CN87104581A - 抗铜绿假单胞菌鞭毛的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分泌能与所选铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白结合的单克隆抗体的细胞株。已经发现其中的一些抗体可以消除铜绿假单胞菌的致死性威胁。含有这些抗体的药用组合物，它还可以结合有另外的单克隆抗体，血浆组分及抗菌剂。还包括将这种组合物用于预防和治疗感染。

Description

本申请是1986年12月24日提交的美国专利序列号946554的部分继续申请，而946554号是在1986年7月3日提交的美国专利序列号881984的部分继续申请，这两份申请都通过在此引述而合并于本申请中。

本发明涉及用免疫技术提供用于诊断和治疗细菌感染的新物质，具体而言，是生产和应用能识别铜绿假单胞菌（Pseudomonas    aeruginosa）鞭毛的单克隆抗体。

革兰氏阴性疾病及其大多数的严重并发症，如败血症和内毒素血症，是人类患者严重发病和死亡的原因。革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌更是如此，在过去的五十年中，它与细菌感染，特别是医院感染的伴随日渐增长。

在过去的几十年中，抗菌素被选来控制革兰氏阴性疾病。但是，革兰氏阴性细菌疾病的高发病率以及高死亡率表明抗菌素的治疗作用是有限制的，对铜绿假单胞菌更是如此。[参见：Andriole，V，G.“Pseudomonas    Bacteremia：Can    Antibiotic    Therapy    Improve    Survival？”，J.Lab.Clin.Med.（1978）94：196-199]这就促进了寻找另外的预防和治疗方法。

已被研究的一种方法是用主动或被动免疫使宿主的免疫系统得到增强的方法。例如，已经观察到的是，利用铜绿假单胞菌的全细菌疫苗或其纯化的细菌性内毒素对人或实验动物进行主动免疫，则导致产生一种特异性的调理抗体，该抗体主要抵抗铜绿假单胞菌外层细胞膜上脂多糖（LPS）的重复寡糖的决定族[见Pollack，M.，Immunoglobulins：Characteristics    and    Uses    of    Intravenous    Preparations，Alving，B.M.，and    Finlayson，J.S.des.，pp.73-79，U.S.Department    of    Healthy    and    Human    Servises，1979]。这些抗体，不论是主动产生的或是被动输入的，均在各种实验动物中显示出抵抗由铜绿假单胞菌引起的致死效应（Pollack，同上），而且在某些对人的初步试验中也是如此（见Young，L.S.and    Pollack，M.，Pseudomonas    aeruginosa，Sabath，L.，ed.，pp    119-112，Hans    Huber，1980）。

上述报道提出，免疫治疗方法可以用来预防和治疗由铜绿假单胞菌引起的细菌性疾病，如施用被收集来的那些含抗侵染菌的抗体的人免疫球蛋白。此处所说的免疫球蛋白指的是人血浆中富含抗体的部分或组分，其中的代表是抗铜绿假单胞菌的特异性抗体。然而，由于在使用人免疫球蛋白成分时所遇到的种种限制，因而使用这种方法治疗由铜绿假单胞菌引起的疾病仍处于研究探索阶段[见Collins，M.S.and    Roby，R.E.Am.J.Med.，76（3a）：168-174，（1984）]，而且目前也没有这些成分的市售商品可用。

与免疫球蛋白组分相关的一种限制是，它们收集自成千上万的供血者的样品中，这些样品预先对是否存在抗铜绿假单胞菌抗体进行了筛选。这种收集方式导致各个抗体效价被平均化，这样就至多使所需抗体的最终效价得到有限的提高。

另一个限制是，这种通过预先筛选的方式使要保证产物的一致性就必须广泛地，连续地筛选供者。尽管做了上述各种努力，但免疫球蛋白在每一批之间，以及在各不同地理区域内得到的产物之间均仍有相当大的差异。

免疫球蛋白组合物所固有的另一限制是在使用的同时也带有大量外源蛋白性物质（它可能包括病毒，如那些近来被发现与获得性免疫缺乏综合症相关的病毒），可能会引起生物学副作用。所需抗体的低效价与大量外源物质相结合，经常使特异性被限制在最适水平以下，因而也限制了给患者施用免疫球蛋白的效益。

1975年，Kohler和Milstein报道了他们的初期发现，即某些鼠细胞株可与鼠脾细胞融合而产生杂交瘤，杂交瘤能产生单一特异性的抗体，也就是单克隆抗体[Kohler，G.，and    Milstein，C.，Nature，256：495-497（1975）]。自从这项技术出现以来，在某些情况下，就使得大量生产对特殊决定簇或抗原上的决定簇具有专门特异性的鼠抗体成为可能。随后应用以后发展起来的技术，使生产人单克隆抗体也成为可能（见美国专利第4464465号，该文通过在此引述而合并于本文）。

应当承认的是，在某些情况下，鼠单克隆抗体或这些抗体的组合物在用于人类时会产生一些问题。例如，已经报道说，在用鼠单克隆抗体治疗某些人类疾病的试验研究中会激发使它们无效的免疫应答[Levy，R.L.，and    Miller，R.A.，Ann.Rev.Med，34：107-116（1983）]。然而，随着重组DNA技术的最近发展，如生产鼠/人嵌合单克隆抗体，这些问题可被排除。此外，现在已经有了生产人单克隆抗体的方法[见Human    Hybridomas    and    Monoclonal    Antibodies，Engleman，E.G.，et    al.，eds.，Plenum    Publishing    Corp.（1985），通过在此引述将该文合并于本文]。

在用杂交瘤和（或）细胞转化技术生产抗铜绿假单胞菌侵染的单克隆抗体方面已经有了一些报道。已经被生产出的单克隆抗体与铜绿假单胞菌的各种抗原决定簇起反应，包括单一的和多种血清型特异性表面抗原决定簇，如在细菌的LPS分子中发现的那些（见序列号为734    624和807394的未决美国专利申请，通过在此引述将这两份文献合并于本文）。对铜绿假单胞菌内毒素A为特异性的保护性单克隆抗体也被生产出来[见序列号为742170的美国专利申请，通过在此引述将该文合并于本文]。

虽然使用对铜绿假单胞菌LPS区或其细菌性内毒素为特异性的单克隆抗体在某些情况下能提供足够的保护，但通常应提供更宽的保护。例如，隆抗体在某些情况下能提供足够的保护，但通常应提供更宽的保护。例如，在预防人类潜在的侵染时，则以使用抗多种铜绿假单胞菌的一种抗体或众多抗体为更好。同样，在治疗时，如果不知道侵染菌的血清型，则以使用抗大多数（如果不是全部的话）在医学上为重要的铜绿假单胞菌血清型的抗体或多种抗体相结合为更好，理想的是提供与传统血清图谱中各类均有交叉反应的抗体。

已经显示出对生物体致病有关的铜绿假单胞菌生理学上的一个方面是其游动性，这种能力主要是因为有鞭毛存在[见Montie，T.，et    al.（1982）Infect，and    Immun.，38：1296-1298]。铜绿假单胞菌的特征是在杆状结构的一端有一根鞭毛。对灼伤小鼠研究显示出，当给实验灼伤的小鼠接种非游动性铜绿假单胞菌时，存活小鼠的百分比要大大高于接种游动性铜绿假单胞菌的小鼠[Mc    Manus，A.，et    al.，（1980），Burns，6：235-239    and    Mentie，T.，et    al.（1982），Infect.and    Immun.，38：1    J96-1298]。其他对铜绿假单胞菌致病机理的研究已经宣称，用鞭毛抗原制剂免疫过的动物当被灼伤并感染以游动细菌时则受到了防护[见Holder，I.，et    al.（1982），Infect.and    Immun.，35：276-280]。

重要的是，已用血清学的方法对铜绿假单胞菌的鞭毛进行了研究，并且报道说主要属于两个抗原组，即由B.Lanyi确定的H1和H2组[见1970，Acta    Microbiol.Acad.Sci，Hung.，17：35-48]，由Ansorg，R.确定的a型和b型[见1978，Zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A，242-238]。这两者的实验室对鞭毛的血清学定型均表明H1鞭毛[Lanyi，同上]或b型鞭毛[Ansorg，R.，同上]在血清学上是一致的，即还没有发现亚型。这种血清学上一致的鞭毛被称作b型。另一主要抗原H2[Lanyi，同上]或a型鞭毛[Ansorg，R.，同上]含有5个亚型。这种抗原被称作a型鞭毛，5个亚型分别称作a，a，a，a，a。在a型铜绿假单胞菌各不同菌株上所带的亚型显示出不同的组合，但抗原a的情形则是例外。据发现，在所有的鞭毛上均有a抗原，虽然在各种菌株中所表现出的程度有所不同。

基于铜绿假单胞菌的热稳定主体抗原的血清型图谱被称作Habs图谱，并在最近被收入到国际抗原分型系统图谱中[见Liu，Int.J.Syst.Bacteriol.，33：256（1983）]。Habs参考菌株的铜绿假单胞菌的鞭毛类型已被R.Ansorg用多克隆血清以免疫荧光法特征化了[1987，Zbl.Bakt.Hyg.，I，Abt.Orig.A，242：228-238]或被用载片凝聚法特征化了[Ansorg，R.，et    al.，1984，J.Clin.Microbiol.，20：84-88]。Habs2，3，4，5，7，10，11和12号菌株是带b型鞭毛的菌株，而Habsl，6，8和9号菌株带有a型鞭毛。因此，大多数的铜绿假单胞菌的菌株可用很小数量的抗鞭毛蛋白单克隆抗体识别。因而，急需的是能够与鞭毛蛋白上的抗原决定簇起反应并在某些情况下还能抵抗多种血清型铜绿假单胞菌的单克隆抗体。进而，这些抗体中的一部分应适用于预防和治疗铜绿假单胞菌侵染，以及诊断这些侵染。而本发明则满足了这些需要。

本发明提供了新的细胞株，它们能生产出能够结合大多数假单胞菌菌株上的鞭毛的单克隆抗体。这些单克隆抗体能够与铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白上的抗原决定簇起特异性反应，并能辩别a型与b型鞭毛。此外，还提供了一种治疗已被铜绿假单胞菌侵染或怀疑被其侵染的患者的方法，即施用预防量或治疗量的一种组合物，该组合物包括至少一种与铜绿假单胞菌的鞭毛起反应的单克隆抗体或其结合片段，该组合物中含有生理上可接受的载体则更好。该组合物中还可以含有一种或一种以上的下述成分：另外的能与铜绿假单胞菌内毒素A反应的单克隆抗体;能与铜绿假单胞菌的LPS上的血清型抗原决定簇反应的单克隆抗体;人血浆的γ球蛋白组分;从显示出对铜绿假单胞菌起反应的免疫球蛋白水平被提高了的人的血浆中得到的γ球蛋白组分;一种或多种抗菌剂。进而，提供了这些单克隆抗体的医疗用途，包括生产诊断实验药盒。

本发明提供了能产生单克隆抗体的新细胞株和包含这些抗体的组合物，这种组合物能选择性地识别多数铜绿假单胞菌的鞭毛，某一种抗体专门识别某一种类型的铜绿假单胞菌鞭毛。所述细胞具有可视为同一的染色体，其中从自身所来的或从前体细胞所来的种系DNA被重排以编码具有某些铜绿假单胞菌菌株共有的鞭毛蛋白上的抗原决定簇的结合位点的抗体。对a型鞭毛蛋白，可以生产出泛-反应性单克隆抗体;对b型鞭毛蛋白，则包括泛-反应性抗体及与至少70%的具鞭毛菌株反应的抗体。这些单克隆抗体能以多种方式使用，包括诊断和治疗。

如此提供的单克隆抗体在治疗和预防由铜绿假单胞菌引起的严重疾病中特别有用。这些抗体分子可以与铜绿假单胞菌的鞭毛上的表面蛋白直接接触，因此能抑制其游动性和（或）对被侵染的宿主产生其它有益的效应。

这些单克隆抗体的制备可用能表达核酸序列的活细胞株来完成，该核酸序列编码对多数铜绿假单胞菌鞭毛蛋白上的抗原决定簇有特异性的抗体。活细胞株可以是通过肿瘤生成转化的，或被转染的、突变的等等哺乳动物细胞株。这些细胞包括骨髓瘤细胞株，淋巴瘤细胞株，或其它在活体中能有助于表达和分泌免疫球蛋白或其结合片段的细胞株。免疫球蛋白或其片段除了可以是用病毒转化淋巴细胞，特别是脾细胞，或是淋巴细胞与赘生性细胞即骨髓瘤细胞相隔合而得到杂交细胞株而产生的优选的鼠源或人源的免疫球蛋白或其片段，也可以是哺乳动物的天然免疫球蛋白或其片段。典型的脾细胞得自于对含抗原决定簇位点的鞭毛抗原或其片段进行免疫的动物。免疫的方法是众所周知的，而且可以有较大的不同但仍为有效[见Golding，Monoclonal    Antibodies：Principles    and    Practice，Academic    Press，N.Y.（1983），该文通过在此引述而合并于本文]可按常规技术对杂交细胞株进行筛选和克隆化，并且在细胞上清液中检测到的抗体是能够结合铜绿假单胞菌鞭毛抗原决定簇的。合适的杂交细胞株可以大规模培养，或注射到适宜宿主的腹膜腔中以生产腹水。

在本发明的一个具体实施方案中，所用细胞是被转化的人淋巴细胞，它能在活体中生产人单克隆抗体（优选保护性人单克隆抗体），该抗体易于接触对至少一种鞭毛蛋白为特异性的抗原决定簇。所述淋巴细胞可以得自那些可受或已受适合的带有鞭毛的铜绿假单胞菌感染的供者。优选的细胞介导的转化方法详见美国专利第4464465号，该文献通过在此引述而合并于本文。

由于有了本发明的已知对鞭毛蛋白为特异性的抗体，则在某些情况下就可用本发明的单克隆抗体对随后各实验的上清液以竞争性检测法进行筛选，作为一种确定其它抗鞭毛单克隆的方法。因此，由于有了本发明的对于某一鞭毛抗原为特异性的抗体存在，就能很容易地从其它来源生产杂交细胞株。

此外，由于有能产生对目标抗原决定簇位点为特异性的抗体的杂交细胞株，因而，这些杂交细胞可与其它赘生性B-细胞相融合，而这些另外的B-细胞可以作为编码受体的基因组DNA的接受体。最常用的是啮齿类特别是鼠类的赘生性B-细胞，但也可用其它哺乳动物的如兔、牛、羊、马、猪、鸟等等的。

单克隆抗体可以具有任何一类或亚类的免疫球蛋白，如IgM、IgD、IgA、IgE、或已知的各种动物的IgG亚类。一般来说，单克隆抗体可以完整地使用，或作为结合片段如Fv、Fab、F（ab′）2等等来使用，但通常均完整地使用。

本发明的细胞株除了直接生产单克隆体之外，还可以有其它的用途。这些细胞株可与其它细胞（如用药物适当标记的人骨髓瘤细胞、鼠骨髓瘤细胞、或人淋巴母细胞）融合以产生杂交瘤，以供转移编码单克隆抗体的基因所用，此外，这些细胞株可用作编码免疫球蛋白的染色体来源，可用除融合以外的技术将染色体分离出来并转移到其它细胞中。另外，可按重组DNA技术将编码单克隆抗体的基因分离出来，用于在各种宿主中生产特异性的免疫球蛋白。特别是，通过信使RNA建立起cDNA文库，则可分离出编码免疫球蛋白但不含基因内区的单一的cDNA克隆，放入到适宜的原核或真核表达载体中，随后转化到宿主中进行大量生产[见美国专利第4172124，4350683，4363799，4381292和4423147号，以及Kennettet    al.，Monoclonal    Antibodies，Plenum，New    York（1980），以及其中所述的参考文献，所有这些文献都通过在此引述而合并于本文]。

更具体地讲，按照杂交DNA技术，可在细菌和酵母中生产本发明的免疫球蛋白或其片段[见Boss，et    al.，Ncul.Acid.Res.，12∶3791    and    Wood    et    al.，Nature    314∶446，这两篇文献均通过在此引述而合并于本文]。例如，除了本发明的克隆之外，还可用来自BALB/C淋巴细胞的cDNA以不同的cDNA杂交技术分离出本发明细胞株所产生的单克隆抗体的轻链和重链的编码基因所转译的信使RNA。未杂交的mRNA将富含所需免疫球蛋白链的编码信息。如果需要，可重复这一过程以进一步提高所需mRNA水平。被减去的mRNA组合物可被反转译以提供富含所需序列的cDNA混合物。RNA可用适当的RNA酶水解，ssDNA则用DNA聚合酶I和随机引物例如随机成片段的牛胸腺DNA使之成为双链。所获的双链DNA可通过插入到适当的载体，例如λ-载体或质粒载体（如p    BR322，pACYC184等）中而被克隆化。基于轻链和重链的恒定区已知序列而建立的探针，可用杂交技术鉴定出来具有所需轻链和重链编码基因的cDNA克隆。此后，可从质粒上剪切下这些基因，经处理去除起始密码子或恒定DNA区域上游的多余的DNA，然后引入到适宜的载体中，用于转化宿主，最后进行基因表达。

如果合宜的话，哺乳动物宿主（如小鼠细胞）也可用来加工链（如参加重链和轻链）以生产完整的免疫球蛋白，而且如果需要的话，还可进而分泌不含引导序列的免疫球蛋白。此外，也可以用单细胞微生物生产这两种链，其中也许需要进一步处理去除编码分泌性引导子的DNA序列和加工信号子，从而使在重链编码序列的5′末端具有起始密码子。这样，就可以在哺乳动物细胞以外的其它细胞中使免疫球蛋白制备出来，并被加工成为可在这些细胞中聚集和被糖化的形式。如果需要的话，每条链均可被剪切以保留至少有可变区，然后，经过加工，这些可变区可用于其它对鞭毛抗原决定簇为特异性的免疫球蛋白或其片段。

本发明的单克隆抗体特别有用，因为它们对于与现在已知的几乎所有铜绿假单胞菌变种的抗原都具有特异性。而且，有些单克隆抗体在体内是保护性的，允许整合到治疗产物中，如用于细菌感染的抗体结合物。

还发现了本发明的单克隆抗体在体外具有各种广泛应用。例如，该单克隆抗体可用于微生物分类，用于分离特定的铜绿假单胞菌，用于从异源细胞混合物中选择性地除去铜绿假单胞菌，等等。

用于诊断目的，该单克隆抗体可被标记，也可不被标记。典型的诊断检测必须测定通过单克隆抗体与铜绿假单胞菌体的鞭毛的结合而形成的复合体。当未标记时，发现该抗体可用于凝聚检测。另外，未标记抗体可以与其它的与单克隆抗体相反应的标记抗体（第二抗体）结合使用，如特别对于免疫球蛋白的抗体。或者，可以直接标记单克隆抗体。而能够使用的标记非常之多，如放射性核素、荧光物质、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配位（尤其是半抗原）等。各种类型的免疫测定也是可得到的，例如，其中的某些测定法在美国专利号3817827，3850752，3901654，3935074，3984533，996345，4034074和4098876中已有叙述，通过在此引述将该文合并于本文。

本发明的单克隆抗体普遍用于酶免疫测定。其中，主抗体或从不同种得来的第二抗体被连接到一种酶上。当将含有某一血清型的铜绿假单胞菌的样品（如人血或其溶胞产物）与主抗体结合时，其结合发现在抗体与显示了所需的抗原决定基的那些分子之间。这些细胞可以从未结合的反应物分离出来，再加入第二抗体（用一种酶标记），然后，测定特异结合到细胞上的抗体-酶结合物的存在。本领域的普通技术人员所熟知的其它常规技术也可被使用。

诊断盒也可与用于测定溶液中的铜绿假单胞菌的或用于测定铜绿假单胞菌的鞭毛抗原的存在的主抗体一起使用。这样，本发明的主单克隆抗体组合物通常可以冷冻的形式单独地或与对于其它革兰氏阴性细菌特异性的附加抗体结合地提供。与标记结合或未被结合的抗体与缓冲剂、稳定剂、杀生物剂、无活性蛋白（如牛清蛋白）或其类似物缓冲液如Tris，磷酸盐，碳酸等一起包括在诊断盒中。这些物质通常以低于活性抗体量的5%（重量）的量提供，且其总量至少为抗体浓度的0.001%（重量）。通常，在盒中还包含一种无活性的补充剂或赋形剂以稀释活性成分是可取的。其中赋形剂可以占总组合物的1～99%（重量）。当使用能够结合到单克隆抗体上的第二抗体时，它通常是用一个单独的小瓶提供。第二抗体典型地连接到一种标记物上，且按与上面所述的抗体配方相类似的方式配成。

本发明的单克隆抗体，尤其是人单克隆抗体，也可以作为药用组合物的成分被掺入，该组合物含有治疗或预防量的本发明的至少一种单克隆抗体和药用有效载体。药用载体应为任何适合于将单克隆抗体传递给患者的相容的非毒性物质。无菌水、乙醇、脂、蜡和无活性固体都可被用作载体。可作药用的佐剂（缓冲剂、分散剂）也可被掺入药用组合物。这些组合物可含单一的一种单克隆抗体，以使其对铜绿假单胞菌的一种鞭毛型菌株为特异性。或者，一种药用组合物也可含有两种或两种以上的单克隆抗体，以形成一种“鸡尾酒”。例如，一种含有抗两种鞭毛型或抗一组各种铜绿假单胞菌（如不同的血清型）的单克隆抗体的鸡尾酒将是一种通用产品，它具有抗绝大多数那种特定细菌的临床分离物的活性。

各种单克隆抗体组分的摩尔比通常相差不大于10倍，更通常的是不大于5倍，与每一种其它抗体组分的摩尔比通常约为1∶1-2。

本发明的单克隆抗体也可与现在的血浆产品（如用于预防或治疗人体铜绿假单胞菌疾病的商业上可得到的γ球蛋白和免疫球蛋白产品）结合使用。对于免疫球蛋白，血浆最好是从显示出高水平的与铜绿假单胞菌相反应的免疫球蛋白的献血者获得。（见，简编“Intravenous    Immune    Globulin    and    the    Comhromised    Host”，Amer，J.Med.76（3a），March    30，1984，pp.1-231，通过在此引述，将该文合并于本文。

主单克隆抗体可以作为分别服用的组合物与抗生素或抗微生物剂结合使用。典型的抗微生物剂可包括与一种氨基糖苷（如庆大霉素、托普霉素）连接的抗假单胞青酶素（如羧苄基青霉素），但是本领域技术人员所熟知的众多添加剂（如头孢菌素）也可被利用。

本发明的单克隆抗体和其药用组合物尤其适用于口服或非肠胃服用。非肠胃服用更好，即皮下注射，静脉注射或肌肉注射。这样，本发明提供了用于非肠胃服用的组合物，它包括溶于一种可接受载体（最好是一种水溶性载体）中的单克隆抗体溶液或其鸡尾酒。可被使用的各种水溶液载体有水、缓冲水、0.4%的盐水，0.3的甘氨酸等等。这些溶液为无菌的且通常无颗粒物质。这些组合物可采用熟知的常规灭菌技术进行灭菌。组合物可含有可作药用的接近生理条件所需要的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂及其类似物，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些配方中的抗体浓度的变化范围非常之大，即少至约0.5%（重量），通常为或至少为约1%，多至15或20%（重量），这主要根据流动体积、粘度等进行选择，最好依具体的服用方式进行选择。

因此，一种用于肌肉注射的药用组合物可按下列组成配制：1毫升无菌缓冲水和50毫克单克隆抗体。一种用于静脉注射的典型组合物则含250毫升无菌Ringer's溶液和150毫克单克隆抗体。制备非胃肠可服用的组合物的实际方法，对于本领域的普通技术人员来说，是熟知的或明显的，其详细叙述见Remington's    Phormaceutical    Science15th    Ed.，Mack    Publishing    Company，Easton，Pennsylvania（1980）等，通过在此引述，将该文合并于本文。

本发明的单克隆抗体可以冷冻保存，在使用前再在一种合适的载体上重新复原。这一技术已被表明对于常规免疫球蛋白是有效的，且现有技术所已知的冷冻和复原技术都可使用。本领域普通技术人员将意识到，冷冻和复原将导致抗体活性的不同程度丧失（例如，对于常规的免疫球蛋白，Ig    M抗体要比Ig    G抗体具有更大程度的活性丧失），因此必须对所用的量进行调整，以补偿活性的丧失。

可服用含有本发明的单克隆抗体或其鸡尾酒的组合物来预防和/或者治疗铜绿假单胞菌感染。在应用于治疗时，是给已被一种或多种血清型铜绿假单胞菌感染的患者服用足够治疗或至少部分阻止感染和它们的繁殖的量的组合物。足够完成这一目的的量称为“治疗有效剂量”。对这一用途有效的量将取决于感染程度和患者自身免疫系统的总状态，但是其总范围为每千克体重1至200毫克抗体，更通用的是每千克体重5至25毫克抗体。必须注意，本发明的物质一般只是在严重的疾病状态时才可被使用，即在由于铜绿假单胞菌引起危及生命或潜在的危及生命的情况下（尤其是菌血症或内毒素血症）才被使用。

在用于预防时，是给未被铜绿假单胞菌感染的病人服用含有本发明的抗体或其鸡尾酒的组合物，以增强病人对这种潜在感染的抵抗能力。这种剂量称作“预防有效剂量”。在这一应用中，其精确用量同样取决病人的健康状态和总的免疫水平，但一般在每千克体重0.1至25毫克的范围内，尤其是0.5-2.5毫克/千克。

本发明的组合物可按主治医师所选择的剂量水平和服用方式进行单独服用或多种方法一起服用。但无论如何，该药用配方应提供给患者足够有效治疗或预防剂量的本发明的抗体。

实施例1

实施例1说明了特异性地结合到铜绿假单胞菌鞭毛上的鼠单克隆抗体的制备方法。

用活的铜绿假单胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2（A、T、C、C、＃27312和＃27313）细菌每一至两周腹膜内免疫三月令的BALB/C小鼠八次，总共九周。细菌的开始剂量，对于铜绿假单胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2分别为8×10⁶和1×10⁷，且在免疫的过程中剂量增加30至60倍。

最后一次注射后三天，从一个小鼠中无菌取出脾脏，然后通过在两个无菌玻片的冰冷末端之间轻轻转动该器官来制备单细胞悬浮液。将脾脏单核细胞与对数期鼠骨髓瘤细胞（NSI-1，从英格兰剑桥分子研究委员会（Moleculas Research Council，Cambsedge，England）C，Milstein博士处得到）以4∶1的比例结合，且按照Tam等（1982，Infect.Immun.，36∶1042-1053）所述的方法进行融合，形成杂交瘤。将最终的杂交细胞悬浮液在RPM I-杂化-HAT（RPM I 1640[Gibco，Grand Island，NY]含15%热失活牛胎儿血清，1mM丙酮酸钠，100微克/毫升青霉素和链霉素，1.0×10^-4M次黄嘌呤，4.0×10^-7M氨基喋呤和1.6×10^-5胸苷）中稀释至每毫升1.5×10⁶个细胞的浓度，其中包括作为种子细胞的新鲜制备的BALB/C胸腺细胞2.0×10⁶个/毫升。

将该混合物投放（200微升/孔）在96孔平板中（＃3596，Costar，Cambridge，MA）。每两至三天除去每个孔中50%体积的RPM    I-杂化-HAT，而用50%体积的新鲜RPM    I-杂化-HAT取代之，以对培养物进行供养。当孔中的细胞生长达到约40%的融合时（通常在7-10天），用酶联免疫吸附测定法来检测培养物上清液中抗铜绿假单胞菌抗体的存在。

同时在两种免疫细菌中每一种的外膜制品上测定杂交细胞培养物上清液。外膜制品是通过修正过的Tam等（1982，Infect.Immun.，36∶1042-1053）的方法进行分离的，通过引述将该文合并于本文。将细胞（铜绿假单胞菌Fisher免疫型1和Fisher免疫型2）接种于胰酶解酪蛋白黄豆培养液（TSB）中，于34℃在一旋转摇床中通气培养16-18小时。然后离心收集细菌，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.14M NaCl，3mMKCl，8mM Na₂HPO₄-7H₂O，.1.5mM KH₂PO₄，pH7.2）冲洗两次，该盐水每毫升含有150个胰蛋白酶抑制单位（T.I.U.）抑肽酶（Sigma，St.Louis，MO）。

将最后一次离心所得沉淀重新悬浮于0.17M三乙醇胺、20mM乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐溶液中，然后在冰上均化10分钟。于14，900xg转速离心，除掉从匀浆中沉淀的碎片，上清液再次按上法离心，再次除掉沉淀。当以141，000xg的转速离心1小时后，细胞膜从上清液中沉淀。除去上清液，于每毫升含有75T.I.U.抑制肽酶的10毫升PBS中在4℃过夜保存细胞膜沉淀。第二天通过旋转重新悬浮沉淀，然后将其分成等分，再于-70℃保存。其中每份的蛋白质含量用Lowry等（1951，J.Biol.Chem.，193∶265-275）的方法进行了测定。

用于酶联免疫吸附测定的抗原平板按下法制备。在PBS中将外膜制品稀释至每毫升蛋白质5微克的浓度，将50微升的该溶液投放到96孔平板（Linbr1    ＃    76-031-05，Flow    Laboratorces，Inc.，Mcleam，VA）的每一孔中，密封后于37℃过夜培养。将未结合的抗体从平板中轻轻除掉，向每一孔中加入100微升溶于PBS的5%（W/V）牛血清白蛋白（BSA）后，于37℃将平板培养1小时。

轻除未吸附BSA后，将从融合平板的每一孔得到的培养物上清液（50微升）重新投放到相应的抗原平板的孔中，于37℃培养30分钟。从孔中轻除未结合的抗体，然后每孔用100微升1%（W/V）BSA-PBS洗三次。接着，将适当稀释的生物素化的山羊抗鼠Ig G（Tago，Inc.，Burlingame，CA）以每孔50微升的量加到每一孔中，于37℃培养30分钟。再将平板按上述方法洗三次，将按制造者的说明所制备的预先形成的抗生物素蛋白∶生物素化的辣根过氧化物酶复合物（Vectastain ABC Kit，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA）加到孔中。于室温下放置30分钟后，从孔中轻除Vectastain试剂，如上一样洗孔，然后向每孔中加入100微升底物，即邻-苯-烯二胺（enediamine）（以0.8毫克/毫升的量溶于0.1M柠檬酸缓冲液，pH5.0，与等体积的0.03%（V/V）H₂O₂混合）。于室温中在暗处将底物保温30分钟，然后以50微升/孔的量加入3NH₂SO₄以终止反应。

通过在Dynatech    Model    580微酶联免疫吸附测定读数器Alexandria，VA）上测定每孔中比色反应在490nm处的吸收，找出分泌结合到两种抗原制品中的任一种上的单克隆抗体的杂交瘤细胞。一个孔中的定名为Pa3    IVC2的细胞产生的抗体仅结合到Fisher免疫型2抗原平板上。对这一孔的进一步研究见如下所述。来自这一孔中的单克隆抗体和克隆细胞系在下面的文章中均用Pa3    IVC2符号表示。得自主孔的Pa3    IVC2细胞按Tam等（1982，lnfect.1mmun.，36∶1042-1053）所述的有限稀释技术被微克隆和克隆。

按照Tam等所述的方法（1982，1nfect.1mmun.，36∶1042-1053）在CB6 F₁小鼠（BALB/C[雌]×C57BL/6[雄]F₁）中制备含有高效价单克隆抗体的腹水液。在用对数期Pa3 IVC2细胞（溶于RPMI）进行腹膜注射前10-21天，用0.5毫升Pristane（2，6，10，14-四甲基十五烷，Aldrich Chemical Co.Milwaukee，WI）对两至三月令的雄性CB6 F₁，小鼠进行腹膜注射。每个小鼠用0.5毫升的0.5-1×10⁷个细胞进行注射。大约两周后，每两至三天从小鼠中取出积累的液体。用琼脂糖凝胶电泳仪（Paragon，Bechkman，lnstruments，lnc.，Brea，CA）测定腹水液中抗体的浓度。收集所有含5毫克/毫升或更多抗体的腹水，等分后于-70℃保存。

被单克隆抗体结合的分子靶的特征：

按照上面所述的酶联免疫吸附测定法在外膜制品上测定从克隆的Pa3    IVC2细胞系得来的培养物上清液，这些外膜制品来自所有七个铜绿假单胞菌Fisher免疫型菌株（A.T.C.C.27312-27318），致金色假单胞菌（A.T.C.C.13985）和肺炎克雷伯氏菌（A.T.C.C.8047），它们都是按上述方法准备。抗体Pa3    IVC2结合到铜绿假单胞菌Fisher免疫型2，6和7的外膜制品上，而不与其它的Fisher免疫型、致金色假单胞菌或肺炎克雷伯氏菌的外膜制品结合。

用抗体Pa3    IVC2鉴定过的特定抗原通过放射免疫沉淀进行了鉴定。简言之，这一分析需要将Pa3    IVC2抗体和来源于蛋白质A的颗粒（它导致形成不溶性抗原：抗体复合物的形成）与放射性标记的抗原一起保温。冲洗这一复合物，除去任何非特异性结合的抗原，然后在聚丙烯酰胺凝胶中将其分离，并且分散。凝胶中发现的主要的放射活性种被鉴定为与抗体Pa3    IVC2结合的相应抗原。

可溶性的铜绿假单胞菌Fisher免疫型2，3，4和5的外膜制品的等分样品在固相中使用Iodo-gen（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）被¹²⁵I进行了放射性标记（Fraker and Speck，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.，80∶849-857;Markwell    and    For，1978，Biochemistry，17∶4807-4817）。这一方法即使没有导致外膜制品中含有的所有蛋白质被碘化，那么也导致了大部分外露的酪氨酸残基被碘化。

为了减少外膜抗原与抗体Pa3 IVC2的非特异性结合，首先将放射性标记的制品（每次测定的每分计数为5×10⁶）与BALB/C正常小鼠血清（1∶40的最终稀释）于4℃保温1小时。然后将含有Pa3IVC2抗体的Pa3 IVC2培养物上清液（0.5毫升）加到每一个外膜样品中。于4℃将抗原和抗体保温1小时后，加进蛋白质A源，Ig G SORB（每个样品0.095毫升）（The Enzyme Center，Inc.，Boston，MA），于4℃继续保温30分钟（Kessler，S.W.，1975，J.Immunol.，115∶1617-1622）。Ig G SORB可按生产人的说明进行制备，在使用前，通过用RPM I-杂种（除去HAT的RPM I-杂化-HAT培养基）冲洗Ig G SORB两次，来封闭潜在的与培养基的反应位点，就可以防止非特异性的反应。

于4℃以1500×g的转速离心10分钟，沉淀抗原-抗体-IgG    SORB复合物，然后用磷酸盐-RIPA缓冲液（10mM磷酸盐，pH7.2，0.15M    Na    Cl，1.0%[V/V]Triton    X-100，1.0%[W/V]脱氧胆酸盐，0.1%[W/V]十二烷基磺酸钠[SDS]和1.0%[V/V]aprotimin）洗两次;用高盐缓冲液（0.1M    Tris-HCl，pH8.0，0.5MLiCl，1%[V/V]β-巯基乙醇）洗两次;用裂解缓冲液（0.02M    Tris-HCl，pH7.5，0.05M    NaCl，0.05%[V/V]Nonidet    P-40）洗一次（Rohrschneider等，1979，Proc，Natl，Acad，Sci.，U.S.A，76∶4479-4483）。结合到复合物上的抗原通过与样品缓冲液（0.125M    Tris-HCl，pH6.8，2%[W/V]SDS，2%[V/V]β-巯基乙醇，20%[V/V]甘油）一起在95℃保温10分钟而被释放，且通过以1500×g的转速离心10分钟后汇集在上清液中。

然后将上清液置于按照经Hancock和Carey修改（1979，J.Bacteriol，140∶902-910，通过在此引述合并于本发明）的B-Lugtenberg等人的方法（1978，FEBS    Lett.，58∶254-258）制备的含有SDS的14%聚丙酰胺凝胶中。通过在50V的恒定电压下过夜电泳，抗原在凝胶中被分离。在40%（V/V）甲醇，10%（V/V）乙酸和5%（V/V）甘油中将凝胶过夜固定后，通过一种Biorad凝胶干燥器（Rechmond，CA）将它在Whatman    3MM纸上干燥。用一塑料包装物将干燥凝胶覆盖，且在室温下对柯达X-AR胶片暴光18小时。

这一实验的结果表明，Pa3 IVC2只与铜绿假单胞菌Fisher免疫型2的外膜制品中的一种抗原结合，而不与其它的外膜制品中存在的任何抗原结合。凝胶中的抗原的分子量（MW）大约为53，000道尔顿，它是通过比较它与在同一凝胶中分散的¹⁴C-标记的蛋白质标准品（磷酸化酶B，92，5000MW;BSA，69，000MW;卵清蛋白，46，000MW;碳酸酐酶，30，000MW;细胞色素C，12，000MW）（New England Nuclear，Boston，MA）的迁移率而测定的。据Montie等报道（1982，Infect.Immun.，35∶281-288），该文献通过在此引述而合并于本发明），这一抗原的分子量与鞭毛蛋白（即组成铜绿假单胞菌的鞭毛的蛋白质）的分子量相关。

另外，使用被乙醇固定到96孔微滴定板上的铜绿假单胞菌Habs菌株1-12（A、T、C、C、33348-33359），通过ELISA对Pa3    IVC2进行了检查。抗原平板的制备方法如下。

离心沉淀每种生物的过夜培养物，用PBS洗两次后重新悬浮在PBS中，使其在A660处为0.2    O.D.单位。将稀释过的细菌涂布在孔中（每孔50微升），然后在室温下以1500×g的转速离心15分子。吸出PBS后向孔中加入95%的乙醇，且于室温下保持15分钟。在乙醇从孔中轻除后，将平板空气干燥，包裹后在4℃保存起来，以备使用。

按上述方法所完成的ELISA的结果表明，Pa3    IVC2结合到乙醇固定的Habs菌株2，3，4，5，7，10，11和12上。这种特异性表明Pa3    IVC2结合到铜绿假单胞菌的b型鞭毛上（Ansorg，R.，1978，zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A.242∶228-238;Ansorg，R.，1984，J.Clin.Microbiol.，20∶84-88，这两篇文章都通过在此引述而合并于本文。）.根据这种对于单克隆的Pa3    IVC2的特异性的分配，可知铜绿假单胞菌参考菌株Fisher免疫型2，Fisher免疫型6和Fisher    7带有b型鞭毛。从前面的实验数据可以得出结论，Pa3    IVC2特异性地与铜绿假单胞菌b型鞭毛蛋白结合。

Pa3    IVC2体内保护活性：

进行动物实验，以测定单克隆抗体PA3 IVC2是否能够保护被多种LD₅₀量活铜绿假单胞菌攻击的小鼠。所选择的模型是被灼伤的小鼠模型（Collins，M.S.和Roby，R.E.，1983，J.Trauma，23∶530-534，该文通过在此引述而合并于本发明）。按照作者的方法将各组小鼠严重的灼伤，然后立即用5-10LD₅₀的Fisher免疫型7攻击。在灼伤和攻击前，按高效价的腹水对小鼠腹膜注射单克隆抗体（0.2毫升腹膜注射）。与未接受抗体的小鼠比较，在用Pa3 IVC2处理的动物中，其存活数并没有增加。

实例2

实例2说明了制备产生鼠单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系的方法，而这种抗体是在体内抗铜绿假单胞菌b型鞭毛蛋白的保护性抗体。

在用活的铜绿假单胞菌Fisher免疫型5（ATCC27316号）对成年雌性BALB/C小鼠进行腹膜注射（4×10⁶个生物体）两周以后，用活的铜绿假单胞菌Fisher免疫型6（ATCC27317号）对它进行第一次腹膜注射（8×10⁶个生物体）。在接下来的两周时间内，每周用活的铜绿假单胞菌Fisher免疫型5和Fisher免疫型6一起注射一次，共两次。每种生物的剂量不断增加，致最终剂量为最初剂量的10倍。在最后一次活细菌注射四天以后，用按照R.E.W.Hancock和H.Nikaido 1978，J.Bacteriol.，136∶381-390）的方法制备的铜绿假单胞菌Fisher免疫型6外膜制品（50微克蛋白质）对小鼠进行最后一次注射。最后一次免疫后三天，从一小鼠中取出脾脏，按照实例1所述的方法制备用于杂交的脾细胞。

在融合后的第十天，按照实例1所述的方法，通过ELISA测定杂交瘤细胞的培养物上清液中抗铜绿假单胞菌抗体的存在，但用于ELISA平板的抗原是固定到96孔微滴定平板的孔中的活细菌时除外。平板的制法如下：

将50微升聚-L-赖氨酸（PLL）（以1微克/毫升溶于PBS）（Sigma    ＃P-1524，St.Louis，MO）加到96孔平板（Linbro）每一孔中，于室温下保温30分钟。轻除未吸附的PLL，用PBS洗孔三次。在TSB中过夜培养的细菌培养物用PBS洗一次，然后重浮于PBS中，致O.D.660nm＝0.2。向平板的每一孔中加入50微升的细菌悬浮液，于37℃让它结合1小时。未结合的细菌通过轻摇平板除去，然后用盐水-吐温（0.9%[W/V]NaCl，0.5%[V/V]吐温-20）洗孔三次。

抗体的非特异性结合可通过向孔中加入200微升/孔的保护缓冲液（含有5%[W/V]去脂干乳、0.01%[V/V]Antifoam    A[Sigma，St.Louis，MO]和0.01%[W/V]乙基汞硫代水扬酸钠）且于室温下保温1小时而被阻止。排出过量的保护缓冲液，用前面所述的盐水-吐温洗孔三次。

将培养物上清液（50微升）复制到测定平板的相应孔中，于室温下保温30分钟。通过轻摇平板除去培养物上清液，然后用盐水-吐温洗孔五次。

在预先测定了的效价的含有0.1%（V/V）吐温-20和0.2%（W/V）BSA的PBS中稀释连接了酶的第二步抗体（结合了辣根过氧化物酶的山羊抗鼠Ig    G+IgM）（Tago，Inc.，Burlingane，CA），向每孔中加入50微升的该试剂，于室温下保温30分钟，排出过量的试剂;在盐水-吐温中洗5次;然后按实例1所述的方法，每孔加入100微升邻-苯二胺底物，保温30分钟。按实例1所述的方法终止反应。然后在Bio-Tek    EL-310Automated    EIA    Plate    Reader上于A（490纳米处读数。

按照上述方法，测定从融合物得到的培养物上清液与铜绿假单胞菌Fisher免疫型1，2，3或4结合的抗体的存在，但这种抗体不与按照同样的PLL和阻止方法制备的而不含细菌的平板结合。分别用七种Fisher免疫型细菌来检测含有与这四种Fisher免疫型中的任一种结合的抗体的上清液。存在于从一个孔中得来的上清液中的抗体Pa F4 IVE8仅仅与铜绿假单胞菌Fisher免疫型2，6和7结合。用实例1所述的有限稀释法，克隆来自孔Pa F4 IVE8的细胞。从这一孔得来的单克隆抗体和克隆细胞系在下文中均用Pa F4 IVE8命名来表示。如同实例1所述，产生了含高效价的单克隆抗体的腹水液，仅是使用BALB/C小鼠代替了CB6 F₁。

Pa    F4    IVE8的特异性

一个用于鉴定结合到单克隆抗体Pa    F4    IVE8上的抗原的测定是用在细菌体上的间接免疫荧光方法进行的。将铜绿假单胞菌的七种参考Fisher免疫型中的每一种、不具鞭毛的铜绿假单胞菌菌株（PA103，A、T、C、C29260，Leifson，1951，J.Bacteriol.，62∶377-389）和大肠杆菌（G.S.C.A25）于37℃在TSB中过夜培养。离心沉淀细菌，然后在PBS中洗两次。每种菌株在PBS中重新悬浮，致其O.D.660nm＝2.2。

细菌悬浮液进一步以1∶150稀释，将20微升样品加到Carlson玻片（Calson    Scientific    Inc.，Peotone，IL）的各个孔中，然后于40℃干燥玻片。在一潮湿房间中，将Pa    F4    IVE8的培养物上清液（25微升）于室温下在玻片中的干燥细菌样品上保温30分钟。未结合的抗体通过在蒸馏水中浸泡玻片而从被玻片上洗掉。

玻片干燥后，在一潮湿的暗房中，将连接了荧光素异硫氰酸盐的山羊抗鼠Ig    G+Ig    M（每孔25微升，用PBS以1∶40稀释）（Tago，Burlingame，CA）在玻片上于室温中保温30分钟。在再用蒸馏水冲洗玻片，干燥后用盖玻片复盖，且用甘油（在PBS中，9∶1）固定。用荧光显微镜观察玻片。

仅在铜绿假单胞菌Fisher免疫型2，6和7中观察到荧光染料，且观察到是一种从生物体的仅一端发射出的正弦图案（线）。这与这些细菌极生单鞭毛的形态学和分类相一致。

Pa    F4    IVE8与鞭毛的反应通过免疫吸印分析而被证实。来自铜绿假单胞菌Fisher免疫型6（见实例1）的外膜抗原通过电泳而被分离，电泳是按实例1所述的方法在含有SDS的14%聚丙烯酰胺凝胶中进行，不同的只是电泳是在80毫安的恒定电流强度下跑5个小时。预先染色的分子量标记物（溶菌酶，14，300MW，β-乳球蛋白，18，400MW;α-胰凝乳蛋白酶原，25，700MW;卵清蛋白，43，000MW;牛清蛋白，68，000MW;磷酸化酶B，97，400MW;肌球蛋白，200，000MW）（BRL，Gaithersfurg，MD）也包括在同一聚丙烯酰胺凝胶中。

通过在含有0.05%（W/V）SDS的Tris-甘氨酸-甲醇缓冲液（Towfin等，[1979]，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，76∶4350-4354）中于4℃、200mA的恒定电流强度下过夜电泳，将抗原从聚合丙烯酰胺凝胶中转移到硝酸纤维素膜上（NCM）（0.45um，Schleicher    &    Schuell，Inc.，Keen.NH）。转移后，将NCM在溶于PBS的0.05%（V/V）吐温-20（PBS-吐温）（Batteiger，B.d等，1982，J.Immunol.Meth.，55∶297-307）中于室温保温1小时。从这一步及所有以后步骤起，将含有NCM的浅盘置于摇床上，以保证溶液均匀分布于整个NCM。

1小时之后，例出PBS-吐温溶液，加入Pa    F4    IVE8腹水（以PBS-吐温中1∶1000稀释），再于室温中与NCM一起保温1小时。然后用PBS-吐温冲洗NCM五次，每5分钟一次，以除去未结合的抗体。连接了碱性磷酸酶的山羊抗鼠Ig    G+Ig    M（Tago，Inc.）按照制造者的说明进行稀释，然后与NCM一起在室温下保温1小时。象上述一样冲洗NCM五次，然后加入含有溴氯吲哚磷酸盐和氮蓝四唑的底物（Sigma，St.Louis，MO）（按照Leary等，1983，Proc，Natl.Natl.Aead.Sci.，U.S.A.，80∶4045-4049所述的方法制备），在室温下保温10-20分钟。反应的终止是通过用蒸馏水涤掉底物而完成。

这一实验的结果表明，Pa    F4    IVE8与外膜制品中具有53，000道尔顿的分子量的单个抗原特异性结合。间接免疫荧光测定和免疫吸印的结果表明，Pa    F4    IVE8与铜绿假单胞菌的鞭毛结合。

Pa    F4    IVE8所识别的鞭毛型用ELISA进行了测定。将每种Habs菌1-12（ATCC33348-33359号与带有PLL的96孔微滴定板（Linbro）的孔结合。ELISA按在此实验前面部分所述的方法进行。Pa    F4    IVE8抗体的来源是培养物上清液。观察到在含有Habs菌株2，3，4，5，7，10，11，和12的孔中发生了阳性反应，这表明Pa    F4    IVE8与b型鞭毛结合。在下面的实例4中给出了体内保护数据。

实施例3

实施例3说明了制备产生单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系的方法，而这种抗体是与抗-铜绿假单胞菌a型鞭毛相反应并在体内是保护性的。

用于融合的淋巴样细胞的来源是从被免疫的BALB/C小鼠得来源的脾脏，这种小鼠在6周的时间内腹膜注射了4次得自Habs菌株6和8（ATCC33353和33355号）的纯化型鞭毛（10-20微克蛋白质）。鞭毛的纯化是按照T.C.Montie等的方法（1982，Infect，Immun.，35∶281-288，它在此被引入本发明作为参考）进行，其不同仅仅为，最后鞭毛的离心是在100，000xg的转速下离心1小时，而不是在40，000xg的转速下离心3小时。为了适应某些方法的第二种修改是，在一混合物中30秒钟内从细菌中切除鞭毛，而不是3分钟。（Allison等，1985，Imfect.Immun.，49∶770-774）。

每种制品的蛋白质浓度用Bio-Rad    Protein    Assay仪（Bio-Rad，Richmond，CA）进行了测定，污染性脂多糖（LPS）的存在通过测定KDO含量而被确定（Karkhanis，Y.D.，等，1978，Ansl.Biochem.，85∶595-601）。鞭毛蛋白的分子量是通过将它们与标准蛋白质标记物（见实例2）在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移而被测定。Habs6鞭毛蛋白的分子量是51，700道尔顿，而Habs    8鞭毛蛋白则为47，200道尔顿。这些数值与J.S.Allison得出的数值（1985，Infect.Immun.，49∶770-774，通过在此引述而将该文献合并于本文）一致。

按照实例1和2所述，在最后一次免疫后的第三天将来自鞭毛蛋白免疫过的鼠脾细胞和NS-1骨髓瘤细胞进行融合。当杂交瘤细胞的生长达到大约40%的融合（第七天）时，将培养物上清液复制到三个不同的抗原平板[即PLL-结合的铜绿假单胞菌Fisher免疫型1（制备见例Ⅰ）和福尔马林固定的Habs6和Habs9）的相应孔中。

培养用于福尔马林固定的抗原平板的细菌，洗涤后象PLL-结合的抗原平板所述的一样进行稀释。稀释后的细菌（A660处为0.2    O.D.单位）加到Linbro    96孔微量滴定平板的各个孔中（每孔50微升），然后在室温下以1200×g的转速将平板离心20分钟。离心后从孔中轻除上清液，再向每孔中加入75微升在PBS中的0.2%（V/V）的福尔马林，于室温下保温15分钟。从孔中轻除福尔马林后，空气干燥平板，于4℃保存以备使用。抗鞭毛的抗血清凝聚福尔马林处理过的生物体的能力表明，福尔马林没有改变鞭毛的抗原性（Lanyi，B.，1970，Acta    Microbiol.Acad.Sci.，Hung.，17∶35-48）。铜绿假单胞菌Fisher免疫型1菌株是作为对照包括进来，因为通过媒染剂染料染色（Manual    of    Clin，Microbiol.，1985，Lennette，ed.Amer.Soc.Microfiol.，Wash.，D.C.，P.1099）证明，这一菌株不具鞭毛。孔中的被称作FA6    IIG5的杂交细胞产生与Habs6和Habs9（两者均为带有a型鞭毛的菌株）结合而不与Fisher免疫型1结合的抗体。

按照前面的例子中所述的方法，将孔中的FA6    IIG5细胞传代培养及克隆。从这一孔中得到的单克隆抗体和克隆细胞系在下文中均用FA6    IIG5表示。腹水按实例2所述的方法在BALB/C小鼠中产生。

FA6    IIG5的特异性

通过间接免疫荧光和免疫吸印确定抗体FA6    IIG5的特异性。间接免疫荧光基本上按实施例2所述方法进行，改动之处如下。

在30℃下使细菌培养物在胰蛋白酶大豆琼脂平板上生长过夜，用棉签从平板上取出培养物并重新悬浮在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中，使其A660为0.2    O.D.单位。在搅拌下将福尔马林（在PBS中的终浓度为0.37%[v/v]）加到悬浮液中。在室温下培育15分钟后，以1∶12用PBS稀释细菌并将20μl该悬浮液放入Carlson载玻片的每个孔中。干燥后，如实施例2所述制备观察用的玻片。抗体的来源是FA6    IIG5细胞系培养物上清液。

仅在带有a型鞭毛的铜绿每单胞菌菌株中观察到利用FA6    IIG5抗体的荧光染色，而在任何一种带有b型鞭毛的菌株没有观察到荧光染色。观察到的荧光图谱是正弦曲线图谱，这表明FA6    IIG5结合到鞭毛上。用福尔马林处理细菌可增强荧光信号，但用抗体使染色的鞭毛显色不需处理。

如实施例2所述进行免疫吸印。a型鞭毛抗原的来源是纯化的鞭毛制品（见本实施例）。在含有SDS的10%聚丙烯酰胺凝胶中使抗原分离（Laemmli，U.K.1970，Nature[London]，227∶680-685）并转移到NCM中。使FA6    IIG5制剂，即培养物上清液或以1∶1000稀释的腹水，与NCM反应，如实施例2所述用合适的结合酶试剂和酶底物检测该反应。免疫吸印说明FA6    IIG5特异地结合到Habs6的鞭毛蛋白（分子量为51，700）和Habs8的鞭毛蛋白（分子量为47，200）上。

用酶联免疫吸附法（ELISA）可获得FA6    IIG5只与a型鞭毛而不与b型鞭毛反应的证据，其中将Habs菌株1-12分别与PLL一起结合到Linbro    96孔微滴平板的孔上。该抗体只结合到Habs菌株1，6，8和9上，这些菌株是12个菌株中仅具有a型鞭毛的菌株（见Ansorg，R.，et.al.，1984，J.Clin.Microbiol.，20∶84-88，在此列为参考文献）。在下面的实施例4中描述了体内保护性研究。

实施例4

实施例4说明在烧伤小鼠模型中用Pa    F4    IVE8和FA6    IIG5抗体被动免疫的小鼠不受铜绿假单胞菌的攻击的保护作用。

按照M.S.Collins和R.E.Roby的方法（1983，J.Trauma，23∶530-534，在此列为参考文献）在烧伤小鼠模型中试验了抗鞭毛单克隆抗体。为了保护性研究，通过蛋白A-琼脂糖层析法（Ey，P.L.，et    al.，1978，Immunochemistry，15∶429-436，在此列为参考文献）提纯了所有抗体，并透析到PBS缓冲液中。用于动物试验的具有a型鞭毛的菌株是铜绿假单细胞PA220（来自Dr.James    Pennington，Boston，MA），作为对照的b型鞭毛菌株是铜绿假单胞菌Fisher免疫型2（A.T.C.C.＃    27313）。

每只小鼠在烧伤和攻击之前1-2小时静脉注射40μg纯化单克隆抗体。烧伤后，动物立刻于焦痂下（subeschar）接受0.5ml含有攻击细菌的冷PBS.攻击剂量约为每个有机体10LD50。动物试验结果列在表Ⅰ和表Ⅱ中。

表Ⅰ.抗a型鞭毛单克隆抗体在

烧伤小鼠模型¹中的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

抗鞭毛a，    100    100    100    100    100    90    90    80    80

FA6    IIG5

抗鞭毛b，    100    20    10    10    10    10    10    10    10

Pa    F4    IVE8

非特异性抗-    100    40    30    20    10    10    10    10    10

LPS单克隆抗体

PBS，无机菌    80    80    80    80    80    80    80    80    80

1.用大约10LD50的铜绿假单胞菌PA220焦痂下攻击小鼠。

2.百分比基于在10只动物组中小鼠的存活率，只有对照组PBS由5只小鼠组成除外。天数是指烧伤和攻击后的天数。

表Ⅱ.抗b型鞭毛单克隆抗体在烧伤小鼠模型¹中的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

抗鞭毛b，    100    100    90    90    90    90    90    90    90

Pa    F4    IVE8

抗鞭毛a，    100    20    10    10    10    10    10    10    10

FA6    IIG5

非特异性抗-    100    20    20    20    20    20    20    20    20

LBS单克隆抗体

PBS，无细菌    100    100    100    100    100    100    100    100    100

1.用大约10LD50的铜绿假单胞菌Fisher免疫型2焦痂下攻击小鼠。

2.百分存活率基于每组10只小鼠的存活数，只有对照组PBS例外，它由5只小鼠组成。天数是指烧伤和攻击后的天数。

在用抗-a抗体或抗-b抗体处理，然后用相应的抗原攻击的小鼠中观察到显著的存活率。相反地，80-90%未经处理，但受过攻击的小鼠或用不匹配的抗鞭毛单克隆抗体或非特异性抗-LPS抗体处理的动物死亡。抗-a型鞭毛抗体不能使小鼠免受具有b型鞭毛的铜绿假单胞菌Fisher免疫型2的致死攻击，抗-b型鞭毛抗体不能使小鼠免受具有a型鞭毛的铜绿假单胞菌PA220的致死攻击，在体内证实了在体外观察到的抗体的专一性。烧伤，但未受感染小鼠的存活率表明烧伤本身不会致死。

实施例5

实施例5说明Pa    F4    IVB8和FA6    IIG5与铜绿假单胞菌临床分离物的广泛的交叉反应性，表明这些抗体在铜绿假单胞菌感染的免疫治疗中的临床应用。

从医院和诊所得到临床分离菌。分离菌来自于各种分离点，包括血液，伤口，呼吸道，尿，和耳朵。共检验了157个分离菌。

Pa    F4    IVB8特异地结合到34个临床分离菌上（22%），而a型鞭毛抗体，FA6    IIG5结合到102个临床分离菌上（65%），157个分离菌中共有136个被结合（87%）。在未被任-抗体识别的21个菌株中，有19株无鞭毛，如媒染剂染色所示。因此，两种抗体都结合到138个具鞭毛的临床分离菌的136个菌株上（98%），证实了以前的报导（见R.Ansorg，1978，zbl.Bakt.Hyg.，IAbt.Orig.A，242∶228-238，在此列为参考文献）。

实施例6

实施例6说明结合到铜绿单胞菌b型鞭毛上的人单隆抗体的生产方法。

来自用高分子量多糖制剂免疫的个体的外周血样品（Pier    et    al.，1984，Infeet    Immun.，45∶309）作为B细胞的来源。用标准离心技术在Ficoll-Paque上从血液中分离出单核细胞（Boyum（1968）Scand.J.Clin.Lab.Invest.，21∶77）并用无钙/镁的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。

用改良E-玫瑰花结法除去单核细胞中的T-细胞。简言之，首先在4℃下将细胞重新悬浮在含有20%胎牛血清（FCS）的PBS中，浓度为1×10⁷细胞/ml。然后将1ml该悬浮液放在一克17×100mm聚苯乙烯圆底试管中，向管中加入1×10⁹2-氨基-溴化异硫脲（AET）处理的羊红血球[来自10%（v/v）的Iscove改良的Dulbecco培养基（Iscove培养基）溶液]（Madsen snd Johnson（1979）J.Immun.Methods，27∶61）。在4℃下将悬浮液轻轻混合5-10分钟，然后在4℃下以2500×g的速度在Ficoll Paque上离心8分钟除去E-玫瑰花结细胞。收集在界面处结合的E-玫瑰花结阴性外周血单核细胞（E^-PBMC）并用Iscove培养基洗涤一次，重新悬浮在含有15%（v/v）FCS，L-谷氨酰胺（2mmol/l），青霉素（100 IV/ml），链霉素（100 μg/ml），次黄嘌呤（1×10^-4M），氨基蝶呤（4×10^-7M）和胸苷（1.6×10^-5M）的Iscove培养基中。此后将这种培养基称作为HAT-培养基。

这些细胞与转化细胞系一起混合培养来完成E^-PBMC的细胞从动转化。转化细胞系是Epstein-Barr核抗原（EBNA）阳性人淋巴母细胞细胞系，该细胞系通过GM1500淋巴母细胞细胞系的乙基甲烷-硫酸盐（EMS）诱变，然后在30μg/ml 6-硫代鸟嘌呤存在条件下筛选使细胞变为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）缺乏，从而HAT敏感而得到。该细胞系被命名为1A2细胞系并于1982年3月29日贮存在美国典型培养物保藏中心（A.T.C.C），A.T.C.C.号为CRL8119。将对数生长期的1A2细胞悬浮在HAT-培养基中，然后从每个PBMC含15个1A2细胞的比例与E^-PBMC结合。将细胞混合物置入在30个圆底96孔的微滴平板（Costar 3799）中，浓度为32，000细胞/孔，体积为200μl/孔，在37℃，含有6%CO₂的湿润空气中培育。在平板培养后的第5天和第天用新鲜培养基取代一半上清液培养细胞。平板培养后16天，100%的孔含有多育的细胞并且在大多数孔中细胞都具有足够的密度可取出并试验抗铜绿假单胞菌抗体的上清液。

用实施例2所述的ELISA技术（做如下改动）筛选有抗铜绿假单胞菌抗体存在的上清液。将7个Fisher免疫型参照菌株库（A.T.C.C.号27312-27318）（A660＝0.2O.D.单位）结合到用聚-L-赖氨酸预先处理过的平底96孔的微滴平板中（Immulon    II，Dynatech），培育，并按实施例2所述方法洗涤。阻断非专一性结合位点并洗涤平板，然后在每个孔中加入50μl含有0.1%（v/v）吐温-20和0.2%（w/v）BSA的PBS。然后将培养物上清液（50μl）复制平板培养到测定平板的相应孔中及用PLL处理并阻断，但不含细菌的对照平板中。在培育并洗涤后，将结合酶第二步抗体（50ml/孔），辣根进氧化酶结合山羊抗-人Ig    G和山羊抗-人Ig    M（在含有0.1%（v/v）吐温-20和0.2%（w/v）BSA的PBS中适当稀释）加到各孔中并如实施例2所述完成测定。

分别用7个Fisher免疫型细菌的每一种第二次测定含有结合到Fisher免疫型库，但未结合到对照平板上的抗体的上清液。存在于一个孔的上清液中的抗体，20H11，只结合到铜绿假单胞菌Fisher免疫型2，6和7上。以渐减的低细胞密度反复传代培养细胞直到所有具有生长细胞的孔都开始分泌抗体为止。细胞系和单克隆抗体（Ig    M同型）在下文中均以20H11表示。

第二次转化被进行，其中B细胞来源于囊性纤维变性患者的外周血，已知患者已受铜绿假单胞菌慢性感染。如上所述制备E^-PBMC并与此转化细胞系，1A2，一起以每个E^-PBMC含72个1A2细胞的比例混合培养。将细胞混合物涂到15个圆底96孔的微滴平板中，浓度为7.4×10⁴细胞/孔并如上法培养。

在转化16天之后，用ELISA测定上清液中抗-铜绿假单胞菌抗体的存在。如前面转化所述进行测定，所不同的是用于起始筛选的铜绿假单胞菌菌株库由Fisher免疫型参照菌株，F2，F4，F6，和F7（A.T.C.C号为27313，27315，27316，和27317）组成，还包括3株来自Genetic    Systems    Corporation    Organism    Bank（GSCOB）的分离菌，这些分离菌具有不同的LPS免疫型和鞭毛型。临床分离菌PSAI277（GSCOB）带有a型鞭毛和Fisher免疫型1    LPS;第二种分离菌PSA    G98（GSCOB）带有a型鞭毛和Fisher免疫型3LPS;第三种分离菌PSA    F625（GSCOB）带有b型鞭毛和Fisher免疫型5LPS。这种参照菌株和临床分离菌的混合物将被称作为具鞭毛的铜绿假单胞菌库。用ELISA第二次对库中各个菌株测定上清液，上清液中含有结合到含具鞭毛的铜绿假单胞菌库的平板上，但未结合到涂有PLL的对照平板上的抗体。一个孔，3Cl结合到参照菌株F2，F6，和F7以及临床分离菌F625上。

通过首先传代培养细胞来完成3Cl细胞系的克隆，低密度传代培养两次，先以96孔平板的每个孔中含20个细胞培养，再以每孔含2个细胞培养。特异抗体产生细胞的正式克隆是通过平板培养细胞进行的，在72孔的Terasaki平板（Nunc    ＃1-36538）中细胞密度约为1个细胞/孔，体积为10μl/孔，孔中装有缺少氨基蝶呤成分的HAT-培养基（HT-培养基）。将平板放在恒温箱中2-3小时使细胞沉到孔的底部，然后用含单个细胞孔中的两个个体微观划线。每天向孔中加入HT-培养基并当增生的细胞足够多时，将细胞转移到96孔的圆底平皿中。用ELISA对具有b型鞭毛的铜绿假单胞菌菌株测定有增生细胞的所有孔，发现所有孔都产生适当的抗体。细胞系和单克隆抗体（Ig    M同型）在下文均用3    Cl表示。

由20H11和3    Cl所鉴定的抗原是间接免疫荧光和免疫吸印所示的鞭毛。间接免疫荧光和免疫吸附技术基本上按实施例2和3所述方法进行。对于间接免疫荧光测定法，用实施例3所述方法制备具有b型鞭毛的铜绿假单胞菌菌株，对照Fisher免疫型F2，F6，和F7（A.T.C.C号为27313，27317，和27318）和具有a型鞭毛的菌株，对照Fisher免疫型4（A.T.C.C号为27315）。通过用鼠的单克隆抗体，Pa    F4    IVE8和FA6    IIG5定型确定对照菌株的鞭毛类型。如实施例2所述制备观察用载玻片。两种抗体的来源都是培养物上清液，并且FITC结合试剂是FITC结合山羊抗-人Ig（多价的）（Tago，Burlingame，CA），以1∶100用含有0.5%（W/V）牛γ-球蛋白（Miles    Scientific，Cat.NO.82-041-2，Naperville，IL）和0.1%（W/V）叠氮化钠（作为防腐剂）的PBS稀释。

只能在具有b型鞭毛的铜绿假单胞菌而不能在具有a型鞭毛的菌株，参照Fisher免疫型4上观察到用20H11和3C1抗体的荧光染色。观察到的荧光图谱是发源于细菌一端的正弦曲线图谱，这表明抗体结合到细菌的鞭毛上。

如实施例2所述进行免疫吸印。如实施例3所述制备纯化的b型鞭毛（来自铜绿假单胞菌参照菌株Fisher免疫型2，A.T.C.C号为27313）和纯化的a型鞭毛（来自参照菌株Habs6和Habs8、A.T.C.C号为33353和33355）。在10%聚丙烯酰胺凝胶中使抗原分离（见实施例3）并转移到NCM中。将含有20H11或3C1抗体的培养物上清液，含有非特异性人抗体的培养物上清液和培养基与NCM一起培养并用碱性磷酸酶结合山羊抗-人Ig（多价的）（Tago，Burlingam，CA）（用含有0.05%（V/V）吐温-20的PBS稀释）检测该反应。如实施例2所述制备酶底物。免疫吸印说明两种抗体都结合到Fisher免疫型2的鞭毛蛋白（分子量为53，000）上，而不结合到Habs6的鞭毛蛋白（分子量为51，700）和Habs8的鞭毛蛋白（分子量为47，200）上，用非特异性人抗体或培养基都观察不到反应。

用ELISA可获得抗体20H11和3C1只结合到b型鞭毛上而不结合到a型鞭毛上的其它证据，其中分别用PLL使Habs菌株1-12结合到Immulon96孔的微滴平板上。抗体只结合到Habs菌株2，3，4，5，7，10，11，和12上，这些菌株是具有b型鞭毛的菌株（Ansorg    et    al.，（1984）J.Clin.Microbiol.，20∶84）。

实施例7

实施例7说明结合到铜绿假单胞菌a型鞭毛上的人单克隆抗体的生产方法。

来自用高分子量多糖制剂免疫的个体的外周血样品（Pier et al.，（1981）Infect，Immun.，34∶416）作为B细胞的来源。从血液中分离出来单核细胞，然后按实施例6所述方法除去T-细胞。然后在液氮蒸汽罐中用含有10%二甲基亚砜的FCS使细胞冷冻。日后在37℃下迅速使细胞解冻，用Iscove培养基洗涤一次并重新悬浮于HAT-培养基中。E^-PBMC与1A2细胞以每个E^-PBMC含30个1A2细胞的比例混合培养完成细胞从动转化。涂到在30个96孔的组织培养平板中，平板培养浓度为62，000个细胞/孔。在平板培养后第7天用HAT培养基取代一半体积进行培养。在平板培养后第14天观察100%孔中的细胞增殖。

用具鞭毛的铜绿假单胞菌通过ELISA测定上清液中抗铜绿假单胞菌抗体的存在，以PLL处理的平板作为对照，方法如实施例6所述。在具鞭毛库的每株细菌上再次测定含有结合到鞭毛库上，而不结合到PLL对照平板上的抗体的上清液。一个孔21B8，含有结合到PSAI277，PSAG98，和参照Fisher免疫型4上的抗体，这些菌株是具鞭毛库中带有a型鞭毛的三个菌株。

按实施例6关于3    Cl细胞系所述方法，以正式的克隆步骤（做下面改动）完成21B8细胞系的克隆，在将只有单个细胞存在的Terasaki平板的孔划线后，将每个细胞从Terasaki平板转移到96孔圆底培养皿的各孔中，体积为100μl，内有缺少氨基蝶呤成分的HAT-培养基（HT-培养基）。在每个孔中都含有非转化，HAT-敏感的淋巴母细胞，密度为500个细胞/孔，它们作为喂养细胞。平板培养后5天，将100μl（HAT-培养基加到孔中选择性地杀死喂养细胞。在平板培养后的第7天和第9天用HAT-培养基取代一半上清液再加到孔中。然后用HT-培养基本培养细胞直到细胞具有足够的密度用ELISA检测抗体的存在。具有细胞增生的所有孔都产生结合到具有a型鞭毛铜绿假单胞菌菌株上的抗体。细胞系和单克隆抗体（Ig    G同型）在下文中都用21B8表示。

由21B8所鉴定的抗原是间接免疫荧光和免疫吸印（见实施例6描述的方法）所示的鞭毛。只能在具有a型鞭毛的铜绿假单胞菌参照菌株Fisher免疫型4（A.T.C.C号为27315）上而不能在具有a型鞭毛的铜绿假单胞菌参照菌株Fisher免疫型2（A.T.C.C号为27313）上观察到用21B8抗体的荧光染色。观察到的荧光图谱是发源于细菌一端的正弦曲线图谱，这表明抗体结合到细菌的鞭毛上。

如实施例2所述进行免疫吸印，如实施例3所述制备纯化的a型鞭毛（来自铜绿假单胞菌参照菌株Habs6，A.T.C.C号为33353）和纯化的b型鞭毛（来自铜绿假单胞菌参照菌株Fisher免疫型2，A.T.C.C号为27313）。在10%聚丙烯酰胺凝胶中使抗原分离（见实施例3）并转移到NCM中。使含有21B8或非特异性人抗体和培养基的培养物上清液与NCM反应并用碱性磷酸酶结合山羊抗-人Ig（多价的）和酶底物如实施例2和6所述检测该反应，免疫吸印说明21B8抗体只结合到Habs6的鞭（分子量为51，700）毛蛋白上，而不结合到Fisher免疫型2的鞭毛蛋白（分子量为53，000）上。用非特异性人抗体或培养基都观察不到反应。

实施例8

实施例8说明用人抗-鞭毛抗体，20H11，3C1和21B8被动免疫的小鼠在烧伤模型中不受铜绿假单胞菌攻击的保护作用。

在烧伤小鼠模型中试验了人抗-鞭毛单克隆抗体（见实施例4）。通过用硫酸铵（50%终浓度）沉淀由各细胞系所生成的培养物上清液来制备21B8和20H11抗体（Good    et    al.，Selected    Methods    in    Cellular    Immunology，Mishell，B.B.，and    Shiigi，S.M.eds.，W.J.Freeman    &    Co.，San    Francisco，CA，1980，279-286）。将沉淀溶解在PBS中，在4℃下对PBS透析过夜，并在给动物投药前无菌过滤。在保护性研究中用作阴性对照的抗体3    C1和非特异性抗-LPS抗体的来源是培养物上清液。作为每项研究的阳性对照，包括有适当的纯化鼠单克隆抗体，Pa    F4    IVE8或FA6    IIG5。

用于动物试验的具有a型鞭毛的菌株是临床分离菌PSAA522（GSCOB），该菌株表达Fisher免疫型1    LPS，b型鞭毛菌株是临床分离菌PSAA447（GSCOB），该菌株表达Fisher免疫型6    LPS。将人抗体0.45ml）预先与细菌（在0.05ml中大于5LD100）混合并在烧伤后立即接种。动物试验结果列在表Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ中。

表Ⅲ.在烧伤鼠模型¹中人抗a型鞭毛

单克隆抗体的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

鼠抗-鞭毛a，

FA6 IIG5³100 100 100 100 88 88 88 88 88

人抗-鞭毛a

21B8    100    100    100    100    100    100    100    100    100

人抗-鞭毛b，

20H11    100    0    0    0    0    0    0    0    0

PBS    100    25    12    12    12    12    12    12    12

1.

用大于5 LD₁₀₀的铜绿假单胞菌PSAA522焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组8只动物的小鼠存活数。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

先将纯化的抗体（0.45ml    PBS中含10μl）与细菌混合并在烧伤和攻击后焦痂下给药。

表Ⅳ.在烧伤鼠模型¹中人抗b型鞭毛

单克隆抗体的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

鼠抗-鞭毛b，

Pa F4 IVE8³100 100 100 100 100 100 100 100 100

人抗-鞭毛b，

20H11    100    100    100    100    100    100    100    100    100

人抗-鞭毛a，

21B81    100    0    0    0    0    0    0    0    0

培养基    80    0    0    0    0    0    0    0    0

1.

用大于5 LD₁₀₀的铜绿假单胞菌临床分离物PSAA447焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组5只动物的小鼠存活数。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

先将纯化的抗体（0.45ml    PBS中含10μg）与细菌混合，在烧伤和攻击后焦痂下给药。

表Ⅴ.在烧伤鼠模型¹中人抗b型鞭毛单克隆

抗体3    Cl的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

鼠抗-鞭毛b，

Pa F4 IVE8³100 100 100 100 100 100 100 100 100

人抗-鞭毛b，

3    Cl    100    100    80    80    80    80    80    80    80

非特异性抗-LPS

单克隆抗体    100    0    0    0    0    0    0    0    0

1.

用大于5LD₁₀₀的PSAA447焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组5只动物的小鼠存活数。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

在烧伤和攻击之前2小时静脉注射纯化的抗体（40μg）。

在用抗-a型鞭毛的抗体，或两种抗-b型鞭毛抗体的任一种处理，然后用相应的抗原攻击的小鼠中观察到非常明显的存活率。而88%～100%未经处理但受过攻击的小鼠，或用不匹配的抗-鞭毛单克隆抗体或非特异性抗-LPS抗体处理过的小鼠死亡。与用鼠单克隆抗体观察到的情况一样（见实施例4），人抗-鞭毛抗体特异地保护小鼠不受具有相应鞭毛型的有机体的致死攻击，即，人抗-a型鞭毛抗体对用具有a型鞭毛而非b型鞭毛的菌株攻击的小鼠，而不保护用具有a型鞭毛的有机体攻击的小鼠。

实施例9

实施例9说明人抗-鞭毛抗体20H11，3C1，和21B8与铜绿假单胞菌临床分离物的交叉反应性。

从医院和诊所获得的和从烧伤口和血液中初步分离的铜绿假单胞菌临床分离物（115）经用鼠单克隆抗体，FA6    IIG5或Pa    F4    IVE8分型（见实施例2，3，和5）鉴定为具有a型或b型鞭毛。通过与鼠单克隆抗体FA6    IIG5反应鉴定出有55株临床分离菌具有a型鞭毛，59株临床分离菌株通过与鼠单克隆抗体，Pa    F4    IVE8反应鉴定为具有b型鞭毛。

抗-a型鞭毛人单克隆抗体，21    B8的交叉反应性是广泛的，其中抗体可识别56株具有a型鞭毛的临床分离菌中的54株（96%）。20H11与具有b型鞭毛的分离菌株的交叉反应性也是广泛的，其中20H11可识别全部59株分离菌（100%）。相比之下，其它抗-b型鞭毛的单克隆抗体，3Cl，只结合到59株分离菌中的43株上（73%）。这些结果说明20H11可结合到全反应性抗原决定部位上（即，一个抗原决定部位至少存在于大约95%的具有鞭毛铜绿假单胞菌上），而3    Cl可结合到不存在于所有b型鞭毛抗原蛋白上的抗原决定部位上。即使当用多克隆抗血清分析时b型鞭毛抗原是在血清学上相同的（Lanvi，B.，见上文，和Ansorg，R.，见上文），20H11和3    C1的交叉反应性图谱还是令人惊奇地显示出b型鞭毛至少有两个可用单克隆抗体鉴定的独立抗原决定部位。

抗体21B8    20H11与铜绿假单胞菌临床分离物广泛交叉反应性表明这些抗体在铜绿假单胞菌感染的免疫治疗中的特殊的临床效用。

实施例10

实施例10说明另一种典型的人单克隆抗体的生产方法，这种单克隆抗体可结合到铜绿假单胞菌b型鞭毛上，还说明在烧伤小鼠模型中该抗体对用铜绿假单胞菌的保护活性。

按实施例7所述的方法制备并基本克隆转化细胞系，所不同的是将转化细胞混合物在20个96孔组织培养皿上平板培养，浓度为每个孔约有2250E^-PBMC。除具鞭毛库中没有Fisher免疫型2和4参照菌株外，按实施例6所述方法用ELISA最初测定上清液。然后在含有Fisher免疫型2和4的具鞭毛库中测定每个菌株的阳性孔。最分离的细胞系和单克隆抗体（Ig G同型）在下文中都以12D7表示。

12D7人单克隆抗体显示广泛的与抗-a型鞭毛分离菌的交叉反应性，该抗体可识别56株具a型鞭毛的待测临床分离菌中的54株（96%）。12D7单克隆抗体的保护活性列在表Ⅵ中。除攻击剂量为1 LD₁₀₀和攻击菌株是I624，表达Fisher免疫型2 LPS和a型鞭毛的临床分离菌外，基本上按实施例4所述方法进行保护性研究。

表Ⅵ.在烧伤鼠模型¹中人抗-a型鞭毛

单克隆抗体的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

人抗-鞭毛a，

12D7    100    100    100    100    100    100    100    100    100

人抗-Fisher2LPS

2H9    90    90    90    90    90    90    90    90    90

鼠抗-鞭毛a

IIG5    100    100    100    100    100    100    100    100    100

人抗-鞭毛b

15F4    100    37.5    25    25    25    25    25    25    25

1.

用1 LD₁₀₀（950CFU）的铜绿假单胞菌I624焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组10只动物的小鼠存活数。15F4组;例外，N＝8。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

在烧伤和攻击之前2小时腹腔内注射纯化的抗体（0.5ml    PBS中含50μg）。

实施例11

实施例11说明可与b型鞭毛铜绿假单胞菌反应的人单克隆抗体的生产方法和烧伤小鼠模型中用该抗体被动免疫的小鼠不受铜绿假单胞菌攻击的保护作用。

除1A2与B细胞转化率约为60∶1和在15个平板上以大约每孔含1930个E    PBMC的浓度平板培养转化细胞混合物外，基本上按实施例10所述的方法准备和克隆转化细胞系。同样，在包括G98Fisher    3免疫型，a型鞭毛）和I739（Fisher    5免疫型的临床分离物，b型鞭毛）的铜绿假单胞菌中测定这些细胞，并在不同的铜绿假单胞菌菌株库中进一步证实：I277，G98，I739和Fisher免疫型F2，F4，F6和F7。最后分离的细胞系和分泌的单克隆抗体在下文中以2    B8表示。

对于b型鞭毛，Fisher    2免疫型菌株，用2    B8所进行的免疫荧光测定是阳性的，而在a型鞭毛，Fisher免疫型4参照菌株中则为阴性。试验了59株具b型鞭毛的临床分离菌均呈阳性（100%）。

2    B8的保护活性列于表Ⅶ中。保护性研究按实例10中所述的方法进行，仅是用于攻击的临床分离物为F164（Fisher免疫型4，b型鞭毛）。

表Ⅶ.在烧伤鼠模型¹中人抗b型鞭毛抗体-

单克隆抗体2    B8的保护性研究

每天存活百分数²

处理    1    2    3    4    5    6    7    8    9

人抗-鞭毛b，

2 B8³100 89 89 89 89 89 89 89 89

鼠抗-鞭毛b，

Pa F4 IVE8⁴100 100 100 100 100 100 90 90 90

鼠抗-Fisher    2    LPS

VH3⁴90 20 20 20 20 20 20 20 20

1.

用1    LD（105CFU）的铜绿假单胞菌F164焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组10只动物的小鼠存活数。2    B8组例外.N＝9。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

在烧伤和攻击之前2小时静脉注射纯化抗体（在0.5ml    PBS中含50μg）。

4

在烧伤和攻击之前2小时腹腔内注射纯化抗体（在0.5ml    PBS中含5μg）。

实施例12

实施例12说明另一种可与b型鞭毛铜绿假单胞菌反应的人单克隆抗体的生产方法和在烧伤小鼠模型中用该抗体被动免疫的小鼠不受铜绿假单胞菌攻击的保护作用。

基本按实施例7所述方法制备和克隆转化细胞系，有下列例外。使不同的个体免疫（Pier et al.，（1984）45：309）并作为B细胞来源，E^-PBMC的平板培养水平约为2000个细胞/孔。对Fisher 1-7免疫型库进行筛选。最后分离的细胞系和分泌的单克隆抗体（Ig G1同型）在下文中均用为14Cl表示。

在临床试验中，用14Cl试验了59株具b型鞭毛的分离物均呈阳性（100%）。如上面实施例11所述进行保护研究并列于表Ⅷ中。

表Ⅷ.在烧伤小鼠模型¹中人抗b型鞭毛抗体-

单克隆抗体14Cl的保护性研究

每天存活百分数²

处理³1 2 3 4 5 6 7 8 9

人抗-鞭毛b，

14Cl    100    100    100    100    100    90    90    90    90

鼠抗-鞭毛b，

Pa    F4    IVE8    100    100    100    100    100    100    100    100    100

人抗-Fisher    2LPS

VH3    100    40    20    20    20    20    20    20    20

1.

用大于1 LD₁₀₀（90CFU）的铜绿假单胞菌F164焦痂下攻击小鼠。

2.

存活百分数基于每组10只动物的小鼠存活数。Pa    F4    IVE8组除外，N＝9。天数是指烧伤和攻击后的天数。

3.

在烧伤和攻击之前2小时静脉注射纯化抗体（在0.5ml    PBS中含50μg）。

综上所述，可以看出本发明的细胞系提供生产可与铜绿假单胞菌鞭毛反应和对各种铜绿假单胞菌菌株具有交叉保护性的单克隆抗体及其片段的方法。令人惊奇的是，分离出许多可与各种鞭毛型上的不同抗原决定部位反应的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可使预防和治疗组合物更经济和易于生产，该抗体可用于防止由多数铜绿假单胞菌菌株引起的感染。另外，该细胞系提供用于免疫测定和其它已知方法的抗体。

虽然通过说明和实施例较为详尽地描述了本发明，但是显然在权利要求书范围内可进行某行变化和修改。

Claims (38)

1、一种组合物，它含有能够特异性地与铜绿假单胞菌鞭毛反应的单克隆抗体或其结合片段。

2、根据权利要求1的组合物，其中的单克隆抗体或其结合片段抑制细菌的游动性。

3、根据权利要求1的组合物，其中的单克隆抗体或其结合片段在活体内是保护性的。

4、一种组合物，它含有能与铜绿假单胞菌鞭毛蛋白抗原决定簇特异反应的单克隆抗体。

5、根据权利要求4的组合物，其中的单克隆抗体是能够封闭与ATCC  HB9129，HB9130，CRL9300，CRL9301，CRL9422，CRL9423和CRL9424各号细胞株所产生的单克隆抗体的抗原决定簇的结合。

6、一种组合物，它包括一种或一种以上的单克隆抗体，其中所述的第一种单克隆抗体是能与铜绿假单胞菌a型或b型鞭毛的抗原决定簇相反应的。

7、根据权利要求6的组合物，其中所述的第二种单克隆抗体能与铜绿假单胞菌a型鞭毛反应但不与所述第一种单克隆抗体反应。

8、根据权利要求6所述的组合物，其中所述的第一种单克隆抗体是人单克隆抗体。

9、根据权利要求6所述的组合物，其中所述单克隆抗体中的至少一种是在体内为保护性的。

10、根据权利要求1、4、6和8中任何一项所述的组合物，它还包括从人血浆中获得的γ-球蛋白组分和（或）抗生素。

11、一种药用组合物，它包括权利要求1、4、6和8中任何一项所述的组合物以及药理上可接受的载体。

12、一种用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染的药用组合物，所述组合物包括与铜绿假单胞菌鞭毛蛋白反应并在体内为保护性的单克隆抗体，抗微生物剂，从人血浆中获得的γ-球蛋白以及药理上可接受的载体。

13、根据权利要求12所述的药用组合物，其中所述的抗体是人单克隆抗体，从人血浆中获得的γ-球蛋白组分取自于那些显示出对铜绿假单胞菌为反应性的免疫球蛋白的水平增高了的人中和（或）其产物中。

14、一种药用组合物，它包括至少两种单克隆抗体，每种所述抗体都能特异性地与某种铜绿假单胞菌鞭毛蛋白反应并能预防或治疗铜绿假单胞菌感染。

15、根据权利要求14所述的组合物，其中至少有一种单克隆抗体是人单克隆抗体。

16、根据权利要求14所述的组合物，它进一步包括至少一种能与至少一种铜绿假单胞菌脂多糖分子上血清型抗原决定簇相反应的人单克隆抗体和（或）与内毒素A反应的单克隆抗体。

17、一种治疗被怀疑患有菌血症和（或）败血病患者的方法，它包括：

给所述患者施用预防量或治疗量的根据权利要求1，6，8，12，14和15中任何一项所述的组合物。

18、一种细胞株，它产生能与铜绿假单胞菌a型或b型鞭毛特异性反应的单克隆抗体。

19、根据权利要求18所述的细胞株，其中所述的单克隆抗体在体内能防御抵抗铜绿假单胞菌。

20、根据权利要求19的细胞株，它是杂交细胞株。

21、根据权利要求18的细胞株，它产生人单克隆抗体。

22、根据权利要求18的细胞株，它是ATCC序列号HB9129，HB9130，CRL9300和CRL9301中的任何一种。

23、一种生产能与铜绿假单胞菌鞭毛蛋白特异反应并能治疗和预防铜绿假单胞菌感染的单克隆抗体的方法，它包括：培养至少一种权利要求22所述的细胞株并回收所述抗体。

24、一种治疗怀疑患有菌血症和（或）败血症患者的方法，它包括：

给所述患者施以预防剂量或治疗剂量的依权利要求23所产生的单克隆抗体。

25、一种能与抗原决定簇反应的单克隆抗体或其片段，所述抗原决定簇能与依权利要求23所述生产的单克隆抗体相结合。

26、一种组合物，它包括与抗原决定簇反应的单克隆抗体或其片段，所述的抗原决定簇与依权利要求23所述生产的单克隆抗体相结合。

27、一种组合物，它包括能与存在于铜绿假单胞菌鞭毛上的抗原决定簇起特异性反应的人单克隆抗体。

28、根据权利要求26所述的组合物，其中的抗原决定簇存在于a型或b型上，但不是两者均有。

29、根据权利要求26所述的组合物，其中的抗原决定簇表现在至少70%b型鞭毛上。

30、根据权利要求26所述的组合物，其中所述的抗原决定簇仅表现在b型鞭毛上。

31、根据权利要求29所述的组合物，其中所述的抗体是泛-反应性抗体。

32、一种治疗怀疑患有细菌侵染患者的方法，它包括：

给所述患者施用预防剂量或治疗剂量的能与铜绿假单胞菌鞭毛结合的单克隆抗体，并结合给以一种以上下述物质：治疗剂量或预防剂量的能与铜绿假单胞菌内毒素A反应的单克隆抗体;能与铜绿假单胞菌脂多糖分子至少一种血清型抗原决定簇反应的单克隆抗体;来自人血浆的γ-球蛋白;从与铜绿假单胞菌反应的免疫球蛋白的水平显示出被增高的患者的血浆中得到的γ-球蛋白组分和（或）其产物;抗菌剂。

33、一种单克隆抗体组合物，它具有与被称作FA6  IIG5，Pa3  IVC2，Pa  F4  IVE8，20H11，21  B8的各单克隆抗体中的任何一种相同的结合特异性。

34、根据权利要求32的单克隆抗体，它共轭有能提供可检测信号的标记物。

35、根据权利要求33的单克隆抗体，其中的标记物是荧光物质或酶。

36、一种检测样品中铜绿假单胞菌的方法，该方法包括将所述样品和与铜绿单胞菌鞭毛反应的单克隆抗体相结合，并且测定复合物的形成。

37、一种用于检测铜绿假单胞菌的诊断试验药盒，它包括含至少一种单克隆抗体的单克隆抗体组合物，其中所述的抗体与所述细菌的一种类型的鞭毛蛋白反应，提供可检测信号的标记物，它与所述抗体共价结合，或结合于与所述单克隆抗体反应的第二种抗体。