中QacB基因的检测引物，其特征在于，包括：
(A).QacB基因正向引物：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’；
(B).QacB基因反向引物：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’。
2.一种MRSA中QacB基因的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的MRSA中QacB基因的检测引物，具体步骤为：
第一步：取经培养后鉴定为MRSA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带QacB基因的金黄色葡萄球菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成QacB序列，构建携带QacB基因的重组质粒为阳性对照品；
第二步：用无菌水分别配制浓度为5-15umol/L的QacB基因正向引物溶液、浓度为5-15umol/L的QacB基因反向引物溶液及浓度为5-15umol/L的QacB基因检测探针溶液；QacB基因正向引物的序列为：5’-ggttgtggaagaactttctcctt-3’，QacB基因反向引物的序列为：5’-tccaattccggaaggtaaca-3’，QacB基因检测探针的序列为：FAM-gagctatggtgtttgc-MGBNFQ；
第三步：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10-15ul和第二步得到的QacB基因正向引物溶液0.1-1ul、QacB基因反向引物溶液0.1-1ul、QacB基因检测探针溶液0.1-1ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品各0.1-1ul，用灭菌重蒸馏水补足25ul；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60℃保温1-3分钟，80-100℃保温1-3分钟，然后运行30-50个循环，每个循环包括在80-100℃保温10-20秒，再在50-70℃保温0.5-1.5分钟；
第四步：用软件SDS2.2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带QacB基因。
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|---|---|---|---|---|
| CN87104581A (zh) * | 1986-12-24 | 1988-09-21 | 遗传学系统公司 | 抗铜绿假单胞菌鞭毛的单克隆抗体 |
| CN1112356A (zh) * | 1993-06-07 | 1995-11-22 | 第一制糖株式会社 | 新型的减毒铜绿假单胞菌菌株 |
| CN102329886A (zh) * | 2011-11-01 | 2012-01-25 | 上海中优医药高科技有限公司 | MRSA中QacA基因携带情况的检测引物及检测方法 |
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